Direkter Erregernachweis

Der direkte Infektionsnachweis ist in all jenen Fällen gefordert, in denen CSF-Infektionsverdacht bei Krankheits- oder Todesfällen geäußert wird (ANON. 1999).

Immunofluoreszenztest

Der Nachweis des CSFV-Antigens erfolgt im ersten Schritt laut EU-Vorgabe mit der Immunofluoreszenz an Gefrierschnitten von Organen betroffener Tiere oder Abklatschpräparaten. Besonders geeignet ist hierfür die Tonsille, da es sich um das primär affine Organ des Virus handelt (RESSANG 1970, 1973a). Ferner eignen sich auch Milz, Niere und das Ileum. Die Färbung der Schnitte erfolgt mit einem so genannten Konjugat, welches CSFV-spezifische Antikörper enthält, an die kovalent Fluoreszeinisothiocyanat gekoppelt ist. Die Auswertung erfolgt unter einem Fluoreszenzmikroskop. Zur Differenzierung von CSFV-Feldisolaten, Vakzinevirus und nicht CSFV-Pestiviren werden jeweils mehrere Schnitte angefertigt und mit verschiedenen mAk gefärbt (MENGELING et al. 1963; WENSVOORT et al. 1986; CAY et al. 1989; EDWARDS et al. 1991). Der Vorteil

2 Literaturübersicht 12

dieses Tests liegt in seiner schnellen Durchführbarkeit, so dass eine Diagnosestellung innerhalb weniger Stunden möglich ist. Nachteilig ist aber, dass dieser Test oft zweideutige Resultate erbringt. Diese sind auf eine hohe Hintergrundfluoreszenz oder eine Maskierung des Antigens durch frühe Antikörper zurückzuführen. Die Auswertung dieser zweideutigen Befunde bedarf daher eines besonders geschulten Personals. Ferner ist von Nachteil, dass das CSFV-Antigen durch Autolyse des umgebenden Gewebes eher zerstört wird, als dass die Infektiosität des kompletten Virus aufgehoben wird, so dass z.B. bei einem Transport der Proben unter suboptimalen Bedingungen (z.B. Transporttemperaturen >10 °C) dieser Test möglicherweise negativ ausfällt, während die kulturelle Virusisolierung positiv verläuft. Es konnte gezeigt werden, dass die Sicherheit des Ergebnisses dieses Methode nur bei ca. 80 % liegt (BOUMA et al. 2001). Die diagnostische Sicherheit dieses Tests ist zwar relativ gering, die diagnostische Brauchbarkeit aufgrund des schnellen Ergebnisses in positiven Fällen oder zusammen mit der kulturellen Virusisolierung ist aber vorhanden.

Virusisolierung in der Zellkultur

Die Virusisolierung (VI) in der Zellkultur ist zurzeit die sicherste Methode zum direkten Nachweis der Infektion und ist daher als Goldstandard definiert (MOENNIG 2000). Sie kann mit Verreibungen der o.g. Organe, Sekreten oder mit Leukozytenfraktionen einer Blutprobe auf permanenten Schweinenierenzellkulturen durchgeführt werden. Zum Nachweis der Infektion werden die infizierten Zellkulturen im Peroxidase-linked Antibody Assay (PLA) gefärbt (HOLM-JENSEN 1981; HYERA et al. 1987). Der Nachweis des infektiösen Virus ist die sicherste Methode. Allerdings ist sie auch sehr arbeits- und zeitaufwendig. Das Ergebnis liegt erst nach drei bis sieben Tagen vor. Enthält die zu untersuchende Probe Substanzen, die toxisch für die Zellen sind, muss das Virus unter Umständen mehrfach passagiert werden, was die Zeitspanne bis zur Diagnosestellung evtl. verdoppelt oder verdreifacht. In diesem langen Zeitraum kann es zur weiteren Ausbreitung des Virus kommen, bzw. müssen die Bauern unter den strikten Kontrollmaßnahmen erhebliche wirtschaftliche Schäden in Kauf nehmen. Da auch BVD-Virus bzw. BD-Virus im Schwein vorkommen und sich potentiell in den verwendeten permanenten Schweinenierenzellkulturen vermehren können, ist eine weitere Differenzierung mit mAk nötig. MAk mit Epitop-Spezifität für das CSFV, BVDV bzw. BDV erlauben eine sichere Identifizierung des Virus. Sie können im indirekten Immunfluoreszenzverfahren oder im indirekten Immunoperoxidase-Test (PLA) angewendet werden.

Antigen-ELISA

Antigen-ELISA-Verfahren zur Untersuchung von Blutproben ermöglichen aufgrund eines höheren Automatisierungsgrades die schnellere Bearbeitung einer bedeutend höheren Probenzahl als es bei der kulturellen Virusisolierung möglich ist. Auch ist keine aufwendige Probenaufbereitung nötig. Zudem kann Probenmaterial wie z.B. Serum direkt eingesetzt werden (CLAVIJO et al. 2001). Alle zurzeit auf dem Markt befindlichen Antigen-ELISAs verfügen allerdings nur über eine mäßige Sensitivität und Spezifität (BELAK und THOREN

2001; FLOEGEL-NIESMANN et al. 2001; HERGARTEN et a. 2001; KADEN et al. 1999a, b; PATON et al. 2000a). Trotz dieses Umstandes sind sie für die Herdendiagnostik geeignet.

Es ist zu betonen, dass positive Reagenten trotzdem kulturell überprüft werden müssen, da falsch positive Befunde nicht selten sind.

Polymerasekettenreaktion

Eine weitere Methode zum direkten Nachweis des CSFV ist die Polymerasekettenreaktion (PCR) nach Reverser Transkription (RT). Nach der Extraktion der RNA aus dem Probenmaterial wird diese mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben und in der eigentlichen PCR, ebenfalls ein enzymatischer Vorgang, wird ein spezifischer Teil des viralen Genoms milliardenfach vermehrt. Das Produkt wird dann sichtbar gemacht und ausgewertet. Seit ca. 10 Jahren findet diese molekularbiologische Methode zunehmend Einzug in die CSFV-Diagnostik. Seither ist eine große Anzahl an PCR-Protokollen erschienen, die sich vor allem auf den 5`NTR aber auch auf den E2-, NS5B- oder NS2-3-Bereich des CSFV-Genoms konzentrieren (PATON et al.

2000a). Als Probenmaterial kann eine Vielzahl von Materialien wie z.B. Blut, Serum sowie diverse Organmaterialien (Tonsille, Milz, Niere, Lymphknoten, Ileum) genutzt werden (DIAZ DE ARCE et al. 1998; THUR u, HOFFMANN 1998). Je nach Ausgangsmaterial ist eine geeignete RNA-Isolierungsmethode notwendig, da gezeigt werden konnte, dass dieser Teilschritt kritisch für das Gelingen der PCR ist (SCHEIBNER 2000). Der RNA-Isolierungsschritt ist bisher der zeit- und arbeitsaufwendigste Teilschritt der PCR und bedarf dringend einer Automatisierung.

Die PCR-Methode ist der Virusisolierung in punkto Zeitaufwand klar überlegen; im Gegensatz zur Virusisolierung in Zellkultur muss auch nicht mehr mit infektiösem Virus im Labor gearbeitet werden. Ähnlich wie beim ELISA und der Immunfluoreszenz ist eine Diagnosestellung innerhalb von Stunden möglich (THUR u. HOFFMANN 1998). Ein bis dato noch hoher Arbeitsaufwand, könnte zukünftig durch eine Automatisierung verringert werden (BELAK u. THOREN 2001).

In einem im Jahre 1999 mit internationaler Beteiligung durchgeführten Ringtest zur Evaluierung der Sensitivität und Spezifität verschiedener diagnostischer RT-PCRs zur CSFV-Diagnose konnte gezeigt werden, dass die RT-PCR der Virusisolierung, dem ELISA und der Immunfluoreszenz in punkto Sensitivität überlegen ist (PATON et al. 2000a). Es zeigte sich jedoch auch, dass die hohe Sensitivität allerdings auch die Gefahr eines falsch-positiven Resultats durch Kontaminationen in sich birgt (PATON et al. 2000a). Daher ist bei der Durchführung dieser Methode den strikten kontaminationsverhindernden Präventionsmaßnahmen im Labor, sowie dem Einsatz einer Reihe von negativen Kontrollen große Bedeutung zu schenken.

Auffällig war des Weiteren eine große Varianz der Ergebnisse, auch wenn verschiedene Laboratorien dieselben PCR-Protokolle verwendeten. Dies zeigt, dass die lokalen Konditionen des Labors, wie z.B. Personal, verwendete Geräte, Arbeitsprozeduren, etc., einen großen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Eine Standardisierung der PCR-Methode ist daher

2 Literaturübersicht 14

äußerst erstrebenswert. Erste Versuche dahin gehend, wurden in einem zweiten internationalen Ringtest 2000 unternommen (PATON et al. 2000b). Zwei definierte RT-PCRs wurden in sechs teilnehmenden Laboratorien strikt nach Protokoll durchgeführt. Es konnte eine Verbesserung der Sensitivität und der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erreicht werden. Des Weiteren konnten weniger falsch-positive Resultate als im ersten Ringtest verzeichnet werden (PATON et al. 2000b). Trotzdem ist die Varianz der Ergebnisse und die Anzahl falsch-positiver Resultate als unbefriedigend zu werten, so dass eine Standardisierung und Evaluierung eines zuverlässigen RT-PCR-Protokolls noch aussteht (PATON et al.

2000b).

Kritisch gestaltet sich auch die Spezifität der Methode. Viele PCR-Protokolle wurden nur für eine Detektion von Pestiviren allgemein entwickelt, bzw. wurden nicht auf ihre Spezifität geprüft und lassen daher eine Diskriminierung des CSFV von den anderen Pestiviren nicht zu.

Demzufolge schließt sich an viele PCR-Protokolle, die eine sichere Identifizierung des CSFV-Genoms und eine Diskriminierung des CSFV von anderen Pestiviren erzielen wollen, ein weiterer Analyseschritt in Form einer Sequenzierung, Hybridisierung oder eines enzymatischen Restriktionsenzymverdaus des entstandenen Produktes an. Bis dato (Januar 2003) sind sechs PCR-Protokolle veröffentlicht, die eine Diskriminierung des CSFV von anderen Pestiviren ohne anschließenden Analyseschritt ermöglichen (CANAL et al. 1996;

DIAZ DE ARCE et al. 1998; HARDING et al.1994, 1996; KATZ et al. 1993; SANDVIK et al. 1997; WIRZ et al. 1993;). Eine Evaluierung dieser RT-PCRs fand bis zum heutigen Zeitpunkt nicht statt.

Da die RT-PCR genetisches Material des Virus amplifiziert, ist sie auch dann positiv, wenn kein infektiöses Viruspartikel mehr vorhanden ist, wie z.B. in autolytischem Gewebe oder in Proben konvaleszenter Schweine. Bei autolytischen Proben aus Schlachtkörpern von Haus- oder Wildschweinen, bei denen Zellkultur nicht möglich ist, stellt sie daher die Methode der Wahl dar (DIAZ DE ARCE et al. 1998).

Neben dem Einsatz in der Diagnostik wird die RT-PCR auch im Bereich der molekularen Epidemiologie eingesetzt. Hier ist sie mittlerweile unverzichtbar geworden. Sie stellt die Grundlage für die spätere Sequenzierung der Nukleinsäure des zu untersuchenden Isolates dar. Über die so gewonnene Nukleotidsequenz kann eine Genotypisierung erfolgen und so eine epidemiologische Aussage getroffen werden (Abb. 2.1).

Trotz des geringen Zeitaufwands erfordert die Durchführung der RT-PCR speziell geschultes Personal, teure Arbeitsmaterialien und separate Arbeitsräume. So ist bislang auch nur eine gleichzeitige Bearbeitung von einer begrenzten Probenanzahl möglich (limitierender Faktor ist hier die RNA-Isolierung). Kompensiert wird dieses Problem durch die Möglichkeit des Poolens (Sammelproben) von Proben (DREW et al. 1999).

Um Kontaminations- und Sensitivitätsprobleme der konventionellen PCR zu vermeiden, gehen neue Entwicklungen zum Einsatz der quantitativen real-time PCR. Real-time PCR kombiniert eine computer-gestützte PCR mit einer optischen Detektionstechnologie. Die Methodik basiert auf der Messung und Quantifizierung eines Fluoreszenzfarbstoffs, der als

Marker der eigentlichen PCR zugesetzt wird. Eine Auswertung mittels Agarose-Gel entfällt.

Dadurch werden zusätzlich Zeit- und Arbeitsaufwand gegenüber der konventionellen PCR reduziert. Die Etablierung und Validierung von real-time PCR-Protokollen für die Pestivirusdiagnostik steht heute noch ganz am Anfang. So gibt es für die Detektion des CSFV bis dato (Januar 2003) nur zwei Protokolle (MCGOLDRICK 1998; RISATTI et al. 2003), für BVDV ein (BHUDEVI u. WEINSTOCK 2001) und für BDV ebenfalls ein veröffentlichtes Protokoll (VILCEK u. PATON 2000). Alle Protokolle sind für die Diagnostik nur unzureichend validiert und auch nur in wenigen Laboratorien getestet. Ein validiertes und gemeinhin verwendetes real-time PCR-Protokoll könnte einen hohen Stellenwert in der schnellen und verlässlichen Schweinepestdiagnostik darstellen.

Abbildung 2-2: Das Flussdiagramm zeigt den Arbeitsablauf der molekularen Epidemiologie (BELAK und THOREN 2001)

RT-PCR

Sequenzierung Probe

PCR-Produkt Auswertung (Elektrophorese)

Evtl.

Hybridisierung Vergleich mit

Datenbank

Epidemiologische Daten

Phylogenetische Analyse

2 Literaturübersicht 16

2.2 Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription