Quantifizierung

Die Quantitative PCR kann für verschiedene Anwendungen genutzt werden, wie z.B. das Monitoring der Genexpression oder die Bestimmung der Viruslast im Rahmen von

Pathogenesestudien (BUSTIN 2000, FREEMAN et al. 1999, HALFORD 1999, HEID et al.

1996).

Das Prinzip der Quantifizierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäure mittels real-time RT-PCR unterscheidet sich grundlegend von der Quantifizierung mit Hilfe einer konventionellen RT-PCR, da hier nicht die absolute Menge an PCR-Produkt, das bis zum Ende der Reaktion entsteht, gemessen wird. Bei der QRT-PCR wird der CT-Wert genutzt. Der CT-Wert verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge an Nukleinsäure (HIGUCHI et al. 1993). Rein theoretisch könnte anhand des CT-Wertes auf die ursprüngliche Matrizenmenge zurückgeschlossen werden, wenn gleichzeitig die Vermehrungsrate der PCR bekannt wäre. Die Amplifikation eines bestimmten Fragments wird aber von vielen Faktoren beeinflusst, so dass es nicht möglich ist, die genaue Vermehrungsrate einer Reaktion zu ermitteln (BUSTIN 2000). Es ist daher einfacher, parallel zu den zu untersuchenden Proben, Proben mit bekannter Menge in Form eines Standards zu amplifizieren und die so ermittelten CT-Werte miteinander zu vergleichen. Die Quantifizierung kann relativ oder absolut erfolgen.

Sie unterscheidet sich in einem unterschiedlichen Prinzip des verwendeten Standards.

2.3.8.1 Relative Quantifizierung

Die relative Quantifizierung ist die häufiger genutzte Methode. Sie erfasst die Veränderungen in einem im Gleichgewicht befindlichen System und stellt für Genexpressionsstudien eine adäquate Quantifizierungsmethode dar. Bei dieser Quantifizierung handelt es sich um die Bestimmung des Verhältnisses der Menge an RNA/DNA in der zu untersuchenden Probe 1 zu der Menge RNA/DNA in einer bekannter Probe 2. Für die Bestimmung muss weder die Konzentration der Zielsequenz bekannt sein, noch eine Standardkurve mit bekannter Konzentration erstellt werden, da nur ein Verhältnis beider Proben zueinander berechnet wird (BUSTIN 2000; LIVAK u. SCHUTTEN 2001). Die unbekannte Menge der Zielsequenz wird semiquantitativ, d.h. bezogen auf das Signal der zweiten Sequenz, abgeschätzt.

Grundsätzlich gibt es zwei Arten der Berechnung der relativen Menge: Die Standardkurven-Methode und die ∆∆Ct-Standardkurven-Methode (LIVAK u. SCHUTTEN 2001).

Beide Berechnungsmethoden benötigen neben der eigentlichen Zielsequenz auch eine

„endogene Kontrolle“ (Referenzgen), die mit amplifiziert wird. Diese endogene Kontrolle wird als Housekeeping Gene bezeichnet. Es ist eine aktive Referenz –eine Normalisierung- womit die Menge an Ziel-RNA im Verhältnis zu der insgesamt in der Probe vorhandenen RNA gesetzt wird. Als endogene Kontrolle sollten Gene verwendet werden, die ubiquitär und in einer konstanten Menge in den verwendeten Zellen vorkommen wie z.B. 18s rRNA, GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) oder β-Aktin. Sie sollten unter den verschieden experimentellen Bedingungen immer konstant exprimiert werden. Da 18s rRNA keinen Poly-A-Schwanz besitzt, kann sie nicht als endogene Kontrolle für eine RT-PCR eingesetzt werden, bei der Oligo-dTs für den Schritt der Reversen Transkription verwendet werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass es zu einer unterschiedlichen Expression von Housekeeping Genen in Zellen kommen kann (BUSTIN 2000). Die Verwendung z.B. von

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GAPDH ist daher kritisch zu sehen. β-Aktin stellt womöglich eine bessere Alternative dar.

Vorab sollte immer evaluiert werden, wie hoch die Genexpression der gewählten endogenen Kontrolle in den verwendeten Zellen ist. Die erste Möglichkeit besteht darin, die zu untersuchende Probe aufzuteilen und die endogene Kontrolle und die Zielsequenz in zwei getrennten Reaktionsgefäßen auszuwerten. Die zweite Möglichkeit ist, das Housekeeping Gen und die Zielsequenz im selben Reaktionsgefäß zu messen. Man nennt dies Multiplex-Reaktion. Die Verwendung von Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, erlaubt es prinzipiell, mehrere Fragmente in dem gleichen Reaktionsgefäß zu messen.

Die Normalisierung der gemessenen Daten durch das Verhältnis zur endogenen Kontrolle verhindert Fehler, die auf gering veränderten PCR-Effektivitäten oder verschiedenen Ausgangskonzentrationen basieren.

1. Die Berechnung über eine Standardkurven-Methode:

Neben den zu untersuchenden Proben werden in der real-time PCR serielle Verdünnungen eines Housekeeping Gens und eines der Zielsequenz ähnlichen Standards zur Bestimmung der PCR-Effizienz mit analysiert. Genaue Konzentrationen müssen nicht bekannt sein. Ist die Effizienz der PCR-Reaktion von Standard und Housekeeping Gen gleich, so ist es ausreichend, für die weiteren Berechnungen nur die Standardkurve des Housekeeping Gens heranzuziehen. Im zweiten Schritt werden die CT-Werte für die zu untersuchenden Proben 1 und 2 gegen die ermittelten Housekeeping Gen-CT-Werte „normalisiert“. Im letzten Schritt wird der resultierende niedrigere Wert als Kalibrator festgesetzt und gleich 1 gesetzt. So ergibt sich eine Relation beider Proben zu einander.

2. Alternativ können die CT-Werte miteinander verglichen werden; eine Standardkurve ist nicht nötig. Dies wird als ∆∆Ct-Methode bezeichnet (LIVAK u. SCHUTTEN 2001).

Grundlage hierfür ist eine gleiche Effizienz der Housekeeping Gen-PCR und der Zielsequenz-PCR. Die Formel für die Berechnung lautet:

2.3.8.2 Absolute Quantifizierung

Die absolute Quantifizierung sollte eine präzise Bestimmung der Kopienanzahl pro Zelle, der gesamten Nukleinsäurekonzentration oder die Bestimmung der Viruslast erlauben. Dazu muss bei jedem Lauf eine Standardkurve erstellt werden. Zur Standardkurvenerstellung wird eine Verdünnungsreihe eines Standards mit bekannten Konzentrationen benötigt.

∆∆CT = ∆Ctq – ∆Ctcb

∆Ctq = CtX - CtR ;Normalisierter CT für die Probe

∆Ctq = CtX - CtR ; Normalisierter CT für den Kalibrator CtX = CT der Zielsequenz der entsprechenden Probe CtR = CT der Referenz der entsprechenden Probe

2^-∆∆Ct

10¹ 10² 10³ 10⁴ 10⁵ 10⁶

Abbildung 2.19: Berechnung der Anzahl der Genomkopien einer Probe mittels absoluter Quantifizierung:

Auf der Ordinate werden die CT-Werte aufgetragen. Auf der Abzisse wird die Anzahl der Genomkopien aufgetragen. Im Anschluss an die real-time PCR werden von dem

Auswertungsprogramm des Computer CT-Werte und Anzahl der Genomkopien gegeneinander aufgetragen (grüne Quadrate). Aus den Werten wird eine Standardkurve (Regressionsgerade) ermittelt (rote Linie). Über den CT-Wert der zu quantifizierenden Probe A wird über die Standardkurve ein Wert auf der Abzisse ermittelt, hierbei handelt es sich um die Anzahl der Genomkopien (blaue Linien).

Zur Erstellung der Standardkurve (Regressionsgerade) werden die ermittelten CT-Werte der Standardverdünnung gegen ihre logarithmische Konzentration (z.B. Kopienzahl) aufgetragen.

Die zu erwartende Menge der zu untersuchenden Probe sollte in den durch den Standard abgedecken Bereich fallen (FRONHOFFS et al. 2002).

Das Amplikon, das als Standard benutzt werden soll, kann entweder kloniert oder ein synthetisches Oligonukleotid sein. Es kann je nach Fragestellung DNA oder RNA als Standard benutzen werden. Für eine PCR bieten sich linearisierte Plasmide mit einer klonierten Zielsequenz an. Sie werden als rekombinante Standards (recDNA-Standards) bezeichnet (BUSTIN 2000). Des Weiteren können genomische DNA oder PCR-Produkte verwendet werden, die allerdings schlechter zu quantifizieren sind und auch schlechter lagerbar sind (FRONHOFFS et al. 2002). Für eine RT-PCR bietet sich mit Hilfe eines Plasmids in vitro transkribierte RNA an. Sie wird als rekombinanter RNA-Standard

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bezeichnet (recRNA-Standard) (FRONHOFFS et al. 2002). Es gibt einige Bedingungen, die für die absoluten Standards gelten: So sollte der verwendete Standard eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Zielsequenz, sowohl in der Amplikonlänge als auch im GC-Gehalt, haben. Ferner sollte der Standard mit denselben Primern amplifiziert werden. Beides garantiert eine gleiche Amplifikationseffizienz von Standard und Zielsequenz. Zudem muss der absolute Standard akkurat quantifiziert werden. Dies kann durch eine Absorptionsmessung im Photometer bei 260 nm erfolgen. Eine Anfärbung der DNA mit SYBR Green™ oder der RNA mittels RiboGreen ermöglicht eine genauere photometrische Bestimmung (FRONHOFFS et al. 2002; BUSTIN 2000). Allerdings ist man bei dieser Art der Quantifizierung auf eine Reihe von biologischen Systemen angewiesen, die u.U.

Schwankungen unterworfen sind. Dies stellt die Verlässlichkeit und Reproduzierbarkeit der erzielten Ergebnisse in Frage.