TaqMan real-time RT-PCR

3.2.8.1 One-tube/one-enzyme nested Protokoll

Für die one-tube/one-enzyme nested RT-PCR wurde das Protokoll von MCGOLDRICK (1998) als Grundlage genommen. Das Protokoll hatte zwei Schritte. Im ersten Schritt wurde die RNA zuerst in einem one-tube/one-enzyme PCR-Protokoll mittels Tth-Polymerase in cDNA umgeschrieben und danach unmittelbar in einer PCR amplifiziert. Beide Reaktionen wurden in einem Gefäß durchgeführt. Dafür wurden die Primer 324 und 326 (9.5.1.7) verwendet, die ein Fragment mit der Länge von 288 bp des CSFV-Genoms eingrenzen. In einem zweiten Schritt wurde dann das Erstrundenamplifikat in eine einfache PCR mit den Primern A11 und A14 (Fragmentlänge 210 bp; 9.5.1.9) eingesetzt. Beiden PCRs wurden eine CSFV-spezifische TaqMan-Sonde (Reporterfarbstoff FAM, Quencherfarbstoff: TAMRA; vgl.

9.5.5.2) zugegeben und die Reaktionen im real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE;

9.7, 9.8) ausgewertet.

Bevor der eigentliche Mastermix der real-time PCR angesetzt wurde, erfolgte zunächst eine 1:200 Verdünnung des Referenzfarbstoffes ROX (9.2.1; Ausgangskonzentration 1 mM). Dazu wurden 179 µl DNase- und RNase freies Wasser mit 20 µl des 10fach konzentrierten

9 Annealingtemperatur für Protokoll 2

10 Annealingtemperatur für Protokoll 6

3 Eigene Untersuchungen 82

PCR-Puffers® (9.2.1) und 1 µl des Referenzfarbstoffs ROX gemischt (Konzentration dann 5 µM) und in ein lichtgeschütztes 1,5 µl Reaktionsgefäß (9.6.2) überführt.

Für den RT-Schritt und die erste Runde der PCR (in einem Gefäß) wurden in einem 0,5 µl real-time Reaktionsgefäß 1 µl, der aus Zellkultur isolierten RNA mit 1,25 U Tth-Polymerase, 3 mM MgCl2, 0,5 mM MnSO4, 5 µl eines PCR Enhancers (9.2.1), 100 nmol der CSFV-spezifischen TaqMan-Sonde, 75 nM des Referenzfarbstoffs ROX, sowie 425 nM an dNTPs und je 20 pmol der Primer 324 und 326 in einem Gesamtvolumen von 50 µl vorsichtig gemischt. Das Reaktionsgefäß wurde in das real-time PCR Gerät Mx 4000 (9.7) überführt und folgendes Programm gestartet:

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

70 °C 15 min 1

95 °C 1 min 56 °C 1 min 72 °C 1 min

40

Der Verlauf der Reaktion konnte am Computer beobachtet werden (siehe 3.2.9.2).

Im zweiten Schritt der PCR, wurden 1 µl des Amplifikates der ersten Runde mit 5 µl des Core-PCR-Puffers® (9.2.1), 0,4 mM dNTPs, 3 mM MgCl2, 25 pmol der Primer A11 und A14, 100 nmol der CSFV-spezifischen TaqMan-Sonde, 1,25 U der Taq-Polymerase und 75 nM des Referenzfarbstoffs ROX gemischt. Der Ansatz wurde unter Vermeidung von Blasenbildung in ein real-time PCR-Reagtionsgefäß mit einem Volumen von 0,5 ml überführt und folgendes Programm gestartet:

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

95 °C 10 min 1

95 °C 30 sec 60 °C 1 min 72 °C 1 min

40

Während des Programms erfolgte die Auswertung (siehe 3.2.9.2).

One-tube/one-enzyme

* : one-tube/one-enzyme RT-PCR (Tth-Polymerase)

** : Zweite PCR mit Taq-Polymerase

*** : 1. + 2. PCR = nested Protokoll

* : one-tube/one-enzyme RT-PCR (Tth-Polymerase)

** : Zweite PCR mit Taq-Polymerase

*** : 1. + 2. PCR = nested Protokoll

Abbildung 3-2: Übersicht über die verwendeten TaqMan-Protokolle

3.2.8.2 Two-tube/two-enzyme Protokoll

Dieses Protokoll stellt eine Modifikation des veröffentlichten real-time two-tube/two-enzyme PCR-Protokolls dar (MCGOLDRICK et al. 1999). Die verwendeten Primer A11 und A14 grenzen ein Fragment mit einer Länge von 210 bp im 5`NTR von Pestiviren ein.

Das two-tube/two-enzyme Protokoll beinhaltete zwei separate Schritte: Die Reverse Transkription und die eigentliche real-time PCR, die beide in separaten Reaktionsgefäßen durchgeführt wurden.

Der RT-Schritt erfolgte nach einem laboreigenen optimierten Protokoll (GREISER-WILKE 1998) in einem 40 µl Reaktionsansatz in 0,5 ml-Reaktionsgefäßen. Dafür wurden als Mastermix-1 6 µl der eluierten RNA mit 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs und sterilem Wasser in einem Gesamtvolumen von 32 µl gemischt und bei 70 °C für 5 min inkubiert und danach sofort wieder in ein Eisbad gestellt. Nach dem Abkühlen wurde der Mastermix-1 mit 8 µl des Mastermix-2 gemischt, der aus 0,1 mM DTT, 0,4 µg Hexamere, 0,5 µl RNase Inhibitor (9.2.1) sowie 80 U Reverse Transkriptase (9.2.1) bestand. Die letztgenannten Komponenten wurden während der Inkubationszeit als

3 Eigene Untersuchungen 84

Mastermix-2 vorgemischt. Die Inkubation der Probe im Thermocycler erfolgte nach dem folgenden Thermoprofil:

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

22 °C 5 min 1

37 °C 15 min 1

42 °C 30 min 1

99 °C 5 min 1

4 °C ∞ 1

Bis zur Entnahme aus dem Gerät erfolgte eine Kühlung der Ansätze im Thermocycler bei 4 °C. Erfolgte kein unmittelbarer Einsatz der cDNA, wurden diese bei -20 °C bis zum Gebrauch gelagert.

Bevor der PCR-Mastermix angesetzt wurde, erfolgte zunächst vor jedem Lauf eine 1:200 Verdünnung des Referenzfarbstoffes ROX (Ausgangskonzentration 1 mM). Dazu wurden 179 µl DNase- und RNase freies Wasser mit 20 µl des 10fach konzentrierten Core-PCR-Puffers©

und 1 µl des Referenzfarbstoffs ROX gemischt (Endkonzentration 5 µM) und in ein lichtgeschütztes 1,5 µl Reaktionsgefäß überführt (9.2.1, 9.6.2).

Für den PCR-Ansatz mit einem Reaktionsvolumen von 50 µl wurden 6 µl der vorher synthetisierten cDNA in einem 0,5 µl Reaktionsgefäß unter Vermeidung von Blasenbildung mit 5 µl des Core-PCR-Puffer®, 0,8 mM dNTPs, 3 mM MgCl2, 25 pmol der Primer A11 und A14, 100 nmol der CSFV-spezifischen TaqMan-Sonde, 1,25 U der Taq-Polymerase sowie 75 nM des Referenzfarbstoffs ROX gemischt (9.2.1, 9.2.2). Der Ansatz wurde unter Vermeidung von Blasenbildung in ein optisches real-time PCR-Reaktionsgefäß mit einem Volumen von 0,5 ml überführt. Das Reaktionsgefäß wurde in das real-time PCR-System Mx 4000™ (9.7) gestellt und folgendes Programm gestartet:

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

95 °C 10 min 1

95 °C 15 sec

60 °C 1 min 40

Während des Programms erfolgte die Auswertung (siehe 3.2.9.2).

3.2.8.3 One-tube/two-enzyme Protokoll

Bei dem one-tube/two-enzyme Protokoll erfolgten die Reverse Transkription und die eigentliche PCR-Reaktion direkt aufeinander folgend, ohne dass das Reaktionsgefäß zwischen den beiden Schritten nochmals geöffnet werden musste. Alle Reaktionskomponenten für beide Reaktionen wurden zu Beginn gemischt. Bei diesem Protokoll wurden ebenfalls die Primer A11 und A14 sowie die CSFV-spezifische TaqMan-Sonde (MCGOLDRICK et al.

1998) verwendet.

Für den Reaktionsansatz von 50 µl wurden in einem 0,5 ml Reaktionsgefäß 3 µl RNA aus der Isolierung mit 5 µl des 10fach konzentrierten Core-RT-Puffers© (STRATAGENE), 0,4 mM dNTPs, 3,5 mM MgCl2, 25 pmol des Primers A11, 35 pmol des Primers A14, 75 nmol des Referenzfarbstoffs ROX, 100 nmol der CSFV-spezifischen TaqMan-Sonde, 2,5 U Taq-Polymerase sowie 1,25 U M-MLV Reverse Transkriptase (STRATASCRIPT; Fa.

STRATAGENE) gemischt. Die Reverse Transkriptase mit einer Ausgangskonzentration von 20 U/µl wurde jeweils vor Ansatz des Mastermixes 1:16 in einfach konzentriertem Core-RT-Puffer© verdünnt. Der Reaktionsansatz wurde dann unter Vermeidung von Blasenbildung in ein real-time PCR-Reaktionsgefäß mit einem Volumen von 0,5 ml überführt. Das Reaktionsgefäß wurde in das real-time PCR-System Mx 4000™ (8.9) überführt und folgendes Programm gestartet:

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

45 °C 30 min 1

95 °C 10 min 1

95 °C 15 sec

60 °C 1 min 40

Während des Programms erfolgte die Auswertung (siehe 3.2.9.2).