Zur Untersuchung der Spezifität wurden alle RT-PCRs und TaqMan real-time RT-PCRs mit sieben BVDV-Isolaten und sechs BDV-Isolaten getestet (Tabelle 4.1, 4.2).
Zwei der sieben konventionellen RT-PCRs (Protokoll 1, Protokoll 3) zeigten eine Kreuzreaktion mit anderen Pestivirusisolaten und sind damit für eine verlässliche CSF-Diagnostik ungenügend.
Protokoll 1 (CANAL et al. 1996) verwendet drei Primern (P1, P2, P3) in einer Reaktion (Multiplex) und amplifiziert einen Bereich aus der 5`NTR des Pestivirusgenoms. Für BVDV-/BDV-Nukleinsäuren entsteht so ein Fragment mit einer Länge von 200 bp (P1-P2), für CSFV-Nukleinsäuren ein Fragment mit einer Länge von 260 bp. Bei der Untersuchung der Spezifität konnte bei drei Isolaten (zwei BVDV-Isolate/ ein BDV-Isolat) kein
BDV/BVDV-5 Diskussion 126
spezifisches Amplifikat im Multiplexprotokoll nachgewiesen werden. Für die CSFV-Diagnostik von größerer Relevanz: drei von fünf CSFV-Isolaten wurden im Multiplexprotokoll nicht erkannt. Die verbleibenden zwei Isolate waren positiv, doch hatte das amplifizierte PCR-Fragment die falsche Länge, nämlich 260 bp und war damit BVDV/BDV-spezifisch. Bei der Untersuchung mit nur zwei Primern (P2, P3; CSFV-spezifisch) waren nur vier der eingesetzten fünf Isolate positiv. Allerdings waren auch fünf der sechs BDV-Isolate positiv. Eine Diskriminierung ist also auch mit dem einfachen (singleplex) Protokoll nicht möglich. Bei der Spezifitätsuntersuchung durch den Autor (CANAL et al. 1996) wurde nur das Multiplexprotokoll verwendet. Hierbei konnten 10 CSFV-, 23 BVDV- und zwei BDV-Isolate korrekt detektiert und diskriminiert werden. Die Tatsache, dass hier in keinem Fall gleichzeitig zwei spezifische Banden für CSFV und für BVDV/BDV in einem Lauf mit verschiedenen Pestivirusisolaten erzielt werden konnten, lässt auf eine inadäquate Etablierung des Multiplexprotokolls an die Laborbedingungen schliessen.
Es kam aber auch bei der Verwendung des rein CSFV-spezifischen, einfachen RT-PCR-Protokolls (zwei Primer) zu einer ungenügenden Diskriminierung der Pestivirusisolate; dies ist vermutlich auf ungeeignete Primer zurückzuführen. Das Protokoll ist für die CSF-Diagnostik nicht geeignet und wurde im weiteren Validierungsprozess nicht mehr verwendet.
Protokoll 3 (HARDING et al. 1996) amplifiziert zwischen den Primern HCV1 und HCV2 ein Fragment mit einer Länge von 507 bp aus der NS2-3 Region des CSFV-Genoms. Bei der Spezifitätsuntersuchung des Autors kam es bei vier Pestivirusisolaten (1 BVDV/3 BDV) zu einem positiven Ergebnis. Die Spezifität wurde durch den Autor (HARDING et al. 1996) mit sieben BVDV-Isolaten, jedoch ohne BDV-Isolate, überprüft. In dieser Untersuchung war keines der sieben BVDV-Isolate in der RT-PCR positiv. Bei den von HARDING et al. (1996) verwendeten BVDV-Isolaten handelte es sich vorrangig um engverwandte Feldisolate (HARDING et al. 1996). Die Kreuzreaktion dieser RT-PCR, vor allem mit den genetisch stärker mit CSFV verwandten BDV-Isolaten, ist daher auf eine unzureichende Diskriminierung der Primer zurückzuführen. Das Protokoll ist für eine verlässliche CSF-Diagnostik ungenügend und wurde im weiteren Validierungsprozess ebenfalls nicht mehr verwendet.
Im Gegensatz dazu konnten mit den verbleibenden fünf konventionellen Protokollen keine nicht-CSFV-Pestiviren nachgewiesen werden.
Auch beide TaqMan real-time RT-PCR-Protokolle erwiesen sich als spezifisch, da keines der 13 Isolate positiv war. Die in dieser Arbeit nachgewiesene hohe Spezifität der Protokolle spiegelt auch die Ergebnisse von MCGOLDRICK wieder, der die Spezifität des Protokolls anhand von acht BDV- und 15 BVDV-Isolaten untersuchte. Auch hier war kein Isolat positiv und es waren keine unspezifischen Reaktionen zu beobachten (MCGOLDRICK et al. 1998).
Die Aussage, ob ein Resultat als positiv zu werten war, erfolgte dort allerdings durch den
∆RQ-Wert einer Probe und nicht durch eine real-time Auswertung. Erst nach der
Untersuchung von 13 CSFV-Isolaten und 23 anderen Pestiviren wurde retrospektiv ein Cut-off Wert von über 4,00 definiert, bei dem eine Probe positiv ist (MCGOLDRICK et al. 1998).
Auch die hier angewendeten beiden TaqMan real-time RT-PCR-Protokolle zeigten trotz Verwendung von Panpesti-Primern (A11/A14) in beiden Enzymsystemen eine hohe Spezifität. Diese Spezifität ist also einzig und allein auf die TaqMan-Sonde zurückzuführen.
Weierhin sollte festgestellt werden, ob alle ausgewählten 52 CSFV-Isolate in den RT-PCRs mit den verschiedenen Protokollen positiv reagierten. Dazu wurden die Nukleinsäuren isoliert und, um die erfolgreiche Isolierung und RT zu kontrollieren, einer RT-PCR mit Protokoll 8 (VILCEK et al. 1994) unterzogen. Das Protokoll 8 amplifiziert mit den Primern 324 und 326 ein Fragment mit einer Länge von 288 bp aus der 5`NTR des Genoms aller bisher untersuchten Pestiviren (VILCEK et al. 1994, 1997), und hat durch eine hohe Sensitivität. Die Nachweisgrenze liegt bei 1 KID50/ml (RENSHAW et al. 2000). Alle Isolate der Gruppe A und alle Isolate der Gruppe B der 1. Passage waren im Panpesti-Protokoll positiv. Lediglich Isolat CSF 0422 (in der 1. Passage schwach positiv) war in der 4. Passage negativ. Dieses Isolat war auch in allen anderen RT-PCRs negativ. Es ist daher davon auszugehen, dass kein Virus in der Probe mehr vorhanden war.
Im Folgenden wurden die Nukleinsäuren der 52 Isolate mit den verbleibenden fünf konventionellen RT-PCRs untersucht. Bei nur zwei der fünf Protokolle (Protokoll 2 und 6) waren alle verwendeten Isolate in der 1. Passage positiv.
Mit Protokoll 4 waren 11, mit Protokoll 5 waren sieben und bei Protokoll 7 waren drei der 52 untersuchten Proben in der 1. Passage negativ (Tabelle 5.1). Es bestand keine Beziehung zu dem Genotyp oder Subtyp, da die nicht erkannten Isolate verschiedenen Genotypen und Subtypen angehörten. Ferner bestand auch keine Beziehung zu den vorher definierten Gruppen (Gruppe A, Gruppe B,). Nicht erkannte Isolate stammten im gleichen Verhältnis aus beiden Gruppen.
Im Gegensatz dazu konnte eine Beziehung zwischen dem Virustiter der Isolate und den negativen Ergebnissen für Protokoll 4 und 7 gezeigt werden. Alle Isolate mit einem Virustiter von über 102,5 KID50/ml waren in Protokoll 7 positiv, alle Isolate mit einem niedrigeren Titer waren negativ. Bei Protokoll 4 waren alle Isolate mit einem Virustiter von < 104,5 KID50/ml negativ. Eine Ausnahme war CSFV-Isolat CSF 0711, das einen Ausgangstiter von 103,5 KID50/ml besaß. Für Protokoll 5 konnte keine Beziehung zum Virustiter gefunden werden.
CSFV-Isolate mit niedrigem Titer wie z.B. CSF 0706 wurden positiv getestet, während Isolate mit höherem Titer (z.B. CSF 0512; Titer 104,5 KID50/ml) nicht erkannt wurden.
5 Diskussion 128
Tabelle 5.1: Übersicht der in den verschiedenen konventionellen RT-PCRs nicht detektiereten Isolate der Gruppen A und B (1. Passage) und der Genotypen.
CSF Genetische Protokoll
Nummer
Gruppe
Subgruppe Titer25
P08 P04 P05 P07
0414 A 2.3 101,7 + - + -
0420 B 2.2 104,5 + - + +
0422 B 2.1 102,5 (+) - (+) (+)
0512 B N.B.26 104,5 + - - +
0520 B 2.2 104,0 + - + +
0571 A 2.1 103,2 + - - +
0626 A N.B. 102,0 + - - -
0647 B 1.1 102,5 + - - +
0706 B 1 101,0 (+) - (+) -
0711 B N.B. 103,5 + + - +
0905 A 1.2 N.B. + + - +
0908 A N.B. N.B. + - + +
0910 A 1.1 N.B + - + +
0946 A N.B. N.B. + + - +
Isolate nicht detektiert: 0 11 7 3
+ = positiv; (+) = schwach positiv; - = negativ
Bei Protokoll 4 (KATZ et al. 1993) handelt es sich ursprünglich um ein nested RT-PCR-Protokoll mit den äusseren Primern gp 53 A und gp 53 D, sowie den inneren Primern Gp 53 B und Gp 53 C. Für die Untersuchung wurde nur das äussere Primerpaar verwendet, das ein Fragment mit einer Länge von 308 bp amplifiziert. Es wurde durch den Autor mit 36 CSFV-Isolaten verschiedener Herkunft untersucht. Alle Isolate waren in der einfachen RT-PCR (äusseres Primerpaar) und in der nested RT-PCR positiv (KATZ et al. 1993). Im Gegensatz dazu wurden rund 21 % der in dieser Arbeit untersuchten Isolate (11 von 52 Isolaten) nicht erkannt. Dies steht im Widerspruch zu den durch den Autor erzielten Ergebnissen. Die
25 KID50/ml
26 N.B. = Nicht bekannt
divergierenden Ergebnisse lassen sich nach den hier durchgeführten Untersuchungen durch die geringe Sensitivität des, nur mit dem äusseren Primerpaar durchgeführten RT-PCR-Protokolls, und nicht durch eine ungeeignete Spezifität der Primer erklären. Dafür spricht, dass alle Isolate, die der Autor eingesetzt hat, einen Titer von mindestens 106,0 KID50/ml besaßen (KATZ et al. 1993). Die hier untersuchten und nicht detektierten Isolate hatten hingegen einen Titer < 104,5 KID50/ml (siehe oben). Eine Verwendung des nested Protokolls (zwei Primerpaare) hätte evtl. eine Steigerung der Sensitivität erbracht. Dadurch würde aber auch die Gefahr einer Laborkontamination erhöht, weshalb das nested Protokoll nicht durchgeführt wurde (vgl. 5.1.1). Die These, dass Protokoll 4 eine geringe Sensitivität besitzt, wird durch die Untersuchungen von PATON (2000) unterstützt. Dieser zeigte in einem international durchgeführten PCR-Ringtest unter der Verwendung unterschiedlicher Probematerialien und Verdünnungsreihen, dass Protokoll 4, selbst im nested Protokoll, eine geringe Sensitivität besitzt (PATON et al. 2000a).
Das Protokoll 5 (WIRZ et al. 1993) amplifiziert zwischen den Primern HCV1 und HCV2 ein 478 bp langes Fragment aus der E2-Region des CSFV-Genoms. Das Protokoll wurde vom Autor an 19 RNAs, isoliert aus virushaltigem Zellkulturüberstand, und an 28 CSFV-RNAs, isoliert aus virushaltigem Organmaterial, untersucht. Alle CSFV-CSFV-RNAs, die aus virushaltigem Zellkulturüberstand isoliert wurden, waren positiv (WIRZ et al. 1993). Jedoch nur acht der 26 CSFV-Organproben ergaben in der RT-PCR ein positives Ergebnis. Der Versuch, den Titer der nicht erkannten Proben durch eine Passage in PK-15 Zellen zu erhöhen, führte nur teilweise zum Erfolg. 12 Isolate waren weiterhin in der RT-PCR negativ.
Der Autor folgerte aus diesen Ergebnissen, dass das Protokoll zwar eine hohe Spezifität (getestet an fünf BDV- und 15 BVDV-Isolaten), aber eine geringe Sensitivität aufweist (WIRZ et al. 1993). Bei der hier durchgeführten Untersuchung waren sieben der 52 getesteten CSFV-Isolate (13,5 %) negativ. Eine klare Aussage, ob es an der Sensitivität liegt, konnte nicht gemacht werden, da sowohl Isolate mit niedrigem Titer (CSF 0706, 101,0 KID50/ml) positiv waren, als auch Isolate mit hohem Titer (CSF 0512, 104,5 KID50/ml) negativ waren.
Eine andere Untersuchung zeigte ebenfalls, dass Protokoll 5 nur keine hohe Sensitivität besitzt. Einige in jener Untersuchung verwendete CSFV-Isolate waren ebenfalls negativ.
Auch hier konnte keine Beziehung zum Virustiter erstellt werden (PATON et al. 2000a).
Das Protokoll 7 (LOWINGS et al. 1996) amplifiziert zwischen den beiden Primern Gp 5 und Gp 6 ein Fragment mit einer Länge von 602 bp aus dem E2-Bereich des CSFV-Genoms. Es wurde als RT-PCR-Protokoll zur Sequenzierung von Teilen des E2-Bereichs des CSFV-Genoms im Rahmen der genetischen Typisierung entwickelt (PATON et al. 2000). Für diagnostische RT-PCRs wichtige Kriterien wie hohe Sensitivität und Spezifität spielen hierfür keine Rolle, da in der Regel auf Zellkultur angezüchtetes Virus verfügbar ist (LOWINGS et al. 1996). In der hier durchgeführten Untersuchung wurde gezeigt, dass sich die fehlende Detektion der Isolate (3) auf eine geringe Sensitivität zurückführen lässt.
5 Diskussion 130
Die Protokolle 4, 5 und 7 wurden nicht weiter validiert.
Auch mit den beiden TaqMan real-time Protokollen (two-tube/two-enzyme und one-tube/two-enzyme) wurden die 52 Isolate der 1. Passage detektiert. In dieser Untersuchung konnte bestätigt werden, dass die entstehende Fluoreszenz eines CSFV-Isolates abhängig ist von der Menge der hydrolysierten TaqMan-Sonden. Die Hydrolyse der TaqMan-Sonde ist wiederum proportional zur Komplementarität der Sonde zur Zielsequenz (KLEIN et al. 1999;
MCGOLDRICK et al. 1998). Das heisst, ist die Sonde vollständig identisch zur Zielsequenz, so braucht die Taq-Polymerase weniger Anläufe, um die Sonde zu spalten, als bei einer Sonde mit Fehlpaarungen und geringerer Komplementarität (vgl. Tab. 8.6). Ist der Anteil an Fehlpaarungen zu gross, oder liegen die Fehlpaarungen in der Mitte der Sonde, wie z.B. bei BDV- oder BVDV-Isolaten, so kann die Sonde gar nicht erst mit der Zielsequenz hybridisieren. Dieser Zusammenhang konnte von MCGOLDRICK gezeigt werden und wurde hier bestätigt. So haben CSFV-Isolate mit gleichem Ausgangstiter, wie z.B. CSF 0412 und CSF 0653 (beide 104,7 KID50/ml), unterschiedliche CT-Werte (CSF 0412 = 27,68; CSF 0653 = 31,84). MCGOLDRICK (1998) definiert in seiner Untersuchung retrospektiv einen Cut-off Wert von ∆RQ ≥ 4,00. Durch die Kalkulation eines Schwellenwertes durch die Software des real-time PCR-Gerätes war dies hier nicht mehr notwendig.
Bei der Untersuchung der CSFV-Isolate waren zwei der mituntersuchten Non Template Controls mit sehr hohen CT-Werten (> 38,81) positiv. Durch eine wiederholte Untersuchung bzw. eine Auswertung im Agarose-Gel konnte eine Kontamination ausgeschlossen werden.
Es ist daher davon auszugehen, dass es sich hierbei um eine spontane Hydrolyse (Autohydrolyse) der TaqMan-Sonde handelte. Sie ist auf die hohe Anzahl an Zyklen zurückzuführen. Auch andere Untersuchungen konnten zeigen, dass es bei zu hohen Zyklenzahlen zur spontanen Hydrolyse einer TaqMan-Sonde kommen kann27. Bisher gibt es darüber aber noch keine veröffentlichten Quellen.
Während der Untersuchung von Organproben mit den zwei verbleibenden konventionellen RT-PCRs kam es bei der RT-PCR nach Protokoll 6 zur Bildung von unspezifischen Banden, die zum Teil eine ähnliche Länge wie das spezifische Amplifikat hatten. Die spezifische Bande war nur unter Zuhilfenahme der positiven Kontrolle bzw. des Längenmarkers identifizierbar. Dies erschwert eine Beurteilung der Ergebnisse. Die unspezifischen Banden waren unter Umständen auf eine zu niedrige Annealingtemperatur der Primer (50 °C) zurückzuführen. Eine hohe Sensitivität spielte bei der Entwicklung dieses Sequenzierungs-RT-PCR-Protokolls keine Rolle, da in der Regel auf Zellkultur angezüchtetes Virus als Ausgangsmaterial dient (GREISER-WILKE et al. 1998). Die Tatsache, dass diese Banden nur in Organproben auftraten, lässt vermuten, dass sie auf zelluläre Komponenten des Ausgangsmaterials zurückzuführen sind.
27 Laut persönlicher Mitteilung von Frau T. Beckham, Hannover am 18. Juli 2003
Alle 15 Organproben waren in beiden TaqMan real-time RT-PCRs positiv. Eine klare Detektion ohne unspezifische Amplifikate ist somit auch bei dieser Art von Probenmaterial gewährleistet.
Die zwei konventionellen RT-PCR-Protokolle 2 und 6 wurden nach Abschluss der Validierung einer Optimierung unterzogen, indem zur Auswertung ein SYBR Green™ real-time Protokoll etabliert wurde. Dies bedeutet einen reduzierten Arbeits- und Zeitaufwand gegenüber einer konventionellen Auswertung. Zudem wird eine Kontamination der Proben und des Labors durch Wegfall der post-PCR Arbeiten stark gesenkt (HIGUCHI et al. 1993).
Danach wurde die SYBR Green™ real-time Auswertung der beiden Protokolle 2 und 6 ebenfalls validiert. Wie bei der konventionellen Auswertung wurde auch mit SYBR Green™
keines der 13 nicht-CSFV Pestivirusisolate erkannt. Eine spezifische Detektion ist also auch in der SYBR Green™ real-time Auswertung gewährleistet. Ferner entstanden bei der Untersuchung der Organproben auch in der SYBR Green™ real-time Auswertung des Protokolls 6 (trotz eines Hotstart-Protokolls) unspezifische Amplifikate. Sie waren als zweites Schmelzpunktmaximum (75°C bis 79,5°C) vor dem eigentlichen spezifischen Schmelzpunktmaximum (80°C bis 84°C) zu finden und ließen sich durch die anschließende Schmelzpunktanalyse klar vom spezifischen Produkt abgrenzen. Um eine ausschließliche Detektion des spezifischen Produktes zu gewährleisten, wurde die Temperatur, bei der die Fluoreszenz gemessen wurde, auf 80°C festgelegt. Artefakte sind im Gegensatz zum spezifischen Produkt bei dieser Temperatur dissoziiert und geben keine Fluoreszenz ab. Nach Modifikation des Fluoreszenzmesspunktes innerhalb des Thermoprofils wurde kein Anstieg der Fluoreszenz in der negativen Kontrolle mehr beobachtet. Die SYBR Green™ real-time Auswertung stellt einen sichereren Weg zur Diskriminierung von Primerdimern und spezifischem Amplifikat dar als die konventionelle Auswertung im Gel.
5.3.2 Sensitivität
Die Ermittlung der Nachweisgrenze erfolgte mit Hilfe einer RNA- und cDNA-Verdünnungsreihe des Referenzisolates CSF 0902 (Ausgangstiter 107,6KID50/ml), sowie mit einer cDNA-Verdünnungsreihe des Isolates CSF 0272 (Ausgangstiter 104,0 KID50/ml).
Für beide konventionellen RT-PCRs (Protokoll 2 und 6) konnte eine Nachweisgrenze für die RNA des Referenzisolates CSF 0902 von 103,6KID50/ml ermittelt werden. Rein theoretisch sollte mittels der RT-PCR ein Nachweis eines einzelnen DNA-Moleküls möglich sein (MÜLHARDT 2002). Die Nachweisgrenze müsste demnach ein Viruspartikel sein. Geht man davon aus, dass es sich um ein infektiöses Virion und nicht um ein defektes Partikel handelt (AOKI et al. 2001), müsste die Nachweisgrenze 100 KID50/ml betragen. Bei dieser Untersuchung lag die Nachweisgrenze mit 103,6 KID50/ml weitaus höher. Für die RNA-Isolierung wurde 1 ml des Zelllysats eingesetzt. Allerdings wurde nur ein Teil der gewonnenen RNA (1/15 für Protokoll 2 und 1/6 für Protokoll 6) in die RT-PCR eingesetzt.
Die ermittelten Nachweisgrenzen beziehen sich daher nur auf den Teil an eingesetzter RNA.
5 Diskussion 132
Die geringe Nachweisgrenze ist nicht auf eine ineffektive RT-PCR zurückzuführen, sondern auf Verluste der RNA während der RNA-Isolierung (SCHEIBNER 2000). Bestätigt wird diese Hypothese durch die Ergebnisse bei der Untersuchung zur Nachweisgrenze desselben CSFV-Isolats mittels einer cDNA-Verdünnungsreihe. Die Nachweisgrenze ist bei diesem Vorgehen nur noch von der RT-PCR und nicht mehr von der RNA-Isolierung abhängig (SCHEIBNER 2000). Bei der Untersuchung der cDNA-Verdünnungsreihe konnte für das Protokoll 2 eine Nachweisgrenze von 101 KID50/ml und für Protokoll 6 eine Nachweisgrenze von 100 KID50/ml ermittelt werden. Gerade bei geringeren RNA-Mengen kommt es bei der Isolierung der RNA mittels Silika-Säulen immer zum Verlust von RNA (SCHEIBNER 2000).
Bei der Untersuchung der Nachweisgrenze mit einer cDNA-Verdünnungsreihe des CSFV-Isolates CSF 0272 war Protokoll 2 100 mal sensitiver als Protokoll 6. Protokoll 2 ist generell sensitiver als Protokoll 6, vor allem, wenn man die eingesetzte Menge an RNA in Betracht zieht.
Um die Sensitivität der Protokolle 2 und 6 in der SYBR Green™ real-time Auswertung besser vergleichen zu können, wurde eine two-tube/two-enzyme RT-PCR mit einer gemeinsamen cDNA-Synthese durchgeführt. Die Ermittlung der Sensitivität zeigte, dass das Protokoll 2 mit SYBR Green™ sowohl für CSFV-Isolat 0902 als auch für CSFV-Isolat 0272 10fach sensitiver war als die konventionelle PCR. Mit Ausnahme der cDNA des Isolates 0902 war auch die SYBR Green™ Auswertung des Protokolls 6 sensitiver als die konventionelle Auswertung. Die gesteigerte Sensitivität der SYBR Green™ real-time Auswertung lässt sich wahrscheinlich auf das erhöhte Detektionsvermögen des Optikmoduls des real-time PCR Gerätes gegenüber der menschlichen Wahrnehmung einer Bande im Agarose-Gel zurückführen. Die Sensitivität der SYBR Green™ real-time PCR gegenüber der konventionellen PCR wird von verschiedenen Autoren kontrovers diskutiert. So postuliert BUSTIN (2000), dass SYBR Green™ RT-PCRs (und auch real-time PCR mit fluorogenen Sonden) eine höhere Sensitivität haben, als konventionelle PCRs. HIGUCHI (1993) behauptet, dass beide Auswertmethoden vergleichbar sensitiv sind.
Bei der Ermittlung der Sensitivität waren die TaqMan real-time RT-PCRs stets sensitiver als die Protokolle 2 und 6 sowohl in der konventionellen Auswertung im Agarose-Gel als auch in der SYBR Green™ real-time Auswertung. So war die TaqMan real-time RT-PCR z.B. bei der Untersuchung der Nachweisgrenze für die RNA des Referenzisolats CSF 0902 100fach (für das one-tube/two-enzyme Protokoll), bei der Untersuchung der Nachweisgrenze der cDNA des bei Isolat 0272 sogar 100 bis 1000fach sensitiver als die konventionellen RT-PCR-Protokolle 2 und 6 (Abb. 4.6).
Auch hier lässt sich der Sensitivitätsgewinn auf die Art der Detektion zurückführen. Bestätigt wird diese These durch folgende Ergebnisse: Wurde die RNA des Referenzisolates CSF 0902 (Ausgangstiter 107,6 KID50/ml) in log10-Verdünnungen in die one-tube/two-enzyme real-time RT-PCR eingesetzt, so konnte bis zu einer Verdünnung von 10-5 (entspricht 102,6 KID50/ml) ein positives Signal beobachtet werden. Wurden die real-time RT-PCR-Produkte nach der
Reaktion mittels Agarose-Gelelektrophorese ausgewertet, so war nur bis zu einer Verdünnung von 10-3 (104,6 KID50/ml) ein positives Ergebnis sichtbar.
Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass die TaqMan real-time RT-PCR als äquivalent oder sensitiver zu beurteilen ist als die Virusisolierung und die konventionelle einfache und nested RT-PCR (KEARNS et al. 2001; LEUTENEGGER et al. 1999; LOCATELLI et al.
2000; MCGOLDRICK et al. 1998, 1999; MONOPOEHO et al. 2000; SMITH et al. 2001;
VAN ELDEN et al. 2001). Diese These konnte in dieser Arbeit bestätigt werden.
Eine annähernd gleich hohe Sensitivität wie die TaqMan real-time RT-PCR hatte die SYBR Green™ real-time Auswertung der RT-PCRs mit den Protokollen 2 und 6. Der Gewinn an Sensitivität der TaqMan real-time RT-PCRs ist vermutlich auf die zusätzliche Hybridisierung der Sonde zurückzuführen. BARLIC-MAGANJA u. GROM (2001) konnten zeigen, dass eine zusätzliche Hybridisierung des PCR-Amplifikates 100fach sensitiver ist, als die konventionelle Auswertung durch Färbung der Banden im Agarose-Gel mit Ethidiumbromid.
Vergleichende Untersuchungen zur SYBR Green™ Auswertung gibt es leider noch nicht.
Durch diesen Sensitivitätsgewinn der TaqMan real-time RT-PCR kann auf ein nested PCR-Protokoll durch die Verwendung einer zusätzlichen Hybridisierungssonde verzichtet werden (BARLIC-MAGANJA u. GROM 2001).
Grundsätzlich hatten beide Enzymsysteme (One-tube/two-enzyme, two-tube/two-enzyme) eine nahezu identische Sensitivität. Eine Ausnahme hierfür stellten die Ergebnisse der Untersuchung der Nachweisgrenze der RNA des Isolates CSF 0902 dar. Welches Enzymsystem generell sensitiver ist, wird kontrovers diskutiert. GINZINGER (2002) und DORAK (2003) betonen, dass durch den Einsatz der gesamten cDNA in die nachfolgende PCR die one-tube/two-enzyme RT-PCR sensitiver ist als die two-tube/two-enzyme RT-PCR.
BATTALAGIA et al. (1998) sieht es wiederum als Nachteil, da der RT-Schritt auch viele für die PCR inhibierende Bestandteile enthalten kann (Reverse Transkriptase, RT-Puffer etc.), die komplett in die PCR überführt werden und die Sensitivität verringern. Das TaqMan one-tube/two-enzyme real-time Protokoll ist dem two-one-tube/two-enzyme Protokoll vorzuziehen, da es bei gleicher Sensitivität ein weiter reduziertes Kontaminationsrisiko sowie reduzierten Arbeits- und Zeitaufwand aufweist.
Die Sensitivität der TaqMan real-time RT-PCR wurde auch mit Hilfe rekombinanter DNA-
Die Sensitivität der TaqMan real-time RT-PCR wurde auch mit Hilfe rekombinanter DNA-