Spezifische Detektionssysteme mit Hilfe fluorogener Sonden

Das Prinzip der Sonden beruht darauf, dass zur eigentlichen PCR-Reaktion mit Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorochrom) markierte Oligonukleotide gegeben werden. Diese Oligonukleotide werden so gewählt, dass sie während der PCR-Reaktion in einem Bereich zwischen den beiden Primern hybridisieren. Diese Oligonukleotide wurden als Sonden (engl.:

„Probes“) bezeichnet. Diese Sonden sind in der Regel zwischen 20 und 30 Basen lang. Ihre Sequenz muss, wie bei den Primern der PCR, speziell für das zu untersuchende Amplikon ausgewählt werden. Eine Emission der Fluoreszenz erfolgt erst bei Hybridisierung an die gewünschte Zielsequenz. Das Problem einer geringen Spezifität wie bei den interkalierenden Farbstoffen fällt daher nicht an.

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von verschieden Sonden entwickelt, die aber alle prinzipiell auf einem Mechanismus basieren, den Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) bzw. Förster-Resonanz-Energie-Transfer bezeichnet (Abb. 2.10). Er wurde von CARDULLO et al. (1988) eingeführt.

Ein Fluoreszenzfarbstoff lässt sich mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (A1) anregen und strahlt die aufgenommene Energie anschließend in Form von Licht einer anderen Wellenlänge (E1) wieder ab (SELVIN 1995; Abb. 2.10). Anregungs- und Emissionsspektrum des Fluoreszenzfarbstoffs sind dabei für diesen charakteristisch. Bringt man allerdings ein Fluorochrom (F1) in ausreichende Nähe zu einem zweiten (F2), dessen Anregungsspektrum (A2) dem Emissionsspektrum des ersten Fluorochroms (E1) entspricht, springt die Energie zwischen beiden über, wenn der Abstand nicht mehr als 17-20 Basen (10 – 100 Å) übersteigt (CARDULLO et al. 1988). Die Energie wird, anstatt als Licht der Wellenlänge E1 abgestrahlt zu werden, direkt an Fluorochrom 2 weitergeleitet (Abb. 2.10). Je nach Versuchsaufbau kann man nun während der PCR die Lichtstärke bei Wellenlänge E1 oder E2 verfolgen und sieht daran, ob die beiden Fluorochrome räumlich weit von einander getrennt (Messung von E1) oder nahe beieinander sind (SELVIN 1995).

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Abbildung 2-11: Prinzip des Fluoreszenz- Resonanz-Energie-Transfers (FRET)³. Das Fluorochrom F1 hat die Anregungswellenlänge A1 und die Emissionswellenlänge E1. Das Fluorochrom F2 hingegen hat die Anregungswellenlänge A2 und die Emissionswellenlänge E2. Ist E1 nun gleich A2 und bringt man die Fluorochrome in räumliche Nähe, so wird die von Fluorochrom F1 emittierte Energie auf das Fluorochrom F2 übertragen.

3 Modifiziert nach MÜLHARDT 2002

2 Literaturübersicht 44

Wird E1 gemessen, bezeichnet man Fluorochrom 1 als Reporter oder auch Fluorophor und Fluorochrom 2 als Quencher (engl.: to quench = löschen), misst man E2, heißt F1 Donor (Latein: Donor = Spender) und F2 Akzeptor (Latein: Akzeptor = Empfänger).

Konventionell wird für die Nutzung des FRET-Effektes der Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-Carboxy-Fluorescein) als Reporter/Donor verwendet. Dabei stehen noch eine ganze Reihe anderer Farbstoffe zur Verfügung, die alle ein spezifisches Absorbtions- und Emissionsspektrum haben. Aufgrund dieser Tatsache ist es auch möglich, verschiedene Reporterfarbstoffe, gebunden an verschiedene Sonden, gleichzeitig in einer Reaktion zu verwenden. Als Quencher/Akzeptor wird herkömmlich der Fluoreszenzfarbstoff TAMRA (6-Carboxy-Tetramethylrhodamin) verwendet. Man bezeichnet ihn als „fluoreszierenden Quencher“, da er das aufgenommene Licht in Licht anderer Wellenlänge umformt. Dieser Farbstoff ist außerdem auch als Reporterfarbstoff nutzbar.

Tabelle 2-6: Übersicht der derzeit verfügbaren Reporterfarbstoffe

Fluoreszenzfarbstoffe Anregung (nm) Emission (nm)

FAM 492 515

TET 521 536

JOE 527 548

HEX 535 556

TAMRA 555 580

ROX 575 602

Cy3 552 565

Cy3.5 581 596

Cy5 651 674

Cy5.5 675 694

Cy7 743 767

R6G 518 543

Texas Red 583 603

VIC 528 546

Yakima Yellow 525 548

NED 546 575

Redmond Red 580 594

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von neuen Quenchern entwickelt, die man als dark, black-hole oder non-fluorescent Quencher bezeichnet (NASARABADI et al. 1999), da sie das aufgenommene Licht nicht in Licht anderer Wellenlänge, sondern stattdessen als Wärme emittieren. Außerdem ist das Adsorbtionsspektrum der Dark Quencher derart konzipiert, dass es mit dem Emissionsspektrum des Reporters maximal überlappt, so dass das Verhältnis von Signal zu Hintergrundfluoreszenz optimiert wird.

Tabelle 2-7: Übersicht der derzeit verfügbaren Quencher

Quencher Adsorption (nm) Emission (nm)

TAMRA 555 580

Methyl red 410 N/A

ElleQuencher 650, 600 N/A

Dabcyl 453 N/A

Dabsyl 466 N/A

N/A= Emission von Wärme in verschieden Wellenlängen

2.3.4.1 Hybridisierungssonden

Die Firma (Fa.) Roche entwickelte Hybridisierungssonden (WITTWER et al. 1997; CAPLIN et al. 1999) speziell für den Gebrauch ihres Lightcycler™ Systems (ROCHE). Diese Hybridisierungssonden bestehen aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind (WITTWER et al. 1997). Am 3`-Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5`-Ende mit einem Donor versehen (Abb. 2.11). Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA-Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum FRET-Effekt kommen kann (WITTWER et al. 1997).

Aufgrund dieser Nähe werden die Sonden manchmal auch als kissing-probes bezeichnet.

Die Messung der Fluoreszenz E2 erfolgt während des Annealingschritts (Abb. 2.11), wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind (WITTWER et al. 1997). Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden -zusätzlich zu den verwendeten Primern- ist die Spezifität dieses Detektionsystems äußerst hoch (WITTWER et al. 1997). Nachteilig gestaltet sich das schwierige Sonden-Design.

2 Literaturübersicht 46

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Abbildung 2-12: Darstellung der Funktion der Hybridisierungssonden: Die erste Hybridisierungssonde trägt einen Reporterfarbstoff am 3`-Ende (F1), die zweite Sonde trägt einen Quencherfarbstoff am 5`-Ende (F2). Hybridisieren beide Sonden in einem kurzen Abstand (1-5 Basen)

nebeneinander, so kommt es zur Übertragung der Energie (FRET) und zur Emission von Fluoreszenz.

2.3.4.2 Double Dye Sonden

Das Double Dye Sonden-Prinzip ist das älteste und das zurzeit meist genutzte Prinzip. Es wurde von den Firmen Roche und ABI entwickelt und war zunächst radioaktiv markiert (HOLLAND et al. 1991). Die Auswertung war allerdings sehr zeitaufwendig. Daher wurde zu Sonden mit Fluorochromen gewechselt. Double Dye Sonden tragen -wie der Name sagt- zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5`-Ende, der Quencherfarbstoff am 3`-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3`-Ende der Sonde noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann (LIE 1998). Solange die Sonde intakt ist, ist die Lichtstärke bei E1 gering, da fast die gesamte Lichtenergie (E1), die nach der Anregung des Reporters (F1) bei Wellenlänge A1 entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher (F2) aufgenommen und in die Wellenlänge E2 umgeformt wird (WALKER 2002). Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird

„gequenched“, d.h. gelöscht. Dieser FRET-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat (LIE 1998). Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie (Abb. 2.12; LEE 1998). Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5`-3` Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5`-3` Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Da das Verhalten der Taq-Polymerase bei der Strangverlängerung einer Comicfigur aus einem Computerspiel der 1980er -genannt PacMan- gleicht, wurde dieses Prinzip in Anlehnung daran TaqMan- Prinzip genannt (LEUTENEGGER 2001a).

F1 F2

Denaturierung:

Annealing:

Extension:

^Taq

Reporter Quencher hv

hv

hv

Denaturierung:

Annealing:

Extension:

^Taq

Reporter Quencher hv

hv

hv

Abbildung 2-13: Schematische Darstellung des TaqMan-Prinzips: Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Ein Reporterfarbstoff befindet sich am 5`-Ende, der

Quencherfarbstoff am 3`-Ende. Solange die Sonde intakt ist, ist die Lichtstärke des Reporters gering, da fast die gesamte Lichtenergie aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen wird. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Nach der Hydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz E1 kann jetzt gemessen werden.

Nach der Hydrolyse der Sonde befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz E1 wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.

2.3.4.3 Terbium Chelat Sonden

Terbium Chelat Sonden (PERKIN ELMER LIFE SCIENCE) tragen am 3`-Ende der Sonde im Gegensatz zu Double Dye Sonden nur ein Fluorochrom, ein Terbium Chelatmolekül. Das Terbium Chelatmolekül emittiert gebunden an die Sonde keine eigene Fluoreszenz. Erst nach der Hydrolyse der Sonde durch die Polymerase, wird das Molekül freigesetzt und emittiert Fluoreszenz (NURMI et al. 2000).

2 Literaturübersicht 48

2.3.4.4 Molecular Beacons

Die Molecular Beacons sind eine Weiterentwicklung des Double-Dye-Prinzips (TYAGI et al.

1996). Wiederum befindet sich ein Reporterfarbstoff am 5`-Ende und ein Quencherfarbstoff (immer ein Dark Quencher) am 3`-Ende der Sonde. Auch bei diesem Sondensystem wird der FRET-Effekt genutzt (WALKER 2002). Neben einem zentral gelegenen, einzelsträngigen sequenzspezifischen Bereich von rund 20 bis 30 Basen, der als Loop bezeichnet wird, enthält das Oligonukleotid hier zusätzlich an 5`- und 3`-Ende komplementäre Sequenzen, die dafür sorgen, dass die Sonde eine Haarnadelstruktur (engl.: hairpin structure) einnimmt (TYAGI et al. 1996; GIESENDORF et al. 1998). Der komplementäre Sequenzbereich ist fünf bis sieben Basen lang und wird als Stammregion bezeichnet. Er besteht ausschließlich aus den Basen Guanin und Cytosin. Die Stammregion garantiert, dass der Reporterfarbstoff und der Quencherfarbstoff ausreichend nahe zusammen kommen, damit ein Quenching gewährleistet wird (FRET-Effekt). Die Schmelztemperatur der Stamm- und der Loop-Sequenz liegt acht bis 10 °C über der Annealingtemperatur (BUSTIN 2000). Während des Amplifikationsprozesses der PCR denaturiert die Stammregion des Molecular Beacon. Das Molekül geht aus einer Haarnadelstruktur in eine lineare Struktur über. In dieser linearen Form ist es dem Molekül möglich, mit seinem sequenzspezifischen Bereich an das Amplikon während des Annealingschritts zu hybridisieren (TYAGI et al. 1996; GIESENDORF et al. 1998). Dies wird durch die Tatsache begünstigt, dass das Sonde-Amplikon-Duplex thermodynamisch stabiler ist als die Haarnadelstruktur. Wenn sich die Sonde geöffnet hat, sind Reporter und Quencher räumlich soweit getrennt, dass der FRET-Effekt unterbrochen ist und der Reporter seine volle Fluoreszenz emittiert. Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt also während des Annealingschritts (TYAGI et al. 1996; GIESENDORF et al. 1998).

Im Gegensatz zu Double Dye Sonden ist der Anstieg der Fluoreszenz reversibel, da diese Sonde nicht bei der Extension zerstört wird, sondern bei höheren Temperaturen (wie z.B. bei dem Extensionsschritt) wieder von der Zielsequenz dissoziiert und in eine Haarnadelstruktur übergeht (FANG 2002). Durch die nicht an die Zielsequenz hybridisierende Stammsequenz am 5`-Ende der Sonde kommt es eher zur Verdrängung des Molecular Beacons durch die Polymerase von der Zielsequenz als zur Zerstörung der Sonde (TYAGI et al. 1996). Die Stammregion der Sonde erhöht die Spezifität dieses Systems, denn die Hybridisierungsenergie zwischen spezifischer Sequenz des Molecular Beacons und Zielsequenz auf dem Amplikon muss stärker sein als die intramolekularen Anziehungskräfte des Stammes. Sind nicht alle Basen der Sonde mit der Zielsequenz komplementär, so wird dieser Sonde-Amplikon-Duplex bei einer anderen Temperatur dissoziieren als bei 100 % Komplementarität (TYAGI et al. 1996).

Abbildung 2-14: Molecular Beacons tragen einen Reporterfarbstoff am 5`-Ende und einen

Quencherfarbstoff am 3`-Ende. Die Sonde liegt während der PCR in zwei Zuständen vor:

während Denaturierung und Elongation als Haarnadelstruktur mit beiden Fluorochromen in räumlicher Nähe und während des Annealingschritts als geöffnete Struktur.

Diese unterschiedlichen Schmelzpunkte lassen sich, ähnlich wie bei SYBR Green™, in einer Schmelzpunktanalyse darstellen. Aufgrund der hohen Spezifität der Molecular Beacons lassen sich ohne weiteres Punktmutationen nachweisen. Der Nachteil ist allerdings, dass diese Sonden oft nur ein geringes Fluoreszenzsignal emittieren. Zudem ist das Design der Sonden sehr kompliziert und die Synthese teuer (BUSTIN 2002).

2.3.4.5 Scorpions™

Scorpions™ (DXS LTD.) stellen strukturell eine Kombination aus einem Molecular Beacon und einem Primer dar. Im Gegensatz zu den bislang besprochenen Sonden, beruht die Emission der Fluoreszenz bei den Scorpions™ auf einem intramolekularen Mechanismus (WHITCOMBE et al. 1999; THELWEL et al. 2000). Das 5`-Ende eines Molecular Beacons ist über einen PCR-Stopper (HEX-Ethylen-Glykol) mit einem spezifischen Primer verbunden (Abb. 2.14). Dieser Primer hybridisiert in der Annealingphase mit der Zielsequenz und dient in der anschließenden Extensionsphase als Starter für die Amplifikation des Stranges (Abb.

2.14). Im folgenden Denaturierungsschritt trennt sich der neu synthetisierte Doppelstrang.

Gleichzeitig kommt es zur Öffnung der Stammstruktur. Die Haarnadelstruktur des Scorpions™ ist nun in der Lage, in 3`-Richtung zu klappen (WHITCOMBE et al. 1999).

Dieses „nach vorne klappen“ erinnert an den Stich eines Skorpions mit seinem Schwanz.

Daher bekam die Sonde ihren Namen. Im Folgenden hybridisiert die spezifische Sequenz der

2 Literaturübersicht 50

Loop-Region während der nächsten Annealingphase mit einem komplementären Bereich des Amplikons, das in 3`-Richtung vor der Primerstruktur des Scorpions™ gelegen ist (Abb.

2.14). Der PCR-Stopper verhindert, dass während der Extensionsphase nicht durch die Polymerase ein Gegenstrang zum kompletten Scorpion™ synthetisiert wird, d.h., dass sowohl der Primerbereich als auch der Haarnadelbereich des Scorpions verlängert werden (WHITCOMBE et al. 1999). Dies würde zur unspezifischen Detektion von z.B. Primerdimer oder zu Mismatches führen.

2.3.4.6 Minor Groove Binder Sonden

Bei den Minor Groove Bindern (MGB) handelt es sich nicht um eine neue Sondenart, sondern um ein chemisches Molekül mit speziellen Eigenschaften. Bestehende Sonden können mit diesem Molekül, einem Indolderivat, modifiziert und damit optimiert werden. Das Molekül hat eine große Affinität zu den kleinen Furchungen der DNA, lagert sich dort an und bildet stabile Hybride, auch wenn es an eine Sonde gebunden ist (KUMAR et al. 1998). Man kann z.B. ein MGB-Molekül mit einer TaqMan-Sonde kombinieren, dem das Molekül im mittleren Bereich der TaqMan-Sonde kovalent gebunden wird. Die TaqMan-Sonde kann nach wie vor mit seiner komplementären Zielsequenz hybridisieren. Zusätzlich legt sich das MGB-Molekül, wie ein Seitenarm der Sonde, noch ergänzend in die kleine Furche der DNA (KUMAR et al. 1998).

Diese zusätzliche Bindung findet erst bei exakter Bindung der TaqMan-Sonde statt, was eine erhöhte Spezifität und damit die präzise Detektion von Punktmutationen mit TaqMan-Sonden ermöglicht (BUSTIN 2002). Sie besitzen den weiteren Vorteil, dass sie bei gleicher Annealingtemperatur kürzer als herkömmliche Double Dye Sonden sein können (BUSTIN 2002). Allerdings ist es nicht möglich, bereits synthetisierten TaqMan-Sonden einfach ein MGB-Molekül anzuhängen. Vielmehr muss die Sonde neu entworfen werden (BUSTIN 2002). Als Quencher wird dabei ein nicht fluoreszierenden Dark Quencher mit niedrigerer Hintergrundfluoreszenz verwendet. Eine weitere Abwandlung stellen die sog. Eclipse™

Sonden (SYNTHETIC GENETICS) dar. Dies sind kurze lineare Sonden, die ein MGB-Molekül und einen Quencher am 5`-Ende tragen und ein Fluorophor am 3`-Ende (ALFONIA et al. 1996). Der Quenchingmechanismus funktioniert wie bei einer TaqMan-Sonde, allerdings hat diese Sonde eine umgekehrte Orientierung. Das MGB-Molekül am 5`-Ende verhindert eine Hydrolyse der Sonde durch die Polymerase während der Strangverlängerung.

Die Sonde ist in ihrer freien Form stark gewunden, so dass Reporter und Quencher sehr eng beieinander sind und optimales Quenching erfolgt.

Taq

Haarnadel-struktur

Primer-struktur

PCR-Stopper

EXTENSION

DENATURIERUNG

ANNEALING

Taq

Haarnadel-struktur

Primer-struktur

PCR-Stopper

EXTENSION

DENATURIERUNG

ANNEALING

Abbildung 2-15: Scorpions™ sind eine Kombination aus einem Molecular Beacon (Haarnadelstruktur) und einem Primer, die über einen PCR-Stopper miteinander verbunden sind. In einem ersten Annealingschritt hybridisiert die Primerstruktur mit der Zielsequenz (hier nicht gezeigt); im folgenden Extensionsschritt dient dieser Primer der Taq-Polymerase als Startpunkt. Der Denaturierungsschritt trennt den DNA-Doppelstrang und öffnet die Haarnadelstruktur. Im anschließenden Annealingschritt hybridisiert die sequenzspezifische Loop-Region der Haarnadelstruktur mit der Zielsequenz durch ein „nach vorne Klappen“ in 3`-Richtung.

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Dadurch ist auch eine erhöhte Sensitivität gewährleistet (KUTYAVIN et al. 2000). Bindet die Sonde an den DNA-Strang wird sie, gefördert durch das MGB-Molekül, gestreckt, wodurch Reporter und Quencher nicht mehr nahe genug beieinander sind. Obwohl die Sonden recht kurz sind, zeigen Untersuchungen, dass sie zur Detektion von Mutationen geeignet sind.

Sensitivitätstests zeigten, dass mit dieser Sonde, auch geringe Kopienzahlen einer Matrize nachweisbar sind. Die Eclipse™ Sonden sind zurzeit für eine Reihe von Anwendungen erhältlich, allerdings erfordert die Auswertung eine speziell von der Fa. EUROGENTEC entwickelte Software (ANON. 2002).

2 Literaturübersicht 52

Im Dokument Evaluierung konventioneller und real-time RT-PCR-Protokolle für die spezifische Diagnose des Virus der Klassischen Schweinepest (Seite 54-64)