3.2 M ETHODEN
3.2.5 RT-PCR
Acht PCR-Protokolle wurden zur Untersuchung herangezogen. Ihre Durchführung erfolgte nach den Angaben in den Veröffentlichungen (vgl. Tab. 3.1).
Nachfolgende Modifikationen der vorgegebenen Parameter erfolgten nur bei dem Protokoll 4 (KATZ et al. 1993). So wurde das nested PCR-Protokoll von KATZ auf eine einfache PCR verkürzt, indem nur die äußeren Primer verwendet wurden. Wurde in den veröffentlichten Protokollen keine Aussagen zur Durchführung der Reversen Transkription gemacht (Protokoll 4, Protokoll 7), so wurde das laboreigene optimierte RT-Protokoll verwendet (Protokoll 6, GREISER-WILKE et al. 1998). Die Protokolle 2, 4 und 5 benutzten zusätzlich zu den spezifischen Primern noch Kontrollprimer zur Amplifikation aller verwendeten Pestiviren (Panpesti-Primer). Diese Primer wurden in dieser Arbeit nicht benutzt. Stattdessen wurde für alle Isolate das Panpesti-PCR-Protokoll nach VILCEK (Protokoll 8) durchgeführt.
Die Sequenzen der verwendeten Primer finden sich im Anhang unter 9.5.1.
Tabelle 3-1: Übersicht der verwendeten RT-PCR-Protokolle
Bezeichnung im Folgenden
Referenz
Genom-region
Amplikongrösse (bp) Spezifische Protokolle
Protokoll 1 CANAL et al. 1996 5’ NTR 200
Protokoll 2 DIAZ DE ARCE et al.
1998
NS5B 174 Protokoll 3 HARDING et al. 1996 NS2-3 507
Protokoll 4 KATZ et al. 1993 E2 308 (172)7
Protokoll 5 WIRZ et al. 1993 NS5A 478
--- SANDVIK et al. 1997 5’ NTR 280-284 (133)8 RT-PCRs für Genotypisierung
Protokoll 6 GREISER-WILKE et al., 1998
5’ NTR 402
Protokoll 7 LOWINGS et al. 1996 E2 680
Panpesti-PCR
Protokoll 8 VILCEK et al. 1994 5`NTR 288
3.2.5.1 Protokoll 1 (nach CANAL et al. 1996)
Das Protokoll nach CANAL (1996) amplifiziert einen Bereich im 5`-NTR des viralen Genoms. Es handelt sich um ein Multiplex-Protokoll und macht Gebrauch von drei Primern (P1, P2, P3; 9.5.1.1), die gleichzeitig in die RT-PCR eingesetzt werden. Der Primer P1 ist BDV-/BVDV-spezifisch, der Primer P2 ist CSFV-spezifisch. Bei Primer P3 handelt es sich um einen Panpesti-Primer. Für BVDV/BDV-Isolate entstand so ein Fragment von 200 bp Länge, für CSFV-Isolate ein Fragment von 260 bp Länge (Abb. 3.1).
7 Nested Protokoll nicht durchgeführt
8 Protokoll nicht durchgeführt
3 Eigene Untersuchungen 74
Abbildung 3-1 Übersicht über die amplifizierten Fragmente im Protokoll 1 (Multiplex)
Die Reverse Transkription erfolgte in einem 20 µl Ansatz, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM jeden der vier dNTPs, 2,5 µM des Primers P3 und 10 U der M-MLV Reversen Transkriptase enthielt (9.2.1, 9.4). Dieser Mastermix wurde mit 2 µl eluierter RNA versetzt und 30 min bei 37 °C im Thermocycler (9.6.2) inkubiert.
Die gesamten 20 µl aus der cDNA-Synthese wurden nun in einer 100 µl PCR mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,8 mM dNTPs, 0,5 µM der drei Primer (P1, P2, P3; vgl. 9.5.1.1) oder alternativ nur zwei Primer (P3 + P1 oder P2) und 0,8 U Taq-Polymerase gemischt (9.2.2). Das Reaktionsgemisch wurde mit 100 µl Mineralöl überschichtet, in den Thermocycler überführt und folgendes Programm gestartet:
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen
94 °C 3 min 1
94 °C 1 min 65°C 1 min 72 °C 1 min
35
CSFV-Amplikon 200 bp
5`NTR des CSFV-Genoms
BVDV/BDV-Amplikon 260 bp
P1 P2 P3
3.2.5.2 Protokoll 2 (nach DIAZ DE ARCE et al.1998)
Das Protokoll nach DIAZ DE ARCE (1998) amplifiziert ein Fragment mit 174 bp Länge im NS5B-Bereich des CSFV-Genoms. Verwendet wurden die Primer CSFV-1 (Sense-Primer) und CSFV-2 (Antisense-Primer) (vgl. 9.5.1.2).
Zur Durchführung dieses Protokolls wurden 2 µl der eluierten RNA mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs, 0,01% Gelatine, 40 U RNase-Inhibitor, 200 ng des Antisense-Primers und 10 U M-MLV Reverse Transkriptase mit einem Gesamtvolumen von 100 µl bei einer Temperatur von 42 °C für 30 min im Thermocycler inkubiert (9.2.1, 9.2.2, 9.4). Die Reaktion wurde danach auf 4 °C abgekühlt und 200 ng des Sense-Primers sowie 2,5 U Taq-Polymerase hinzugegeben. Anschließend wurde folgendes Programm gestartet:
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen
94 °C 2,5 min 1
94 °C 15 sec 58 °C 30 sec 72 °C 30 sec
35
3.2.5.3 Protokoll 3 (nach HARDING et al. 1996)
Das Protokoll 3 nutzt die NS 2-3 Region des CSFV-Genoms als Zielregion. Die Primer HCV-1 und HCV-2 grenzen ein Fragment mit einer Länge von 507 bp ein (9.5.HCV-1.4).
Die Reverse Transkription erfolgte in einem 20 µl Ansatz. 4 µl der RNA wurden mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,5 mM dNTPs, 500 ng Random Primer, 40 U RNase Inhibitor, 1 mM DTT und 200 U der M-MLV Reversen Transkriptase in einem 0,5 ml Reaktionsgefäß gemischt und mit 50 µl Mineralöl überschichtet (9.2.1, 9.2.2, 9.4). Dieses Reaktionsgemisch wurde dann für 1 h bei 37 °C inkubiert, danach wurde die Reverse Transkriptase bei 95 °C für 5 min inaktiviert und das Reaktionsgemisch dann bei 80 °C gehalten. Im Folgenden wurde das Reaktionsvolumen auf 50 µl durch die Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5 mM dNTPs, 50 pmol HCV1 und HCV 2 sowie 1,25 U Taq-Polymerase erweitert (9.2.1, 9.2.2, 9.4). Das PCR-Thermoprofil sah folgendermaßen aus:
3 Eigene Untersuchungen 76
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen 94 °C 1 min
59 °C 1 min 72 °C 2 min
40
3.2.5.4 Protokoll 4 (nach KATZ et al. 1993)
Das Protokoll nach KATZ (1993) ist ein nested PCR-Protokoll, d.h. zwei Primerpaare werden in zwei unterschiedlichen PCR-Schritten verschachtelt, um eine höhere Sensitivität zu erbringen. Die erste Runde der PCR amplifiziert ein Fragment mit einer Länge von 308 bp aus dem CSFV-Genom, welches für das Glykoprotein E2 kodiert. In der darauf folgenden zweiten Runde der PCR wird aus dem bereits vervielfältigten Fragment ein weiteres Fragment mit einer Länge von 178 bp amplifiziert. Für diese Untersuchungen wurde nur die erste Runde der PCR mit den Primern gp53 A und gp53 B durchgeführt (vgl. 9.5.1.5).
Für die cDNA-Synthese lagen keine Angaben vor, daher erfolgte der RT-Schritt mit spezifischen Primern nach einem laboreigenen optimierten Protokoll. Für die PCR-Reaktion lagen ebenfalls keine genauen Angaben über die Konzentration der Reaktionskomponenten vor. Es wurde daher ausgehend von dem Standard-Protokoll das PCR-Protokoll optimiert.
Als Reaktionsvolumen wurde ein 50 µl Ansatz gewählt. 10 µl der vorher synthetisierten cDNA wurden dann mit 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 75 mM MgCl2, 0,8 mM dNTPs, 25 pmol jedes Primers sowie 1,25 U Tth-Polymerase gemischt und bei folgendem Thermocycler-Programm inkubiert (9.2.1, 9.2.2, 9.4):
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen 94 °C 1 min
54 °C 1 min 72 °C 2 min
40
3.2.5.5 Protokoll 5 (nach WIRZ et al. 1993)
Das Protokoll nach WIRZ (1993) amplifiziert zwischen den Primern HCV1 und HCV2 (vgl.
9.5.1.8) ein Fragment von 478 bp aus der E2-Region des CSFV-Genoms.
Zur Durchführung der Reversen Transkription wurden 2,5 µl der eluierten RNA mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 2 mM dNTPs und 20 µM des Antisense-Primers HCV-2 in einem Gesamtvolumen von 40 µl mit einander gemischt (9.2.1, 9.2.2, 9.4), für 5 min bei 90 ºC inkubiert und danach sofort auf Eis gestellt. Es wurden dann 10 U RNase Inhibitor und 50 U M-MLV RT zu dem Reaktionsansatz addiert und das ganze bei 37 ºC für 1 h inkubiert. Nach Abschluss der Inkubationsphase folgte der PCR-Schritt. Zu diesem Zweck wurden 20 µM des Sense-Primers HCV-2, sowie 0,5 U Taq-Polymerase in einem Volumen von 5 µl zugegeben und mit 40 µl Paraffinöl überschichtet. Nach Überführung in den Thermocycler wurde folgendes Programm gestartet:
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen 95 °C 15 sec
62 °C 1 min 72 °C 1 min
40
3.2.5.6 Protokoll 6 (nach GREISER-Wilke et al. 1998)
Das PCR-Protokoll nach GREISER-WILKE (1998) amplifiziert ein Fragment im 5`-NTR des viralen Genoms mit einer Länge von 421 bp (vgl. 8.5.1.3). Es handelt sich hierbei um ein Protokoll zur Sequenzierung im Rahmen der genetischen Typisierung.
Der RT-Schritt erfolgte nach einem laboreigenen optimierten Protokoll (GREISER - WILKE 1995; optimiert durch SCHEIBNER 2000) in einem 40 µl Reaktionsansatz in 0,5 ml-Reaktionsgefäßen. Dafür wurden als Mastermix-1 6 µl der eluierten RNA mit 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs und sterilen Wasser in einem Gesamtvolumen von 32 µl gemischt (9.2.1, 9.2.2, 9.3.6, 9.4) und bei 70 °C für 5 min inkubiert und danach sofort wieder in ein Eisbad gestellt. Nach dem Abkühlen wurde der Mastermix 1 mit 8 µl des Mastermix-2 gemischt, der 0,1 mM DTT, 0,4 µg Hexamere, 0,5 µl RNase Inhibitor sowie 80 U Reverse Transkriptase beinhaltete. Die letztgenannten Komponenten wurden während der Inkubationszeit als Mastermix 2 vorgemischt. Die Inkubation der Probe im Thermocycler erfolgte nach dem folgenden Thermoprofil:
3 Eigene Untersuchungen 78
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen
22 °C 5 min 1
37 °C 15 min 1
42 °C 30 min 1
99 °C 5 min 1
4 °C ∞ 1
Für die PCR mit einem Reaktionsvolumen von 50 µl wurden 10 µl der synthetisierten cDNA mit 20 mM Tris-HCl (pH 9,0), 8 mM (NH4)SO4, 0,4 mM dNTPs, 1,25 U Hotstart Taq-Polymerase, 1 mM MgCl2, 1 µM Primer UP-1 und UP-2 sorgfältig in einem 0,5 ml Reaktionsgefäß gemischt (9.2.1, 9.2.2, 9.4, 9.6.2). Im Thermocycler wurde dann folgendes Temperaturprofil eingestellt:
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen 94 °C 45 sec
58 °C 1 min 72 °C 1 min
35
3.2.5.7 Protokoll 7 (nach LOWINGS et al. 1996)
Das Protokoll nach LOWINGS (1996) dient der Sequenzierung eines Fragmentes des E2-Genombereichs des CSFV im Rahmen von Untersuchungen der genetischen Typisierung.
Zwischen den Primern GP-5 und GP-6 wird ein Fragment mit der Länge von 602 bp amplifiziert (vgl. 9.5.1.6). Für die cDNA-Synthese lagen keine Angaben vor. Deshalb erfolgte die Reverse Transkription nach dem laboreigenen Protokoll (siehe Protokoll 6).
Für die PCR-Reaktion wurden in einem 0,5 ml Reaktionsgefäß 10 µl der synthetisierten cDNA vorgelegt. In einem Gesamtvolumen von 40 µl wurden nun 0,4 mM dNTPs, 50 mM Tris, 75 mM KCl, 1,25 U Tth-Polymerase, 2 mM MgCl2, und 50 pmol des Primers GP-5 und GP-6 hinzu addiert und vorsichtig gemischt (9.2.1, 9.2.2, 9.4). Danach wurde der Reaktionsansatz in den Thermocycler überführt und folgendes Programm gestartet:
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen 45 °C 45 sec
58 °C 1 min 72 °C 1 min
35
72 °C 5 min 1
3.2.5.8 Protokoll 8 (nach VILCEK et al. 1994)
Bei der PCR nach VILCEK (1994) wird ein Fragment mit einer Länge von 288 bp aus dem 5`NTR Bereich des viralen Genoms der Pestiviren amplifiziert (vgl. 9.5.1.7). Die Primer 324 (Sense) und 326 (Antisense) sind pestivirus-spezifisch.
Für die Synthese der cDNA wurden 2 µl der gewonnenen RNA mit 1 µl (0,02 U) Random Hexamere, 5 µl DNase- und RNase-freiem Wasser gemischt, bei 65 °C für 5 min inkubiert und danach sofort für 5 min auf Eis gekühlt. Danach erfolgte eine Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 8,4), 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 1 mM DTT, 12 U M-MLV Reverse Transkriptase und 2,5 mM von jedem dNTP, so dass ein Gesamtvolumen von 25 µl resultierte (9.2.1, 9.2.2, 9.4). Das Reaktionsgemisch wurde für 1,5 h bei 37 °C inkubiert und dann entweder sofort für die PCR-Reaktion genutzt oder bei -20 °C gelagert.
Die PCR-Reaktion wurde in einem 50 µl Reaktionsansatz durchgeführt. zwei µl der synthetisierten cDNA wurden dafür mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 mg Gelatine, 1 mM des Primers 324 und 326, 1 U Taq-Polymerase sowie 2,5 mM jedes dNTPs vorsichtig vermischt (9.2.1, 9.2.2, 9.4). Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 30 µl Parafinöl überschichtet und bei folgendem Thermoprofil im Thermocycler inkubiert:
Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen 95 °C 1 min
56 °C 1 min 72 °C 1 min
35
3 Eigene Untersuchungen 80
3.2.5.9 BDV-spezifische/BVDV-spezifische PCR
Die 52 CSFV-Isolate wurden auf Kontaminationen mit BVDV oder BDV untersucht. Dazu wurden die BDV-spezifische RT-PCR nach VILCEK und PATON (2000), sowie die BVDV-spezifische RT-PCR nach SANDVIK (1997) nach Angaben der Autoren durchgeführt.