Zwei der insgesamt sieben untersuchten konventionellen RT-PCR-Protokolle, bei denen eine Auswertung im Agarose-Gel erfolgte, sind für die CSFV-Diagnostik geeignet. Sie sind spezifisch und haben eine ausreichende Sensitivität für alle Ausgangsmaterialien.
Die Auswertung dieser beiden Protokolle gelang auch mit SYBR Green™ auf einem real-time PCR-Gerät, bei gleicher Spezifität und gleicher bzw. erhöhter Sensitivität. Die SYBR Green™ real-time Auswertung hat gegenüber der konventionellen Auswertung viele Vorteile.
So ist sie weniger arbeits- und zeitaufwendig und hat ein reduziertes Kontaminationsrisiko sowohl für die Proben als auch für das Labor. Sie ist daher der konventionellen Auswertung vorzuziehen.
Bei den hier untersuchten TaqMan real-time RT-PCR-Protokollen wurde von nested Protokollen abgesehen und lediglich einfache Protokolle durchgeführt. Auch diese Protokolle waren ausreichend sensitiv und spezifisch für die CSFV-Diagnostik. Die TaqMan real-time RT-PCR-Protokolle waren gegenüber den beiden RT-PCRs, die in der Agarose-Gelelektrophorese oder in der real-time Auswertung mit SYBR Green™ ausgewertet wurden, sensitiver und mit weniger Zeitaufwand verbunden. Das TaqMan one-tube/two-enzyme real-time Protokoll ist dem two-tube/two-enzyme Protokoll aufgrund eines weiter reduzierten Kontaminationsrisikos, sowie reduziertem Arbeits- und Zeitaufwand vorzuziehen.
Sowohl die zwei konventionellen PCR-Protokolle, als auch die real-time RT-PCR-Protokolle wurden auf ihre Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit untersucht.
Die Stufe 2 der Validierung nach dem Schema der OIE ist damit abgeschlossen. In der nun folgenden Stufe 3 des Validierungsprozesses ist geplant, die Protokolle in praxi parallel zum Goldstandard (Virusisolierung in Zellkultur) einzusetzen und die Ergebnisse miteinander zu vergleichen. Dafür soll Probenmaterial sowohl infizierter als auch nicht infizierter Tiere verwendet werden. Um eine möglichst präzise und sichere Aussage machen zu können,
5 Diskussion 136
sollten 1000 Proben, bei schwieriger Beschaffungsmöglichkeit der Proben, mindestens 300 Proben getestet werden (ANON. 2000).
6 Zusammenfassung
Evaluierung konventioneller und real-time RT-PCR-Protokolle für die spezifische Diagnose des Virus der Klassischen Schweinepest
Dennis Axel Bente
Die Klassische Schweinepest (CSF) ist weltweit die wirtschaftlich wichtigste virale Infektionskrankheit des Schweins. Auslöser der Krankheit ist das Virus der Klassischen Schweinepest (CSFV), ein RNA-Virus, das zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae gehört. Die Bekämpfung der CSF hat innerhalb der Europäischen Union veterinärpolitisch und ökonomisch oberste Bedeutung und beruht auf einer schnellen Diagnosestellung und der anschließenden Keulung der Tiere. Die Manifestation des Krankheitsbildes ist oft vielseitig und erschwert so die klinisch-pathologische Verdachtsdiagnose. Eine virologische Diagnostik ist daher unumgänglich. Die von der OIE vorgegebenen Tests zur Diagnosestellung zeigen zum Teil Schwächen in Spezifität und Sensitivität oder sind sehr zeitaufwendig. Neuere Entwicklungen nutzen die RT-PCR als diagnostisches Instrument. Trotz einer Vielzahl von verfügbaren Protokollen ist die Methodik unzureichend validiert. Ziel dieser Arbeit war es zu validieren, ob und wie weit die konventionelle RT-PCR (Auswertung in der Agarose-Gelelektrophorese) bzw. die real-time RT-PCR für den schnellen Nachweis des CSFV einsetzbar ist.
Eine Literaturrecherche in Medline erbrachte 57 konventionelle RT-PCR-Protokolle und zwei TaqMan real-time RT-PCR-Protokolle. Bei nur fünf der konventionellen RT-PCR-Protokolle wurde die spezifische Amplifikation eines CSFV-Genomfragmentes durch spezifische Primer erlangt. Zusätzlich zu den fünf wurden noch zwei RT-PCR-Protokolle mit in die Untersuchung einbezogen, die nicht für die Diagnostik sondern für die Genotypisierung entwickelt worden waren. Zwei der sieben RT-PCRs stellten sich als nicht CSFV-spezifisch heraus und sind daher für die spezifische CSFV-Diagnostik nicht geeignet. Drei der verbleibenden fünf RT-PCRs detektierten nicht alle untersuchten CSFV-Isolate, was auf eine geringe Sensitivität der RT-PCRs zurückzuführen war. Auch diese Protokolle sind für eine Diagnostik, z.B. bei Organproben mit geringem Virusgehalt, nur eingeschränkt geeignet. Die zwei verbleibenden Protokolle zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus und sind für eine spezifische CSFV-Diagnostik geeignet. Überraschenderweise war eines dieser beiden Protokolle ein RT-PCR-Protokoll, das nicht für die Diagnostik, sondern für die genetische Typisierung entwickelt worden war. Bei Untersuchung von Organproben traten bei dieser RT-PCR allerdings unspezifische Banden auf, die eine klare Beurteilung der Ergebnisse erschwerten.
6 Zusammenfassung 138
Durch das Entfallen einer Post-PCR-Analyse sind real-time RT-PCR-Protokolle der Auswertung in Agarose-Gelen in Bezug auf Arbeitsaufwand, Zeitaufwand und Kontaminationsrisiko überlegen. Eine SYBR Green™ real-time Auswertung der zwei validierten konventionellen RT-PCRs wurde etabliert. Neben dem reduzierten Zeitaufwand bot die SYBR Green™ real-time Auswertung auch eine höhere Sensitivität als die konventionelle Auswertung im Agarose-Gel.
Ein früher beschriebenes nested real-time RT-PCR-Protokoll, das mittels einer TaqMan-Sonde in einem real-time Gerät ausgewertet wurde, wurde verändert und neu etabliert. Es wurde sowohl ein two-tube/two-enzyme als auch ein one-tube/two-enzyme Protokoll entwickelt; beide benötigen nur ein Primerpaar. Die beiden real-time RT-PCRs sind für die spezifische CSF-Diagnostik ausreichend spezifisch und sensitiv. Die Sensitivität wurde des Weiteren mittels rekombinanter RNA- bzw. DNA-Standards bestimmt.
Die Untersuchungen zeigten ferner, dass die eingesetzte Menge an Probenmaterial und die Nukleinsäure-Isolierung einen entscheidenden Einfluss auf die Sensitivität haben. In der Praxis sollten daher eine Reihe von positiven und negativen Kontrollen mituntersucht werden.
7 Summary
Evaluation of conventional and real-time RT-PCR protocols for the specific detection of classical wine fever virus.
Dennis Axel Bente
Classical swine fever (CSF) is the economically most important viral disease of domestic pigs world wide. The causative agent is the classical swine fever virus (CSFV), an RNA-virus, belonging to the genus pestivirus within the family Flaviviridae. The control of CSF has a high priority within the European Union, as CSF keeps recurring sporadically. In case of an outbreak a rapid diagnosis is necessary, and followed by the culling of the animals. The clinical picture of the disease is highly variable, and sometimes hampers correct clinical-pathological diagnosis. As a consequence, a virological diagnosis is of vital importance. The virological tests implemented by the OIE either lack of specificity and sensitivity or are time consuming. In the last years, RT-PCR protocols were found to be sensitive and specific also for CSFV diagnosis. As a consequence, numerous protocols have been published but not yet validated. The aim of this study was to evaluate whether and if the conventional RT-PCR (evaluated by agarose gel electrophoresis) and real-time RT-PCR are suitable for the rapid and reliable detection of CSFV.
A literature survey in Medline revealed 57 conventional RT-PCR protocols and two real-time RT-PCR protocols. Interestingly, only five of the conventional protocols used CSFV-specific-primers for the specific detection of CSFV. These protocols were evaluated. In addition, two RT-PCR protocols suggested for genetic typing of CSFV genomes were also included in the study. Two of the seven protocols were not CSFV-specific. Hence, they are not suitable for specific CSFV diagnosis. Three of the remaining five RT-PCR protocols could not detect all tested CSFV isolates. The failure of these three RT-PCRs to detect some of the CSFV isolates was found to be due to low sensitivity rather than to the specificity of the primers. They were considered not to be suitable for diagnosis of CSFV, especially when samples with low virus titers are considered. The two remaining protocols were highly sensitive, specific and consequently suitable for a correct and specific CSFV diagnosis. Surprisingly, one of these two protocols was developed for genetic typing and not for diagnostic purposes.
Unfortunately, unspecific bands hamper the correct interpretation of the results when organ samples are analysed.
Due to the lack of a post PCR analysis real-time RT-PCR protocols are less time consuming, less labourious and have a lower risk of sample and laboratory contamination. The two conventional RT-PCR protocols were adapted to SYBR Green™ evaluation in a real-time PCR machine. These protocols were faster and had increased sensitivity when compared to the conventional agarose gel electrophoresis evaluation.
7 Summary 140
A real-time nested RT-PCR protocol which uses a TaqMan probe in real-time PCR which has been described recently was modified. Two new protocols were developed, namely two-tube/two-enzyme and one-two-tube/two-enzyme TaqMan real-time RT-PCR using only one primer pair. Both protocols were appropriate for the diagnosis of CSFV, as they were highly sensitive and specific. In addition sensitivity was also determined with a recombinant RNA and DNA standard, which allowed quantification of the number of viral genome copies.
It can be concluded that the amount of sample used in the RT-PCR and the effectivity of the nucleic acid isolation have a crucial influence on the sensitivity of the RT-PCRs. Therefore it is necessary to include appropriate negative and (weak) positive controls in every RT-PCR.
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