2.2 P OLYMERASEKETTENREAKTION NACH REVERSER T RANSKRIPTION
2.2.4 Optimierung der PCR
2.2.4.1 PCR-Ansatz
Ein Reaktionsansatz für die PCR besteht grundsätzlich aus folgenden Komponenten:
Matrize (RNA/cDNA), Puffer, Primer, Magnesium-Ionen, Nukleotiden (dNTPs), Polymerase (REMICK et al. 1990):
Matrize
Die Isolierung und die Aufreinigung der zu untersuchenden Nukleinsäure ist der erste und wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Durchführung einer PCR und zugleich jedoch der anfälligste. Grundsätzlich lassen sich RNA oder DNA isolieren. Dabei spielen Reinheit und Integrität der Nukleinsäure eine entscheidende Rolle. Eine falsche Probenbehandlung kann zu Kreuzkontaminationen oder zum Verlust der Nukleinsäure führen. Beides führt zu falsch-positiven, bzw. falsch-negativen Resultaten. Die Automatisierung dieses Schrittes steht zurzeit noch am Anfang und bietet viele Fehlerquellen (GREISER-WILKE 2001).
Die Probe sollte frei von PCR-hemmenden Substanzen wie z.B. EDTA sein, da sie die Effektivität der PCR stark senken oder die eigentliche Reaktion inhibieren können.
Verunreinigte Nukleinsäuren müssen daher vorher aufgereinigt werden (WILSON 1997).
cDNA bereitet häufig größere Probleme bei der PCR als andere Matrizen wie z.B. Plasmide oder genomische DNA (MÜLHARDT 2002). Das liegt mitunter an der stark schwankenden cDNA-Ausbeute bei der Reversen Transkription (siehe unten). Ein anderer Grund ist aber vermutlich, dass die synthetisierte cDNA auch Primer, Puffer und Salze enthält, die ebenfalls für die PCR benutzt werden. In ungünstigsten Fällen kommt es durch die eingeschleppten Komponenten zur Interferenz mit den PCR-Komponenten und damit zur Verringerung der PCR-Ausbeute. Zudem hat auch die Reverse Transkriptase einen hemmenden Effekt auf die Polymerase (SELLNER et al. 1992).
Primer
Primer sind kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige Oligonukleotide. Sie sind Startpunkt der Synthese der Polymerase und damit grundlegende Voraussetzung für die Polymerasefunktion. Primer werden so ausgewählt, dass sie komplementär zum 5`- bzw. zum 3`-Ende der Zielstränge sind, wobei sie die zu vermehrende Region begrenzen. Die Primer lagern sich während der Annealingphase über Wasserstoffbrückenbindungen an die DNA-Einzelstränge. Dieser Vorgang wird als Hybridisierung bezeichnet.
Primer spielen eine maßgebende Rolle für das Gelingen einer PCR. Relevant sind vor allem Struktur und Sequenz der Primer. Obwohl Primer immer spezifisch für die entsprechende Aufgabenstellung entworfen werden, gibt es einige Grundlagen beim Design, die beachtet werden sollten (MULLIS 1991; TULLIS et al. 1989; vgl. Tabelle 2.2). Die Primerkonzentration kann erheblichen Einfluss auf die Ausbeute der PCR-Reaktion haben.
Primer werden relativ zur Menge der Ziel-DNA im Überschuss zum Reaktionsansatz gegeben, so dass sich die beiden Zielstränge eher mit den Primern hybridisieren, als dass es zu einem Reannealing der beiden Stränge kommt (WATSON et al. 1989). Erbringt die PCR-Reaktion nur geringe Produkterträge, so kann man die Primerkonzentration erhöhen.
Allerdings sinkt die Ausbeute jenseits dieses Optimums wieder sehr schnell. Die Spezifität der PCR kann auch durch die Verlängerung der Primer verbessert werden. Da Primer in hohen Konzentrationen dem Ansatz zugegeben werden, kann es zu Hybridisierung zweier Primer kommen, auch bei geringer Komplementarität ihrer Nukleotidsequenz. Die Folge ist die Bildung von Primerdimern. Durch die Primerdimerbildung geht ein Teil der eingesetzten Primer verloren. Sie hat eine Reduktion der PCR-Effizienz zur Folge. Des Weiteren können Primerdimer unter Umständen die Auswertung der PCR, insbesondere bei der Detektion kleiner PCR-Produkte, erschweren (BROWNIE et al. 1997).
Magnesium-Ionen
Das Magnesium-Ion (Mg++) wird der PCR als Magnesiumchlorid (MgCl2) zugegeben. Es übernimmt in einer PCR-Reaktion mehrere Aufgaben:
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Tabelle 2-2: Grundlegende Eigenschaften von Primern, die beim Design beachtet werden müssen
Primer sollten mindestens eine Länge von 17 Basen haben (durchschnittlich 18-30 Basen).
Für die Amplifikation langer Fragmente (>2,5 kb) sollten Primer 25-35 Basen lang sein.
Das AT/GC-Verhältnis sollte zwischen 40 – 60 % liegen.
Primer sollten keine „ungewöhnlichen“ Basenabfolgen wie Poly-A oder lange G/C-Bereiche aufweisen, um Fehlhybridisierungen (Mispriming) und Leserasterverschiebungen (Frameshifts) zu vermeiden.
Die Schmelztemperatur der Primer sollte zwischen 55 und 80 °C betragen, um ausreichend hohe Annealingtemperaturen zu erlauben.
Beide Primer sollten eine ähnlich hohe Schmelztemperatur haben.
Die Sequenz sollte möglichst spezifisch für das gesuchte Amplikon sein, um die Amplifikation von Artefakten zu vermeiden.
Am 3`-Ende sollten ein bis zwei G/C-Basen sitzen, um eine bessere Bindung und Elongation zu erreichen. Allerdings sollten höchstens drei G oder C ans 3`-Ende platziert werden, weil sonst fehlhybridisierende Primer stabilisiert werden (Gefahr von unspezifischen Amplifikationsprodukten).
Primer sollten keine internen Sekundärstrukturen (Hairpins) - vor allem nicht am 3`-Ende- aufweisen (Überprüfung mit Computerprogramm).
Primer dürfen nicht miteinander hybridisieren (Primerdimer), daher sollten sie gerade am 3`-Ende möglichst geringe Komplementarität besitzen. Durch Primerdimer wird die Menge an nutzbaren Primern drastisch reduziert, wodurch die Amplifikationseffizienz stark absinkt.
Je reiner der Primer, desto besser ist er für die Amplifikation geeignet (HPLC- oder PAGE-Aufreinigung).
Im Falle einer RT-PCR in genomischer DNA ist es erforderlich, die Primer so zu wählen, dass sie die Exon-Intron-Grenzen überspannen, damit die Amplifikation genomischer DNA aufgrund des längeren Intron-beinhaltenden Fragmentes erkannt wird.
Zum einen stellt das Magnesium-Ion einen metabolischen Kofaktor für die Polymerasen dar und beeinflusst damit die Enzymaktivität. Zum anderen bindet das Magnesium-Ion an die dNTPs. Erst so bildet sich ein löslicher aktiver Komplex, der von der Polymerase erkannt
werden kann (MÜLHARDT 2002). Die Magnesiumchlorid-Konzentration hat demnach Einfluss auf das Primerannealing, die Trennung des dsDNA-Stranges, die Produktspezifität, die Bildung von Primerdimern und die Fehlerrate der Polymerase (OSTE 1989). Niedrige Mg++-Konzentrationen führen zu einer geringen PCR-Produktausbeute, hohe Konzentrationen zu einer hohen Ausbeute. Bei einem Überschuss an freien Magnesium-Ionen ist mit der Synthese von unspezifischen PCR-Produkten zu rechnen (MÜLHARDT 2002).
Nukleotide
Die Nukleotide stellen die Grundbausteine der neu zu bildenen DNA dar. Ihre optimale Konzentration hängt von den Amplifikaten, den Primern, der Anzahl der PCR-Zyklen sowie der Menge an Mg++ ab. Bei einer Erhöhung der Mg++-Konzentration muss auch die dNTP-Konzentration erhöht werden. Zu viele freie dNTPs reduzieren hingegen die dNTP-Konzentration freien Magnesiums. Eine Erhöhung der dNTP-Konzentration hat also indirekt eine Verminderung der Polymeraseaktivität und eine Senkung der Anlagerung der Primer zur Folge (ROLFS et al. 1992). Neben der Konzentration spielt auch die Qualität der Nukleotide eine entscheidende Rolle. Entscheidend ist hier, dass der Gehalt an Modifikationen (z.B.
Methylierungen) ein Minimum (0,5 – 1,5 %) nicht übersteigt. Bei vielen kommerziell erhältlichen dNTPs können bis zu 30 % der dNTPs modifiziert sein (MÜLHARDT 2002).
Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase
Zur Durchführung der Reversen Transkription (cDNA-Synthese) benutzt man generell Reverse Transkriptasen. Des Weiteren können neben den Reversen Transkriptasen auch thermostabile DNA-Polymerasen mit Reverser Transkriptase-Aktivität wie Tth- oder Tfl-Polymerasen verwendet werden, die direkt im Anschluss die DNA-Amplifikation durchführen. Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Arten von RTs, die sich in einigen Eigenschaften unterscheiden. Dies sind die aviäre Myeloblastosevirus-Reverse-Transkriptase (AMV-RT) (MYERS u. GELFAND 1991) und die Moloney-Mausleukämievirus-Reverse-Transkriptase (MLV-RT) (BYRNE et al. 1988), die beide aus Retroviren stammen. Die M-MLV RT hat ein Arbeitsoptimum von 37°C bis 42°C, die AMV RT von 37 °C bis 45 °C.
Beide haben eine RNase-H-Aktivität, die die Effektivität der Reversen Transkription senkt (GERARD 1998), da die RNA nach Umschreibung in cDNA enzymatisch abgebaut wird und so nicht mehr als Matrize dienen kann. Die RNase Aktivität konkurriert zudem mit der 5`-3`Aktivität der Polymerase. Diese Kompetition inhibiert die Verlängerung der RNA und resultiert in einem geringeren Ertrag an cDNA (LEE 2003). Seit Ende der 1990er Jahre ist es möglich, RTs mit minimierter RNase-H-Aktivität gentechnisch herzustellen. Diese modifizierten Enzyme sind thermostabiler und können so bei Temperaturen zwischen 55°C und 60 °C eingesetzt werden, was eine bessere Auflösung von Sekundärstrukturen der RNA während der Reversen Transkription ermöglicht. Die Primerbindungsspezifität, gerade bei der Verwendung sequenzspezifischer Primer während des RT-Schritts, wird so zudem verbessert (GERARD 1998).
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Polymerasen synthetisieren ausgehend vom Primer die einzelsträngige Matrize durch den Einbau der vier jeweils komplementären Nukleotiden zum Doppelstrang. Erst mit dem Einsatz thermostabiler Polymerasen (SAIKI et al. 1988) setzte sich die PCR als Nukleinsäureamplifikationstechnik durch. Dies war die Voraussetzung für eine automatische Durchführung der PCR, ohne dass nach jedem Denaturierungsschritt neue DNA-Polymerase zugegeben werden musste, da die thermoinstabilen Polymerasen hierbei inaktiviert wurden.
Die thermostabilen Polymerasen wurden ursprünglich aus Bakterien isoliert, die in heißen Quellen leben (z.B. aus Thermus aquaticus: die Taq-Polymerase; CHIEN et al. 1976) und werden inzwischen ebenfalls gentechnisch hergestellt. Die Eigenschaften der meistgenutzten Polymerasen sind in Tabelle 2.3. zusammengefasst. Die am häufigsten verwendete Polymerase (90 % aller PCRs) ist die Taq-Polymerase (MÜLHARDT 2002). Sie zeichnet sich durch einen relativ geringen Preis, hohe Aktivität und eine gute Robustheit aus.
Die Tth-Polymerase hat neben der Polymerase-Aktivität auch eine Reverse Transkriptase-Aktivität (MEYERS u. GELFAND 1991). Wenngleich die Reverse Transkriptions-Transkriptase-Aktivität niedriger ist als die einer normalen Reversen Transkriptase und die Synthesegeschwindigkeit geringer ist als die bei anderen Polymerasen, so bietet dieses Enzym den Vorteil, RT-PCRs mit reduziertem Zeitaufwand und Kontaminationsrisiko durchzuführen (EASTON et al.
1994).
Polymerasen haben bei Raumtemperatur eine deutlich reduzierte Syntheseaktivität. Werden alle Komponenten der PCR sowie die Matrize bei Raumtemperatur gemischt, kommt es zur Synthese von Fragmenten, bevor die Polymerase im Thermocycler ihre optimale Reaktionstemperatur erreicht hat.
Diese Fragmente sind kürzer als die Zielfragmente, da die Polymerase aufgrund der reduzierten Syntheseaktivität oft vor Fertigstellung des kompletten Zielfragments von der Matrize abfällt (MULLIS et al. 1991). Diese verkürzten Fehlamplifikate dienen nun in den folgenden Zyklen als Matrize für weitere Fehlamplifikationen.
Eine Möglichkeit, die Bildung von Fehlamplifikaten zu umgehen, ist die Durchführung der PCR als Hotstart-Reaktion. Hotstart bedeutet, dass die Polymerase erst bei hohen Temperaturen, wie z.B. bei der Denaturierungstemperatur aktiv wird. Dazu wird Polymerase durch Substanzen wie Wachs oder Antikörper räumlich von den anderen Reaktionskomponenten getrennt. Beim ersten (verlängerten) Denaturierungsschritt werden diese Substanzen durch die Temperatur von der Polymerase abgespalten, und die Polymerase wird aktiviert.
Tabelle 2-3: Vergleich der biochemischen Eigenschaften von drei häufig benutzten Polymerasen1
EIGENSCHAFTEN
Taq-Polymerase
Tth-Polymerase
Pwo-Polymerase
5`- 3`Exonuklease Aktivität + + -
3`-5` Exonuklease Aktivität
(Proofreading) - - +
Prozessaktivität (bp) 50 50 20 -30
Fehlerrate (10-6) 26 30 3,2
Maximale Fragmentlänge 3 kb 3 kb 3 kb
Performance in der PCR
Sensitivität ++ ++ +
Spezifität ++ ++ +
Robustheit ++ + +
Ausbeute ++ ++ +
Optimale Betriebsparameter
pH Optimum 9 9 9
Temperaturoptimum (für die Elongation) 75°C 72 -75°C Benötigtes divalentes Ion
[Konzentration] Mg++[1,5mM] Mg++[1,5mM] Mg++[2,0mM]
als MgSO4
Konzentration je Nukleotid 200 µM 200 µM 200 µM Enzymkonzentration [U/ 50 µl] 0,5 – 2,5 0,5 – 2,5 0,5 – 2,5 Hitzestabilität (Halbwertszeit bei 95 °C) 40 min 30 min >120 min
Reaktionspuffer
Polymerasen haben ein Aktivitätsmaximum bei einem pH oberhalb von 8. Die kommerziell erhältlichen Puffer haben deshalb meist einen pH-Wert von 8,3 bis 9. Ein kommerziell erhältlicher Standardpuffer beinhaltet 500 mM Kaliumchlorid, sowie 100 mM Tris bei einem pH von 8,3 (HOSTA u. FLICK 1992). Tris-HCl verändert seinen pH Wert temperaturabhängig. So hat ein Tris-Puffer bei Raumtemperatur einen pH-Wert von 8,3, doch
1 Modifiziert nach MÜLHARDT 2002
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während der PCR sinkt der pH-Wert auf 7,8 bis hin zu 6,8 ab. Für die Aktivität der Polymerasen ist das eher ungünstig. Daher muss ein selbst hergestellter Tris-Puffer zu Beginn einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 haben.
Zusätze
Zur Optimierung von PCR-Reaktionen werden oft Zusätze verwendet. Dimethylsulfoxid (DMSO) (bis 10 % v/v) und Formamid (bis 5 % v/v) können die Spezifität steigern und die Amplifikation GC-reicher Sequenzen erleichtern. Gerade bei sehr ineffizienten PCRs können die Sensitivität und der Ertrag durch DMSO bis auf das 25fache gesteigert werden (WILSON et al. 1997). PEG 6000 (5 – 15 % v/v), Glycerin, Betain und Tween®20 (0,1 - 2,5 % v/v) können die Reaktion beschleunigen (WILSON et al. 1997). Eine weitere Möglichkeit, die Ausbeute der PCR zu steigern, liegt darin, das Reaktionsgleichgewicht zugunsten des Produkts zu verschieben, indem man eines der Reaktionsprodukte, nämlich das Pyrophosphat, aus dem Reaktionsansatz entfernt. Seit der Isolierung einer thermostabilen Pyrophosphatase ist dies möglich. Der zurzeit sehr hohe Preis spricht jedoch oft gegen die Verwendung (MÜLHARDT 2002).
Inhibitoren
Neben der eigentlichen Ziel-RNA bzw. Ziel-DNA befinden sich oft diverse Substanzen (z.B.
zelluläre Proteine) in der Probe, die die Amplifikation der Nukleinsäure inhibieren (WILSON 1997). Die Inhibition kann an den folgenden Punkten der Reaktion erfolgen: Als erstes kann es zur Interferenz mit der Zelllyse zu Beginn der Probenaufbereitung kommen. Ein zweiter Ansatzpunkt ist eine mögliche Inhibition durch Degradierung der isolierten Nukleinsäure.
Beide Punkte führen dazu, dass die Nukleinsäure nicht für die folgende RT-PCR zur Verfügung steht. Weiterhin kann es durch Substanzen in der Probe zur Inhibition der Reversen Transkriptase oder der Polymerase kommen (WILSON 1997). Die Inhibition ist entweder vollständig oder partiell und manifestiert sich in einem kompletten Ausfall der Reaktion oder in einer Reduktion der Sensitivität. Dies bedeutet unter Umständen eine falsch-negative Reaktion. Ein interner Standard zur Überprüfung der korrekten Isolierung von Nukleinsäure ist daher notwendig (WILSON 1997).
Um herauszufinden, ob etwaige Hemmstoffe in der Probe vorliegen oder ob die Matrize degradiert wurde, kann man eine Kontrolle durchführen. Eine im Vorfeld isolierte Nukleinsäure einer positiven Probe wird hierzu direkt in die zu untersuchende Probe zugegeben. Lässt sich keine Amplifikation dieser Positiv-Kontrolle nachweisen, sind Inhibitoren in der Matrizen-Suspension vorhanden. Diese müssen dann durch weitere Reinigungsschritte entfernt werden. Vor allem klinische Proben können diverse organische Inhibitoren enthalten, die sich meist nicht genau definieren lassen (WILSON 1997). Eine sorgfältige Probenaufreinigung ist in diesem Fall essentiell. Bei einigen Substanzen hängt es von der Konzentration ab, ob sie einen inhibierenden oder beschleunigenden Effekt auf die PCR haben (Tab.2.4).
2.2.4.2 Arbeitsumfeld