Entwicklung einer oral applizierbaren DNA-Vakzine gegen das Virus der Klassischen Schweinepest -
vorrangig zum Einsatz beim Schwarzwild
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Christiane Linne
aus Laatzen Hannover 2003
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. L. Haas
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Leibold
Tag der mündlichen Prüfung: 27. November 2003
Diese Arbeit wurde von der Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung gefördert;
Projekt Nr. 99HS018.
Meinen Eltern – in Liebe und Dankbarkeit
So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig, man muss sie für fertig erklären, wenn man nach Zeit und Umständen
das möglichste getan hat.
(J. W. Goethe, Italienische Reise, 16. März 1787)
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
172. LITERATURÜBERSICHT
202.1. CHARAKTERISIERUNG DES VIRUS DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST
(KSPV) 20
2.1.1. Taxonomie 20
2.1.2. Struktur und physikalische Eigenschaften des Virions 20
2.1.3. Genom und virale Proteine 21
2.2. DIE KLASSISCHE SCHWEINEPEST 24
2.2.1. Infektionsbiologie und Erkrankung 24
2.2.1.1. Pathogenese und klinischer Verlauf der KSP beim Hausschwein 25 2.2.1.2. Pathogenese und klinischer Verlauf der KSP beim Wildschwein 27 2.2.1.3. Die Pathologie der KSP bei Haus- und Wildschwein 28 2.2.1.4. Die Immunologie der KSP bei Haus- und Wildschwein 28 2.2.2. Laboratoriumsdiagnose - direkter und indirekter Nachweis 29 2.2.3. Verbreitung und Bekämpfung der Klassischen Schweinepest 30 2.2.3.1. Globale Verbreitung der KSP (ohne Europa) 30
2.2.3.2. Verbreitung der KSP in Europa 31
2.2.3.3. Die Situation in Deutschland 31
2.2.4. Bekämpfungsstrategien in der Europäischen Union 32
2.2.4.1. Vakzineentwicklung 32
2.2.4.2. Problematik der Vakzinierung und Regelungen innerhalb der EU 33
2.2.5. Die Bekämpfungsstrategien der KSP beim Wildschwein, sowie deren
Vor- und Nachteile 34
2.2.5.1. Die Bejagung 34
2.2.5.2. Verstärkte Aufklärung und Fütterungsbeschränkung 35
2.3. DNA-IMMUNISIERUNG 39
2.3.1. Einführung 39
2.3.2. Vor- und Nachteile 42
2.3.3. Bakterien als Carriersysteme für DNA-Vakzinen 44 2.3.3.1. S. typhimurium als Carrier für DNA-Vakzinen 46
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN
493.1. MATERIALIEN 49
3.1.1. Schweine 49
3.1.2. Mäuse 49
3.1.3. Zellen, Bakterien, Plasmide, Virusstämme, Virusantigen & Seren 49
3.1.3.1. Zellen 49
3.1.3.2. Bakterien 50
3.1.3.3. Plasmide 51
3.1.3.4. Viren 52
3.1.3.5. Antiseren und monoklonale Antikörper (mAk) 53
3.1.3.6. Seren 54
3.1.3.7. Impfstoffe 54
3.1.3.8. Übersicht über die im Virus-Challenge-Versuch eingesetzten
Salmonellenkonstrukte in den Tiergruppen 55
3.1.3.9. Sonstige Materialien 55
3.2. METHODEN 56
3.2.1. Versuchstiere 56
3.2.1.1. Haltung der Mäuse 56
3.2.1.2. Euthanasie der Mäuse, Gewinnung der primären
Peritonealmakrophagen und Durchführung des DNA-Transfers von S. typhimurium aroA SL 7207 (pSecTag2AE2) in
Mäusemakrophagen in vitro 56
3.2.1.3. Haltung der Schweine 57
3.2.1.4. Serumgewinnung beim Schwein 58
3.2.1.5. Immunisierung der Schweine 58
3.2.1.6. Durchführung der Laparotomie I (Schwein) 59 3.2.1.7. Durchführung der Laparotomie II (Schwein) 59 3.2.1.8. Euthanasie und Entnahme der porcinen Gewebeproben 60 3.2.1.9. Euthanasie und Gewinnung der Alveolarmakrophagen beim
Schwein 60 3.2.1.10. Infektion der Schweine mit KSPV und klinische Beobachtung 61
3.2.2. Zellkultur 61
3.2.2.1. Anzucht und Passagieren der PK (15) A-Zelllinie 61 3.2.2.2. Anzucht und Passagieren der cos7- Zelllinie 62
3.2.3. Methoden beim Umgang mit Salmonella typhimurium aroA SL 7207 63 3.2.3.1. Einfrieren und Auftauen von Bakterien 63 3.2.3.2. Anzucht der Salmonellen - auch für die orale bzw. intraabdominale
Applikation 63 3.2.3.3. Test der Identität der eingesetzten Salmonellen 64
3.2.3.4. Markierung von S. typhimurium aroA SL 7207 mit Fluorescein-
Isothiocyanat (FITC) 65
3.2.3.5. Herstellung elektrokompetenter Salmonellen 65 3.2.4. Methoden zur Herstellung des E2-Konstruktes 66
3.2.4.1. Qiagen Methode 66
3.2.4.2. HiSpeed Plasmid Midi Kit® 67
3.2.4.3. Agarosegelelektrophorese 68
3.2.4.4. Gewinnung der Virus-cDNA zur E2-Amplifikation mittels PCR 69 3.2.4.4.1. Isolierung der Virus-RNA mit dem RNeasy Mini Kit® (Qiagen) 69
3.2.4.4.2. Herstellung von cDNA aus Virus RNA 70 3.2.4.5. Herstellung der DNA-Fragmente und Klonierung 71 3.2.4.5.1. Amplifikation des E2-Proteins mittels PCR 71 3.2.4.5.2. Spaltung mit Restriktionsendonukleasen 73 3.2.4.5.3. Aufreinigung der DNA nach dem Restriktionsverdau mit QIAquick
Nucleotide Removal Kit® 73
3.2.4.5.4. Spaltung des E2-Amplifikates 74
3.2.4.5.5. Ligation von pCMV mit dem E2-Amplifikat 74
3.2.4.5.6. Auswahl der positiven Klone 75
3.2.5. Sequenzierung 75
3.2.5.1. Herstellung des Sequenziergels 76
3.2.5.2. Durchführung der Sequenzierreaktion 76
3.2.5.3. Sequenzvergleich 78
3.2.5.4. Primersequenzen 79
3.2.6. Elektroporation 79
3.2.7. Identifikation positiver Salmonellenklone 80 3.2.8. Methoden zum Nachweis der E2-Expression 81
3.2.8.1. Proteinnachweis 81
3.2.8.1.1. SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese 81 3.2.8.1.2. Protein-Transfer auf eine Membran (Western Blot) 82
3.2.9. Transfektion 83
3.2.9.1. Fixierung von Zellen, die mit pCMVGFP transfiziert wurden 84 3.2.9.2. Peroxidase-Linked-Assay (PLA) mit Anti-BVD-Konjugat nach Hitze-
bzw. Aceton-Methanol Fixierung 84
3.2.10. Methoden beim Umgang mit den Viren 85
3.2.10.1. Virusvermehrung und -ernte 85
3.2.10.2. Virustitration 86
3.2.10.3. Virusisolierung 87
3.2.10.4. Virusantigennachweis mittels direkter und indirekter
Immunperoxidase-Färbung 88
3.2.10.5. Neutralisationstest 90
3.2.10.6. ELISA 92
3.2.11. Methoden zum Nachweis der zellulären Immunantwort 93 3.2.11.1. Änderung der Leukozytenfraktionen im peripheren Blut während des
Challenge Versuches 93
3.2.11.1.1. Durchflußzytometrie 93
3.2.11.1.2. Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im peripheren Blut 95
3.2.11.1.3. Bestimmung der Zellzahl 96
3.2.11.1.4. Isolierung der PBMC für die durchflußzytometrische Messung 96 3.2.12. Aufarbeitung des Gewebes (Kryoschnitte) 98 3.2.13. Nachweis der FITC-markierten Salmonellen im Darmgewebe 98 3.2.14. Nachweis des E2-Proteins mit AntiBVD-FITC 98 3.2.15. Nachweis des Plasmids pCMVß im Darmgewebe 99 3.2.15.1. DNA Isolierung aus dem Gewebe mit DNAzol 99 3.2.16. Nachweis des green fluorescent protein (GFP) im Darmgewebe 101
4. ERGEBNISSE
1024.1. HERSTELLUNG DER EXPRESSIONSPLASMIDE 102
4.1.1. Herstellung von pCMVE2 102
4.1.2. Überprüfung der korrekten Ligation von E2 in pCMV 102 4.2. NACHWEIS DER TRANSIENTEN EXPRESSION IN ZELLKULTUR 104
4.2.1. Nachweis mittels PLA 104
4.2.2. Nachweis mittels Western Blot 105
4.3. UNTERSUCHUNGEN IN DER MAUS 106 4.3.1. Transfer und Expression der Plasmide aus S. typhimurium aroA SL
7207 in die murinen Makrophagen 106
4.4. UNTERSUCHUNGEN IM SCHWEIN 108
4.4.1. Transfer der Plasmide aus S. typhimurim aroA SL 7207 in die
porcinen Makrophagen 108
4.4.2. Invasion von S. typhimurium aroA SL 7207 in das jejunale und ileale
Darmepithel 110 4.4.3. Orale Applikation von S. typhimurium aroA SL 7207 transformiert mit
pCMVß 111
4.4.4. Transfer der Plasmide 113
4.4.5. Transfer und Proteinexpression von S. typhimurium aroA SL 7207
(psecTag2AE2) nach Injektion in intestinale Loops 115 4.4.6. Untersuchung auf die Induktion einer humoralen und/oder
zellvermittelten Immunantwort nach oraler Applikation von
transformierten S. typhimurium 116 4.4.6.1. Untersuchung auf Antikörper gegen S. typhimurium 116
4.4.6.2. Induktion einer humoralen Immunantwort 117 4.4.7. Untersuchung auf das Vorliegen eines ‚priming-effects’ 117
4.4.8. Virus-Challenge 119
4.4.8.1. Untersuchung der Schutzwirkung der plasmidtransformierten
Salmonellenvakzine gegen CSFV-Belastungsinfektion 119 4.4.8.2. Untersuchung auf die Bildung von Antikörpern gegen
S. typhimurium 119
4.4.8.3. Das klinische Bild 120
4.4.8.4. Entwicklung der Gesamtleukozytenzahlen im peripheren Blut unter
der CSFV-Belastungsinfektion. 125
4.4.8.5. Nachweis neutralisierender Antikörper 129 4.4.8.6. Isolierung von infektiösem Virus aus peripheren Blutleukozyten 132 4.4.8.7. Untersuchung der Veränderungen in der B- und T-
Lymphozytenpopulationen während der Belastungsinfektion 132
5. DISKUSSION
1495.1. EINLEITUNG 149
5.2. FUNKTIONSSTUDIEN VON VEKTOR UND CARRIERSYSTEM IN VITRO 150 5.3. FUNKTIONSSTUDIEN VON VEKTOR UND CARRIERSYSTEM IN VIVO 152
5.4. AUSBLICK 162
6. ZUSAMMENFASSUNG
1647. VERZEICHNIS DER LITERATUR
1708. ANHANG
1868.1. ZUSAMMENSETZUNG DER VERWENDETEN MEDIEN UND REAGENZIEN 186
8.1.1. Zellkulturmedien 186
8.1.2. Medien für die Bakterienkulturen 187
8.1.3. Reagenzien 188
8.1.4. Lösungen 191
8.1.5. Antibiotika 195
8.2. KOMMERZIELL ERHÄLTLICHE SYSTEME 195 8.3. REAGENZIEN FÜR DIE PCR 196 8.4. SONSTIGE CHEMIKALIEN, ZUSÄTZE & ENZYME 197 8.5. GERÄTE UND GEBRAUCHSGEGENSTÄNDE 199
8.5.1. Geräte Isolierstation 199
8.5.2. Verbrauchsmittel Isolierstation 201
8.5.3. Geräte Hauptlabor 202
8.5.4. Verbrauchsmittel Hauptlabor 207 8.5.5. FACS Gerät (Arbeitsgruppe Immunologie, TiHo) 208
8.6. REZEPTUR FÜR EIN GROßES SAMMEL- UND TRENNPOLYACRYLAMIDGEL 209
8.7. DATEN UND GRAFIKEN 210
8.7.1. Entwicklung der Körpertemperatur 210
8.7.2. Entwicklung der Gesamtleukozytenzahlen (in G/l) 211 8.7.3. Entwicklung der IgM+-Subpopulation (G/l) 212 8.7.4. Entwicklung der CD8+-Subpopulation (G/l) 213 8.7.5. Entwicklung der CD4+-Subpopulation (G/l) 214 8.7.6. Entwicklung der Granulozytenpopulation (G/l) 215 8.7.7. Entwicklung der monozytoiden Zellpopulation (G/l) 219
8.7.8. Entwicklung des Verhältnisses von CD4+/CD8+ 223 8.7.9. Entwicklung des Antikörpertiters unter der Belastungsinfektion mit
CSF 0634 227
8.8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 228 8.9. TABELLENVERZEICHNIS 229
9. EIN BESONDERER DANK GEBÜHRT...
231Verzeichnis der Abkürzungen
Abb. Abbildung abs. absolut
al. alli (Latein: andere)
AEC 3-Amino-9-ethylcarbazol Amp. Ampicillin
A. bidest. Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser ATCC American Type Culture Collection, amerikanische
Sammlung von Zellkulturen und Mikroorganismen A. tridest. Aqua tridestillata, dreifach destilliertes Wasser
ß beta
ß-gal ß-Galaktosidase Bp Basenpaare
BDV Border Disease Virus
BVD Bovine Virusdiarrhoe
bzw. beziehungsweise ca. circa
CD cluster of differentiation, Differenzierungscluster;
Gruppen monoklonaler Antikörper, die dasselbe Zelloberflächenmolekül erkennen
CO2 Kohlenstoffdioxid
CSFV classical swine fever virus, Virus der Klassischen Schweinepest
Cy Cyanine, Farbstoff zur Fluoreszenz-Markierung DEAE Diethylaminoethanol
d.h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dpi days post infection, Tage nach der Infektion dpv days post vaccination, Tage nach der Impfung
E. coli Escherichia coli
EDulb EMEM modifiziert nach Dulbecco und Freeman
EDTA Ethylendiamintetraacetat-Dinatriumsalz ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay;
Enzymgekoppelter Immuntest
serologischer Test, bei dem gebundene Antigene oder Antikörper mit Hilfe eines gekoppelten Enzyms nachgewiesen werden
EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
EU Europäische Union F Farad
f. folgende ff. fortfolgende Fa. Firma
FITC Fluoreszein-Isothiocyanat G Giga
g Erdanziehungskonstante Gr. Granulozyten
HCl Salzsäure
H2O2 Wasserstoffperoxid
h hora (Latein: Stunde)
IgM Immunglobulin M
i.m. intramuskulär Kat. Katalog Kb Kilobasen KDa Kilodalton KID50 mittlere kulturinfektiöse Dosis
KSPV Virus der Klassischen Schweinpest l Liter L. Listeria
LB Lucia Betrani
log2 Zweierlogarithmus log10 Zehnerlogarithmus
µ mikro (x10-6)
m milli (x10-3)
M molar mA Milliampere
mAK monoklonaler Antikörper
MHC major histocompatibility complex, Hauptgewebe- verträglichkeitskomplex min Minute
N Normalität, H+ bzw. OH --Ionenkonzentration in mol/l NaCl Natriumchlorid
nm Nanometer Nr. Nummer NS-Protein Nichtstrukturprotein
OD optische Dichte Ω Ohm
ori origin of replication; DNA-Sequenz in Plasmiden, die als Replikationsstartpunkt dient
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS Phosphat gepufferte Salzlösung
PCR polymerase chain reaction,
Polymerasekettenreaktion p.i. post infectionem, nach Infektion PK "porcine kidney", Schweinenieren
PLA Peroxidase-Linked-Assay; serologischer Test mit einem Peroxidase-gekoppelten Enzym
PO Peroxidase rel. relativ
RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RPE R-Phycoerythrin, Fluoreszenzfarbstoff
rpm rounds per minute,s.a. UPM
RT reverse Transcriptase
S. Salmonella s. siehe
SDS Natrium(sodium)dodecylsulfat sek. Sekunde
sog. sogenannt Tab. Tabelle
TEMED N',N',N',N'-Tetramethylethylendiamin Tris Trishydroxymethylaminomethan U "unit", (Enzymeinheit)
UPM Umdrehungen pro Minute
V Volt vgl. vergleiche
X-gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galaktosidase
z. T. zum Teil
1. Einleitung
Die Klassische Schweinepest wird vom Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) hervorgerufen.
Das Virus gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae und ist, von wenigen Ausnahmen abgesehen, weltweit verbreitet. Die Erkrankung verläuft zumeist perakut bis akut und sie betrifft Haus- und Wildschweine gleichermaßen. Durch das KSPV hervorgerufene Seuchenzüge verursachen enorme wirtschaftliche Schäden, wie es in den Mitgliedstaaten der Europäischen Union (EU) zuletzt bei den Ausbrüchen zwischen 1993-1995, sowie 1997/98 der Fall gewesen ist.
Die Bekämpfungsmaßnahmen sind innerhalb der EU einheitlich, basierend auf der Richtlinie 2001/89/EC (Anonymus 2001) geregelt. Seit 1992 besteht ein generelles Impfverbot für Hausschweine und im Fall eines Ausbruches der Klassischen Schweinepest (KSP) werden die Tiere in den betroffenen Betrieben gekeult. Des weiteren gehören die Einrichtung von Sperr- und Beobachtungsgebieten zum Maßnahmenkatalog.
Epidemiologische Studien haben einen engen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen der Erkrankung beim Hausschwein und beim Wildschwein ergeben. Etwa 80% der seit 1993 verzeichneten Primärausbrüche fanden in Regionen mit endemischem Auftreten der Schweinepest beim Wildschwein statt. In etwa 60% der Primärausbrüche in der Hausschweinepopulation konnte ein direkter oder indirekter Kontakt mit infizierten Wildschweinen konstatiert werden.
Eine mögliche Strategie zur Bekämpfung der Wildschweinepest stellen Impfungen dar. Der einzusetzende Impfstoff muss dabei bestimmte Voraussetzungen erfüllen. Er muss eine belastbare Immunität induzieren, preiswert und problemlos zu produzieren, transportieren und zu lagern sein.
Nicht zuletzt sollte aber auch eine Differenzierung zwischen geimpften und erkrankten Tieren (‚Marker-Vakzine’) ebenso möglich sein wie die orale Applikation. Außerdem sollte möglichst kein vermehrungsfähiges Virus als Köder ausgelegt werden.
DNA-Vakzinen können diesen Anforderungen genügen.
Der Vorteil dieser Impfstoffe liegt in ihrer hohen biologischen Sicherheit, da kein vermehrungsfähiger Infektionserreger verwendet werden muss.
Die Synthese des Fremdproteins in der Wirtszelle erlaubt eine, der natürlichen Infektion entsprechende, Prozessierung des Antigens. Hierdurch wird sowohl eine humorale, als auch zellvermittelte Immunreaktion stimuliert und somit die Vorteile von Lebend- und Totvakzine miteinander kombiniert.
Die erfolgreichen Vakzinierung von Wildschweinpopulationen setzt die orale Applikationsfähigkeit des Impfstoffes voraus. Die herkömmlichen DNA-Vakzinen werden jedoch zumeist intradermal oder intramuskulär injiziert.
Um eine orale Verabreichung zu ermöglichen, bieten sich attenuierte Bakterien an, die die DNA-Plasmide vor einer Zerstörung durch die Verdauungsaktivität schützen, sie zu immunologisch reaktiven Darmbereichen transportieren und dort freisetzen.
Im Rahmen dieser Arbeit galt es zu versuchen, einen neuartigen DNA-Impfstoff gegen die Klassische Schweinepest zu entwickeln, der mit Hilfe von attenuierten Salmonella typhimurium aroA SL 7207 die Darmbarriere durchdringen kann. Dafür galt es unter anderem abzuklären, ob sich die im murinen Modell gewonnenen Erkenntnisse bezüglich der Carriereigenschaften
des gewählten Salmonellenstammes auf das Schwein übertragen lassen und es zu einer Expression der Fremdgene bei gleichzeitiger Induktion einer belastungsfähigen Immunantwort kommt.
2. Literaturübersicht
2.1. Charakterisierung des Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV)
2.1.1. Taxonomie
Das KSPV bildet zusammen mit dem Border Disease Virus und dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe innerhalb der Familie der Flaviviridae das Genus Pestivirus. Zur dieser Familie gehören weiterhin die Genera Flavivirus und Hepacivirus (WENGLER et al. 1995).
Die Bezeichnung Classical Swine Fever Virus (CSFV) hat sich im internationalen Sprachgebrauch gegenüber der aus dem amerikanischen stammenden Bezeichnung Hog Cholera Virus durchgesetzt. Zugleich werden Verwechslungen mit dem humanen Hepatitis-C-Virus (HCV) vermieden (RICE 1996; BÜTTNER u. AHL 1998).
2.1.2. Struktur und physikalische Eigenschaften des Virions
Es handelt sich um sphärische, behüllte RNA-Viren mit einem Durchmesser von 40-60 nm (MOENNIG u. PLAGEMANN 1992). Ein hexagonal geformtes, elektronendichtes Kapsid mit einem Durchmesser von ca. 30 nm wird von einer Virushülle umgeben (HORZINEK et al. 1967). Bei Behandlung mit Detergenzien und Lipidlösungsmitteln verlieren Pestiviren ihre Infektiösität. Durch höhere Temperaturen kommt es zu einer Inaktivierung des Virus. Im Umkehrschluß bedeutet dies, dass Fleisch und Fleischprodukte dem Virus aufgrund des hohen Feuchtigkeitsgehaltes, des Proteingehaltes und der üblichen kühlen Lagerung gute Überlebensmöglichkeiten bieten (EDWARDS 2000). Da die Verfütterung
von Speiseabfällen eine häufige Ursache für neue Seuchenausbrüche ist (TEPESTRA 1988 ; FRITZEMEIER et al. 2000), ist dies eine bedeutsame Gefahrenquelle.
2.1.3. Genom und virale Proteine
Beim Genom der Pestiviren handelt es sich um ein einzel- und positivsträngiges, lineares RNA-Molekül (MOORMANN u. HULST 1988). Es hat eine Länge von ca. 12,5 Kilobasen (Kb) und besteht aus einem einzelnen offenen Leserahmen, welcher für ein hypothetisches Polyprotein von etwa 3900 Aminosäuren Länge kodiert (COLLETT et al. 1988; MEYERS et al. 1989;
MOORMANN et al. 1990a, 1990b). Dieses wird co- und posttranslational prozessiert (MEYERS u. THIEL 1996). Nichttranslatierte Regionen (NTR) flankieren das Genom. Am N-terminalen Ende findet sich die 5’NTR mit einer Länge von 372 bis 385 Basen (Becher et al. 1998). Sie bildet die Internal Ribosomal Entry Site (IRES), welche für eine cap-unabhängige Bindung an die Ribosomen verantwortlich ist (SIZOWA et al. 1998). Die Funktion des 3’-NTR konnte noch nicht geklärt werden. Beide nicht-translatierten Regionen sind hoch konserviert (MEYERS et al. 1989; MOORMANN et al. 1990b).
Das Genom der Pestiviren kodiert vom 5’- zum 3’-Ende für die Proteine Npro, C, Erns, E1, E2, p7, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B. Die Genomorganisation ist in Abb. 1 dargestellt:
Npro C Erns E1 E2 p7 NS 2/3 NS4A NS4A NS5A-B
5’ 3‘
Strukturproteine
Abb. 1: Genomorganisation des KSPV (modifiziert nach MEYERS u. THIEL 1996).
Gezeigt wird die Lokalisation der Proteine auf dem viralen Genom. Die markierten und durch einen Pfeil unterlegten Bereiche stellen die Strukturproteine dar, die hellen die Nichtstrukturproteine. Die unterschiedliche Breite der einzelnen Rechtecke symbolisiert die unterschiedlichen Sequenzlängen der Proteine im Genom.
Der für die Autoprotease Npro kodierende Bereich befindet sich am N-terminalen Ende des Genoms. Es handelt sich dabei um ein Nichtstrukturprotein mit cotranslationell autokatalytischer Aktivität (WISKERCHEN et al. 1991;
RÜMENAPF et al. 1993a), welches in der Zellkultur nicht essentiell für die Virusreplikation ist (TRATSCHIN et al. 1998). Von den vier Strukturproteinen folgt zunächst das Core-Protein C des Nukleokapsids (THIEL et al. 1991) und schließlich die drei Hüllproteine Erns, E1 und E2 (MEYERS et al. 1989; STARK et al. 1990). Zunächst liegen sie als gemeinsames Vorläuferprotein vor, werden dann aber in die einzelnen Proteine gespalten (RÜMENAPF et al. 1993a). Das Glykoprotein Erns liegt in stark glykosylierter Form vor und besitzt eine ausgeprägte Ribonuklease-Aktivität (HULST et al. 1994). Dieses Protein induziert im natürlichen Wirt die Ausbildung schwach neutralisierender Antikörper als Immunantwort (RÜMENAPF et al. 1991, WEILAND et al. 1990, WEILAND et al. 1992, KÖNIG et al. 1995). Dem ebenfalls glykosilierten Hüllprotein E1 wird aufgrund seiner hydrophoben Region die Funktion eines Transmembranankers für das vierte Strukturprotein E2 zugesprochen (RÜMENAPF et al. 1993b). E1 und E2 bilden über Disulfidbrücken
Heterodimere aus (WEILAND et al. 1990). Das häufig als Homodimer vorliegende E2 ist als das Hauptstrukturprotein des Virus zu betrachten (MEYERS u. THIEL 1996; MODROW et al. 2003). Eine schematische Darstellung ist in Abbildung 2 zu sehen. Es besitzt drei Domänen für die Induktion neutralisierender Antikörper und die im Wirtsorganismus gebildeten neutralisierenden Antikörper sind in der Tat hauptsächlich gegen dieses Protein gerichtet (GREISER-WILKE et al. 1990; WEILAND et al. 1990, 1992; VAN RIJN et al. 1996). Darüber hinaus konnten auf diesem Protein fünf T-Zell-Epitope lokalisiert werden, von denen zwei zugleich Bestandteil eines der B-Zell-Epitope sind (ARMENGOL et al. 2002). Dieses Strukturprotein ist zugleich dasjenige Protein der Pestiviren mit der geringsten Aminosäuresequenzähnlichkeit; etwa 80% innerhalb der Spezies und 60% innerhalb des Genus Pestivirus (BECHER et al. 1998).
Abb. 2: Schematische Darstellung des E2-Proteins (modifiziert nach VAN RIJN et al.
1996).
Die Buchstaben A-D markieren die Domänen, die für die Induktion neutralisierender Antikörper verantwortlich sind. Die beiden Pfeile sollen das E2 Protein mit (heller Pfeil, E2) und ohne (dunkler Pfeil, E2 truncated) Transmembrananker kennzeichnen.
C-terminal folgt ein kleines, stark hydrophobes Protein, p7, dessen Funktion bisher nicht geklärt ist. Es konnte sowohl einzeln, als auch als Fusionsprodukt mit dem Protein E2 nachgewiesen werden (ELBERS et al. 1996). Der C- terminal folgende Genombereich kodiert für Nichtstrukturproteine (NS). Das Protein NS2-3 wird vom KSP-Virus in fusionierter Form exprimiert (THIEL et al.
1991; GREISER-WILKE et al. 1992). Bei den zytopathogenen Vertretern (z.B.
bei BVDV) des Genus Pestivirus werden die Proteine NS2 und NS3 hingegen getrennt exprimiert (COLLETT et al. 1988). Das NS4A-Protein ist beim KSPV ein Co-Faktor für das als Protease fungierende NS3 (RICE 1996). Die Rolle von NS4B bei der Virusreplikation ist noch nicht geklärt. Das Protein NS5A-B wird in die Produkte NS5A und NS5B gespalten; für NS5B wurden die Eigenschaften einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase nachgewiesen (MEYERS et al. 1989;
STEFFENS et al. 1999).
2.2. Die Klassische Schweinepest 2.2.1. Infektionsbiologie und Erkrankung
Die Klassische Schweinepest wurde erstmals 1833 im US Bundesstaat Ohio beobachtet. 1903 gelang es, ein filtrierbares Virus als Ursache der Schweinepest nachzuweisen (DE SCHWEINITZ u. DORSET 1904). Haus- und Wildschweine sind gleichermaßen empfänglich für das Virus der Klassischen Schweinepest und stellen die natürlichen Wirte dar (LADDOMADA 2000;
DEPNER et al. 1995). Es handelt sich um eine sog. Office International des epizooties (OIE) Liste A-Seuche, d.h. jeder Verdachtsfall muss untersucht und jeder Ausbruch gemeldet werden (MOENNIG 2000).
Das Virus wird mit Sekreten und Exkreten, wie Urin, Kot, Sperma und Speichel schon in der Inkubationszeit, bei subakutem und chronischem oder atypischem Verlauf über längere Zeiträume ausgeschieden. Es kann zu einer Übertragung
sowohl auf direktem Weg durch Tierkontakte oder indirekt durch Futterprodukte, Küchenabfälle (ANONYMUS 1960), viruskontaminierte Stallgeräte, Fahrzeuge, Personenkontakte, Einstreu oder sonstige Materialien kommen. Auch Arthropoden können das Virus mechanisch übertragen (VAN OIRSCHOT u.
TERPSTRA 1989). Zu einer Virusaufnahme kommt es in der Regel über Ingestion, Inhalation oder Konjunktivalkontakt, häufig auch über Schlachtabfälle, Abwässer und nicht ausreichend erhitzte Küchenabfälle (MOENNIG 1993). Auch eine Übertragung durch den Deckakt ist möglich (GEIGER 1939). Die künstliche Besamung wird als Übertragungsweg diskutiert (DE SMIT et al. 1999).
2.2.1.1. Pathogenese und klinischer Verlauf der KSP beim Hausschwein
Beim Haussschwein beträgt die Inkubationszeit zwischen vier und sechs Tagen, in subakuten oder chronischen Fällen bis zu einem Monat. Es treten sowohl perakute als auch akute, chronische und klinisch inapparente Verlaufsformen auf, die vor allem vom Alter der Tiere, der Virulenz des Virus und Sekundärinfektionen beeinflusst werden (VAN OIRSCHOT 1992).
Perakute Verlaufsform
Bei dieser Verlaufsform kommt es zwei bis fünf Tage nach der Infektion zum plötzlichen Tod des Tieres, ohne dass dieses deutliche Symptome zeigt (DUNNE 1973). Das pathologisch-anatomische Bild ist in diesen Fällen vom Bild eines akuten Kreislaufversagens geprägt (TRAUTWEIN 1988).
Akute Verlaufsform
Kennzeichnend sind Fieber um 41°C, Störungen des Allgemeinbefindens mit Konjunktivitis, Ataxie, Anorexie, Vomitus, Diarrhöe und Obstipation im Wechsel, Rhinitis, Erythem und Bewegungsstörungen. Die Kreislaufstörungen zeigen sich durch Petechien der Haut und unregelmäßige blaurote Verfärbungen in Schulter- und Kreuzgegend, an Nacken, Ohren und am Unterbauch. Es kommt
außerdem zu einer Lymphopenie, die in einer Immunsuppression resultiert (SUSA et al. 1992). Die Letalität schwankt zwischen 30% und 100% (VAN OIRSCHOT 1992). Bei Jungtieren liegen die Verlustraten bei bis zu 80%, während ältere Tiere häufig nur subklinisch erkranken.
Chronische Verlaufsform
Bei dieser Verlaufsform kommt es in der Regel nach 30 Tagen zu einem letalen Ausgang. Die auftretenden Symptome sind uncharakteristisch. Es kommt zu Inappetenz, Abmagerung, Enteritiden und/oder Pneumonien sowie Hautnekrosen. Fieber ist nicht immer vorhanden (MENGELING u. CHEVILLE 1968; MENGELLING u. PACKER 1969; CHEVILLE u. MENGELING 1969).
Durch das gleichzeitige Auftreten von Antikörpern und KSP-Virus kann es zu einer auf der Bildung von Immunkomplexen beruhenden Glomerulonephritis kommen (CHEVILLE et al. 1970).
Atypischer Verlauf
Es handelt sich um einen milden und schleichenden Verlauf, gekennzeichnet durch variables Fieber, Diarrhöe, Störungen der Fruchtbarkeit, Aborte, Totgeburten, kongenitalen Tremor, Kümmern, Ferkelsterben und nervöse klinische Erscheinungen (VAN OIRSCHOT 1992).
Pränatal kann das KSP-Virus die Plazentarschranke überwinden. Dabei kommt es bei den Feten zur Schädigung der Organentwicklung, zu verschiedenen Missbildungen, zur Geburt lebensschwacher oder toter Ferkel (VAN OIRSCHOT u. TERPSTRA 1977; FREY et al. 1980; MEYER et al. 1981) und zum Überleben einiger kongenital persistent infizierter Ferkel, welche zum Zeitpunkt der Geburt klinisch unauffällig erscheinen, schließlich aber kümmern und, nach Überlebenszeiten von bis zu einem Jahr, versterben. Diese Form wird als ‚late onset’ bezeichnet (VAN OIRSCHOT 1992).
2.2.1.2. Pathogenese und klinischer Verlauf der KSP beim Wildschwein
Beim Wildschwein ist der Wissensstand über Infektionsbiologie und den Krankheitsverlauf weniger umfassend als beim Hausschwein. Es wird allgemein angenommen, dass die Pathogenese der Infektion, der Verlauf der Erkrankung und die klinischen Symptome beim Wildschwein denen beim Hausschwein vergleichbar sind. Darüber hinaus konnte auch für das Wildschwein eine diaplazentare Übertragung des KSP-Virus und die resultierende Geburt persistent infizierter Frischlinge nachgewiesen werden. DEPNER et al. (1995) beobachteten bei virämischen Frischlingen eine Überlebenszeit von 39 Tagen.
Auch wenn es für diese Ergebnisse keine unterstützenden Felddaten gibt, so ist doch davon auszugehen, dass es insbesondere bei jungen Bachen auch in der freien Wildbahn zu intrauterinen Infektionen kommt. Aufgrund der schwierigeren Lebensbedingungen ist jedoch von einer kürzeren Überlebenszeit der persistent infizierten Wildschweine, im Vergleich zu den Hausschweinen, auszugehen (ANONYMUS 1999).
Die Ausscheidung des Erregers findet vor allem in der klinischen Phase der Erkrankung statt. Da insbesondere junge Tiere häufig klinisch auffällig werden, spielen sie bei der Weiterverbreitung des KSP-Virus eine wichtige Rolle.
Beim Schwarzwild ist weiterhin zu beachten, dass zu Beginn der Seuche alle Altersstufen betroffen sind, wobei allerdings hauptsächlich junge Tiere tot aufgefunden werden, im weiteren Seuchenverlauf verenden keine alten Tiere mehr, da diejenigen, die die Infektion überlebt haben, immun sind. Kümmern, ZNS-Störungen (Ataxie, Bewegungskoordination), Verlust der Scheu vor dem Menschen und Absonderung von der Rotte sind die deutlichsten Symptome (ANONYMUS 1999).
In den endemischen Gebieten sind insbesondere Frischlinge von der Infektion betroffen. In Deutschland in der Region Brandenburg erhobene Felddaten von 1995-1997 zeigen einen altersabhängigen Rückgang der KSP-Inzidenz beim Schwarzwild. Die größte Gruppe virämischer Tiere stellten dabei die Frischlinge
dar, die zu Beginn der Epidemie jünger als drei Monate waren. Von den Frischlingen mit einem Gewicht von < 10 kg waren etwa 20% virämisch, wohingegen in der Gruppe der adulten Wildschweine mit einem Aufbruchgewicht von > 75 kg kein Träger des KSP-Virus gefunden werden konnte (KERN et al. 1999).
Dies verdeutlicht die besondere Rolle der jungen Wildschweine bei der Verbreitung der klassischen Schweinepest. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in Italien gemacht (GUBERTI et al. 1998).
2.2.1.3. Die Pathologie der KSP bei Haus- und Wildschwein
Wildschwein und Hausschwein weisen nach experimenteller Infektion dasselbe Spektrum von pathologisch-anatomischen Veränderungen auf. Bei postnatalen Infektionen resultieren diese vor allem aus Thrombosen oder ausgedehnten Endothelschäden, die zu spontanen Blutungen oder Petechien führen.
Pathologische Veränderungen sind am häufigsten an den Lymphknoten und den Nieren zu beobachten. Die Lymphknoten schwellen ödematös an und zeigen Hämorrhagien. Nierenblutungen können in unterschiedlichem Umfang auftreten und auf der Kortexoberfläche sichtbar werden. Auch an der Haut, an serösen und mukösen Auskleidungen, an der Darmschleimhaut, am Herzen, an Kehldeckel und –kopf und in der Harnblase kann es zu unterschiedlich starken Einblutungen kommen. Darüber hinaus ist auch eine zyanotische Hautverfärbung möglich.
Pränatal beeinflusst das Virus die Organanlage (in der frühen Phase der Ontogenese), was in Missbildungen resultieren kann (ANONYMUS 1999).
2.2.1.4. Die Immunologie der KSP bei Haus- und Wildschwein
Beim Schwarzwild ist über die Immunantwort auf die KSP nur wenig bekannt.
Es wird aber auch hier gemeinhin davon ausgegangen, dass sie sich nicht von der des Hausschweines unterscheidet. Es kommt durch die Pestiviren in der
akuten Phase zu einer Immunsuppression. Tiere, die von der KSP genesen, sind für mehrere Jahre vor dem KSP-Virus geschützt.
Typisches Charakteristikum dieser Erkrankung ist eine generalisierte Leukopenie (TRAUTWEIN 1988; VAN OIRSCHOT 1988), die bereits vor dem Auftreten von Fieber messbar wird (DUNNE 1973). Insbesondere hochvirulente Stämme des KSPV führen zu Veränderungen im hämatopoetischen System (SUMMERFIELD et al., 1998 a, b ; SUMMERFIELD et al. 2001; TERZIC et al.
2003). Gleichzeitig ist auch die Apoptose von Lymphozyten an der Pathogenese der Klassischen Schweinepest beteiligt. Zu signifikanten Veränderungen kommt es bei den neutrophilen Granulozyten, natürlichen Killerzellen (NK), CD4+- und CD8+- Lymphozyten (SUMMERFIELD et al.
2001).
Der Nachweis neutralisierender Antikörper gelingt frühestens zwei Wochen nach erfolgter Infektion. Bei Schweinen mit den Symptomen einer chronischen KSP sind sie am Ende des ersten Monats nach der Infektion wenige Tage lang nachweisbar, können danach aber wieder verschwinden. Im Mutterleib infizierte Tiere zeigen eine Immuntoleranz gegenüber dem KSP-Virus und produzieren daher auch keine neutralisierenden Antikörper.
Eine passive Immunität schützt die Frischlinge in den ersten, etwa fünf Lebenswochen. Sie verhindert das Auftreten von Todesfällen, nicht jedoch die Replikation und Ausscheidung des Virus. Antikörper, die nach dem dritten Lebensmonat nachgewiesen werden, sind aller Wahrscheinlichkeit nach auf eine Infektion zurückzuführen (ANONYMUS 1999).
2.2.2. Laboratoriumsdiagnose - direkter und indirekter Nachweis
Wird bei Krankheits- oder Todesfällen der KSP-Verdacht geäußert, so wird der direkte Nachweis des Virus eingeleitet. Vom lebenden Tier kann der Erregernachweis aus Leukozyten oder Sekreten erfolgen, die in Schweinezellkulturen inokuliert nach 2 Tagen mittels Immunfluoreszenztechnik
(IFT) oder indirekter Immunperoxidase-Technik auf das KSP-Virusantigen untersucht werden (MENGELING et al. 1963). Beim toten Tier erfolgt die Virusanzucht aus Organsuspensionen der Lymphknoten, der Tonsillen oder der Milz. Ohne vorherige Virusanzucht ist der KSPV-Nachweis auch mittels IFT entweder in histologischen Schnitten oder an Abklatschpräparaten möglich.
Wesentlich ist zudem eine serologische Abgrenzung gegenüber dem Virus der Bovinen Virusdiarrhöe (BVDV) mittels monoklonaler Antikörper nach einem erfolgten Nachweis mit dem IFT oder dem indirektem Immunperoxidasetest (HOLM JENSEN 1981; MOENNIG 1993; BÜTTNER u. AHL 1998). Es ist auch möglich, den Antigennachweis über Antigen-ELISAs und Durchflußzytometrie zu führen (KADEN et al. 1999).
Der Nachweis von Antikörpern gegen das KSPV erfolgt am zuverlässigsten mittels Virusneutralisationstest (VNT) (VAN BEKKUM 1966). In Massenuntersuchungen wird in der Regel ein weniger aufwendiger Neutralization-Peroxidase-Linked-Antibody-Assay (NPLA) ( DAHLE et al. 1993;
DEPNER et al. 1994) oder ELISA zum Nachweis von Antikörpern (MOENNIG 1993; DEPNER et al. 1994) verwendet.
Auch der Nachweis mittels Reverse-Transkriptase (RT)-PCR wird in den Labors durchgeführt. Hierbei wird die nicht-translatierte 5’-Region des Virusgenoms amplifiziert. Die anschließende Sequenzierung der entsprechenden Region ermöglicht eine Differenzierung der unterschiedlichen KSPV-Isolate (MOENNIG 2000; HOFMANN et al. 1994).
2.2.3. Verbreitung und Bekämpfung der Klassischen Schweinepest 2.2.3.1. Globale Verbreitung der KSP (ohne Europa)
Im Jahr 2000 sah die globale Seuchensituation folgendermaßen aus: Australien und Nordamerika waren frei von KSP, in großen Teilen von Zentral- und Mittelamerika sowie Asien - mit Ausnahme von Japan und den Staaten des
Nahen Ostens - waren KSP-Ausbrüche zu verzeichnen. In Afrika ist die Seuchensituation unklar (EDWARDS et al. 2000).
2.2.3.2. Verbreitung der KSP in Europa
In Zentral- und Osteuropa ist die KSP weit verbreitet. In den betroffenen Ländern werden Tilgungsprogramme durchgeführt, wobei diese in den meisten Ländern in Form von Impfprogrammen durchgeführt werden (EDWARDS et al.
2000).
In den Mitgliedsstaaten der Europäischen Union ist die Inzidenz der KSP beim Hausschwein im Vergleich zu früheren Jahrzehnten stark zurückgegangen (EDWARDS et al. 2000). Momentan sind die meisten Mitgliedsstaaten der EU weitgehend frei von KSP, was die Hausschweinepopulation betrifft. Allerdings kommt es immer wieder zu sporadischen Ausbrüchen. Die letzte große Epidemie begann 1996 in Westdeutschland und breitete sich rapide in die Niederlande, nach Spanien, Italien und Belgien aus. Es kam dabei zu mehr als 550 Ausbrüchen (DE SMIT et al. 2000; STEGEMANN et al. 2000). Dies ist vor allem auf industrialisierte Aufzucht- und Haltungsbedingungen sowie überregionale Verflechtungen zurückzuführen (MOENNIG 2000).
2.2.3.3. Die Situation in Deutschland
Alle KSP-Virustypen, die im letzten Jahrzehnt in Deutschland in der Wildschweinepopulation zirkulierten, wurden auch in der Hausschweinepopulation der entsprechenden Region nachgewiesen. Etwa 80% der seit 1993 verzeichneten Primärausbrüche fanden in Regionen statt, in denen die Klassische Schweinepest auch beim Wildschwein endemisch ist.
Etwa 60% der Primärausbrüche konnte man auf einen direkten oder indirekten Kontakt mit infizierten Wildschweinen oder ihrem Fleisch zurückführen (Abschlußbericht zum Forschungsprojekt 96HS022, Institut für Virologie, Tierärztliche Hochschule 1998).
Kommt es zu einer Einschleppung des KSP-Virus in eine Wildschweinepopulation, so wird in der Regel eine Anzahl von Tieren verendet aufgefunden. Andere Tiere hingegen bilden Antikörper und überleben. Sobald die Seuche ihren Höhepunkt überschritten hat, kann sie aufgrund der in Teilen der Population vorhandenen erworbenen Immunität sowie des mortalitätsbedingten Rückgangs der Bestandsdichte von allein wieder verschwinden. Basierend auf früheren Erfahrungen nahm man deswegen lange Zeit an, dass die KSP-Infektionen beim Wildschwein selbstlimitierend seien.
Zunehmend ist jedoch in den letzten Jahren zu beobachten gewesen, dass eine KSP-Epidemie endemisch wurde und das KSP-Virus ohne Selbstlimitierung in der Schwarzwildpopulation zirkulierte. Als mögliche Gründe dafür wurde über die Zunahme der Dichte und des Umfangs der Wildschweinepopulation, sowie die Beteiligung von KSP-Virusstämmen mit geringerer Virulenz spekuliert. Die Anzahl endemischer Regionen hat sich in den letzten Jahren vergrößert (DEPNER et al. 1998).
2.2.4. Bekämpfungsstrategien in der Europäischen Union 2.2.4.1. Vakzineentwicklung
Seit dem Beginn des vorherigen Jahrhunderts wurde damit begonnen, Impfstoffe gegen das Virus der Klassischen Schweinepest zu entwickeln.
In den Jahren um 1940 wurde erstmalig versucht, das Virus durch eine Adaptation an das Kaninchen zu attenuieren. Dies resultierte im China Stamm (C-Stamm), der auch heute noch in Vakzinen zur Impfung von Hausschweinen (außerhalb der EU) eingesetzt wird. Darüber hinaus wurde dieser Virusstamm auch in den Versuchen zur oralen Immunisierung durch Kaden (s.2.2.5.) bei Wildschweinen eingesetzt.
Der C-Stamm ist in der Lage, die Bildung von hohen Titern an protektiven Antikörpern zu induzieren. Die Wirksamkeit dieser Vakzinen ist auch daran abzulesen, dass die Tiere bereits fünf Tage nach der Infektion vor einer Infektion durch virulente KSP-Viren geschützt sind.
Ein wesentlicher Nachteil, gerade vor dem Hintergrund zunehmender Handelsverflechtungen, ist jedoch die Tatsache, dass keine Differenzierung zwischen geimpften und mit dem Feldvirus infizierten Tieren möglich ist (MOENNIG 2000).
Eine Alternative stellen zwei sogenannte Marker-Vakzinen dar. Hier wird eines der viralen Oberflächenproteine, das E2-Gen, in ein Baculovirus kloniert, welches in Insektenzellen vermehrt wird (VAN RIJN et al. 1996).
Der Vorteil dieser Zellen liegt in ihrer Fähigkeit zur Glykosylierung und das
‚fertige’ Protein entspricht schließlich dem im KSP-Virus vorkommenden.
Der protektive Effekt dieser Vakzinen ist ausreichend gut und eine Differenzierung zwischen vakzinierten und mit Feldvirus infizierten Tieren ist mittels ELISA sicher möglich.
Eine weitere Möglichkeit zur erfolgreichen Vakzinierung stellen DNA Vakzinen dar, auf die unter 2.7. detailierter eingegangen wird (MOENNIG 2000).
2.2.4.2. Problematik der Vakzinierung und Regelungen innerhalb der EU
In zahlreichen Ländern mit einem endemischen Auftreten von KSP beim Hausschwein wird gegen die Krankheit geimpft. Dabei wird zumeist die auf dem C-Stamm basierende Vakzine eingesetzt, was eine Differenzierung zwischen geimpften und mit dem Feldvirus-infizierten Tieren unmöglich macht.
Vor dem Hintergrund dieser Problematik kamen die Mitgliedsstaaten überein, die Impfung in ihrem politischen Gebiet zum Ende der 1980er Jahre zu verbieten (ANONYMUS 2001).
Weitergehend sehen die EU-Regularien für den Handel mit Drittstaaten vor, dass lebende Schweine und frisches Schweinefleisch nur dann in EU-Mitgliedsstaaten eingeführt werden dürfen, wenn in diesen Ländern in den vorausgegangenen 12 Monaten weder KSP aufgetreten ist, noch dagegen geimpft wurde.
Die Direktive umfasst im Fall eines Seuchenausbruchs zudem die Keulung aller Hausschweine des betroffenen Betriebes und der Kontaktbetriebe.
Darüber hinaus werden Sperr- und Beobachtungszonen eingerichtet, Handelsrestriktionen erlassen, der Ausbruch epidemiologisch, klinisch und virologisch untersucht. Problematisch ist dabei, dass gerade in Gebieten mit hoher Schweinedichte zahlreiche Tiere getötet werden müssen, von denen nur ein Bruchteil tatsächlich infiziert ist. Dies ist nicht nur eine emotional schwierige Situation, sondern zieht auch enormen wirtschaftlichen Schaden nach sich. Vor diesem Hintergrund wird immer wieder der Ruf nach ‚Notimpfungen’ laut. Diese sind gemäß der EU-Direktive zwar bei Verwendung der Lebenvakzine zugelassen, der Einsatz ist aber mit gravierenden Handelsrestriktionen verbunden. So ist beispielsweise der Handel in diesen Gebieten für 600 Tage lediglich regional möglich. Eine Impfung mit einer der beiden Subunit-Vakzinen würde, sollte sie von der EU akzeptiert werden, sicherlich nur mit geringeren Auflagen belegt werden.
Ungelöst bliebe trotz dieser Regelungen allerdings die Gefahr eine Ansteckung der Hausschweine durch Wildschweine (MOENNIG 2000).
2.2.5. Die Bekämpfungsstrategien der KSP beim Wildschwein, sowie deren Vor- und Nachteile
2.2.5.1. Die Bejagung
Ungezieltes Bejagen ist ungeeignet, die Wildschweinepopulation unter den Schwellenwert abzusenken. Von der Bestandsdichte abhängende Prozesse führen dazu, dass bei einer durch Bejagung deutlich reduzierten Population die Reproduktionsrate erheblich ansteigt und der Lebensraum innerhalb kurzer Zeit wieder bis zur Belastbarkeitsgrenze aufgefüllt wird. Es kommt zu einem sprunghaften Anstieg der Zahl der Jungtiere, die am empfänglichsten für eine KSP-Infektion sind. Sie entwickeln die mit einer hohen Mortalität einhergehende klinische Form der Infektion und verbreiten das Virus in der Population weiter.
In Gebieten, in denen die KSP endemisch ist, weisen die älteren Tiere einen hohen Grad an Rottenimmunität auf. Die bevorzugte Tötung von älteren Tieren
verringert damit auch die Immunität innerhalb der Population (DEPNER et al.
1998; KADEN 1998; ANONYMUS 1999).
Zugleich führt eine verstärkte Bejagung auch zu einer erhöhten Mobilität der Tiere. Durch den Abschuß von älteren Tieren kommt es zu einer Zerstörung des sozialen Gefüges und zu einer Versprengung der Rotte. Dies resultiert in einer höheren Kontaktaufnahmerate mit anderen empfänglichen Tieren, was die Verbreitung der Krankheit fördert. Bleiben die Tiere ungestört, so bedeutet dies, dass die von der Seuche betroffene Population kleiner ist, und der Schwellenwert, bei dem die Seuche verschwindet, möglicherweise schneller durch natürliche Immunisierung oder Impfung erreicht werden kann (ANONYMUS 1999).
2.2.5.2. Verstärkte Aufklärung und Fütterungsbeschränkung
Die Fütterung von Wildschweinen mit Fleisch, Fleischprodukten sowie Küchenabfällen birgt die Gefahr, dass das Virus in die Schwarzwildpopulation eingeschleppt wird (ANONYMUS 1999; KRAMER et al. 2002).
Parallel dazu muss aber auch berücksichtigt werden, dass ebenso eine Fütterung von nicht kontaminierten Futtermitteln zur Förderung der Verbreitung der Seuche beiträgt. In Gebieten, in denen die Klassische Schweinpest ausgebrochen ist, führt die Fütterung zu einer Weiterverbreitung des Virus, denn diese Futterplätze führen zu einer gesteigerten Mobilität der Tiere.
Wildschweine aus weiter entfernt liegenden Gebieten werden diese Futterplätze ebenfalls aufsuchen und das Virus somit durch den direkten und indirekten Kontakt mit infizierten Artgenossen in ihr eigenes Gebiet einbringen (LOEPELMANN u. SCHUSTER 1997). Darüber hinaus führt eine bessere Versorgungslage auch zu einer erhöhten Reproduktionsrate und damit zu einer Steigerung der Anzahl empfänglicher Tiere (ANONYMUS 1999).
2.2.5.3. Orale Vakzinierung
Das Konzept der oralen Vakzinierung existiert schon seit vielen Jahren. Die bekannteste Erfolgsgeschichte ist sicherlich die Köderimpfung der Füchse gegen das Tollwutvirus. Aber auch gegen andere Erkrankungen ist die orale Vakzinierung getestet worden. In den USA wurde beispielsweise versucht, Wildschweine gegen die Aujeszkysche Krankheit oder auch gegen Brucellose zu impfen (FLETCHER et al. 1990). Bereits seit den 60er Jahren des vorigen Jahrhunderts wurden auch Vakzinen gegen das KSP-Virus getestet. In der früheren Sowjetunion sowie dem heutigen Russland wurden sowohl lyophilisierte, als auch pulverisierte KSP-Vakzinen eingesetzt. Auch in Rumänien wurde eine Vakzinierung in Form der Verfütterung von Kaninchenhinterläufen, die aus dem Herstellungsprozess der lapinisierten KSP-Vakzine stammten, eingesetzt. Diese Art der Immunisierung stellte sich allerdings als ungeeignet heraus, denn die Köder wurden vielfach von Carnivoren aufgenommen (KADEN et al. 2000). Auch in der ehemaligen DDR, Italien oder Frankreich wurde auf diesem Feld geforscht.
Es ist davon auszugehen, dass die orale Immunisierung als ergänzendes Werkzeug bei der Bekämpfung erfolgbringend eingesetzt werden kann (KADEN et al. 2000, 1998; LADDOMADA 2000).
Basierend auf unveröffentlichten Vorstudien begann im Herbst 1993 in Niedersachsen die erste Feldstudie zur oralen Immunisierung.
Ausgewählt wurde eine Region, in der sich keine Hausschweinezuchten befanden, in der die Wildschweinedichte bekannt war und die geographisch durch Landstrassen und Autobahnen eingegrenzt war. Zur Immunisierung wurde eine auf dem C-Stamm basierende Vakzine eingesetzt. Der Köder bestand aus einer Kapsel, die die Vakzine, unter Zusatz von Oxytetrazyklin (OTC) als Marker zur späteren Unterscheidung von mit Feldvirus infizierten Tieren und geimpften Tieren, enthielt und die mit einem Getreideüberzug versehen war.
Etwa 10 – 14 Tage vor dem eigentlichen Beginn des Impfprogramms wurde an verschiedenen Stellen, möglichst gleichmäßig über das Gebiet verteilt, mit der Anfütterung der Tiere begonnen. Nachdem die Tiere die Futterstellen angenommen hatten, erfolgte die Auslage von Plazebo-Ködern. Die eigentliche Immunisierung wurde zweimalig im Abstand von (ein bis) zwei Wochen durchgeführt. Die Köder wurden dabei jeweils in der Erde verscharrt.
Die Wiederholungsimpfung (ebenfalls zweimalig im Abstand von 14 Tagen) erfolgte 5-7 Monate nach der Erstimmunisierung. Insgesamt dauerte die Feldstudie 24 Monate.
Die Auswertung ergab, das die Köder im allgemeinen gut (72%-100%) aufgenommen wurden. Insgesamt konnten abhängig vom Gebiet 52,2%-67,6 % OTC-positive Tiere gefunden werden.
Die weitere Auswertung ergab allerdings auch, dass insbesondere die Jungtiere von der Vakzinierung nicht genügend erfasst wurden. Als Gründe kann über die Hierarchie innerhalb der Rotten kombiniert mit zu kleinen Futterarealen, aber auch über möglicherweise zu große Köder, die gerade den Frischlingen die Aufnahme der Vakzine unmöglich machten, spekuliert werden. Auch ein verändertes und erweitertes Immunisierungsschema mit einer zusätzlichen Impfung im Sommer, also zu einem Zeitpunkt, an dem davon auszugehen ist, dass kaum noch maternale Antikörper vorhanden sind, könnte zu einer besseren Immunisierung in dieser Altersgruppe beitragen.
Insgesamt ist es aber möglich gewesen, im Rahmen des Feldversuches die KSP in diesem Gebiet zu beseitigen. Im angrenzenden Kontrollgebiet, in dem nur die herkömmlichen Bekämpfungsmaßnahmen (Bejagung, Aufklärung etc.) eingesetzt wurden, persistierte die Krankheit 6 Monate länger.
Basierend auf dem erfolgreichen Feldversuch in Niedersachsen wurden in den folgenden Jahren weitere orale Immunisierungen in Mecklenburg-Vorpommern, Brandenburg, Niedersachsen, Baden-Württemberg und Sachsen-Anhalt durchgeführt.
Diese werden bei Kaden et al. (2002) beschrieben.
Auch hier wurde die auf dem C-Stamm basierende Vakzine im Köder eingesetzt. Die Impfschemata der einzelnen Bundesländer variierten, abhängig von der jeweiligen Seuchensituation (Dichte der Wildschweinpopulation, Biotope, jagdliche Regelungen) und der finanziellen Situation der Länder.
Die Auswertung der Feldversuche ergab kurzgefasst folgendes:
- Die Köder wurden gut aufgenommen.
- Kurz nach Beginn der Feldversuche trat eine statistisch signifikante Reduktion des KSP-Auftretens ein.
Eine Ausnahme bildet hierbei das nördliche Mecklenburg- Vorpommern. Kaden et al. (2002) spekulieren, dass die Gründe hierfür in einer zu geringen Anzahl ausgelegter Köder im Verhältnis zur sehr hohen Tierdichte zu sehen sind. Darüber hinaus sind einige Gebiete in Ostseenähe für die Köderauslage ungeeignet.
- Die orale Immunisierung der Frischlinge war nicht zufriedenstellend.
Zusammenfassend lässt sich folgendes feststellen:
Der Erfolg der oralen Immunisierung ist abhängig vom Infektionsdruck, der Virulenz des kursierenden Virusstamms, der Tierdichte, dem Anteil an Frischlingen in der Population sowie der Höhe der Seroprävalenzrate induziert durch Impfung bzw. natürliche Immunisierung.
Die orale Immunisierung stellt in einem Miteinander mit anderen Maßnahmen ein erfolgreiches Werkzeug in der Bekämpfung der Klassischen Schweinepest beim Schwarzwild dar. Sie sollte immer dann zum Einsatz kommen, wenn beispielsweise eine sehr hohe Tierdichte, ein ausgedehntes Verbreitungsgebiet des Virus, ein endemisches Vorkommen oder eine sehr große Ansteckungsgefahr für die Hausschweine vorliegt. Die Köderauslage sollte soweit wie möglich per Hand erfolgen und die Köder verscharrt werden. Die Köderauslage per Flugzeug ist nur die Methode der zweiten Wahl. Die
Immunisierungszonen um das Infektionsgebiet herum sollten mindestens 20 km abdecken und die Immunisierung mindestens noch für zwei Jahre nach dem Verschwinden der Erkrankung fortgesetzt werden.
Da die orale Immunisierung die Jungtiere, insbesondere die Frischlinge nur unzureichend schützt, ist zusätzlich immer auch eine intensive Bejagung dieser Altersklasse durchzuführen.
Um die Impfprogramme und ihren Erfolg besser dokumentieren zu können, sowie die Vermarktung des Wildschweinfleisches zu verbessern, ist es notwendig sog. Marker-Vakzinen zu entwickeln. Der Einsatz von DNA-Vakzinen erscheint dabei sinnvoll, denn ihre Verwendung beinhaltet nicht das Risiko einer unbeabsichtigten Virusverbreitung und ist somit aus seuchenhygienischen Gesichtpunkten zu präferieren.
2.3. DNA-Immunisierung
2.3.1. Einführung
Die DNA-Vakzinierung ist eine seit Beginn der achtziger Jahre des vorigen Jahrhunderts verbreitete Methode. Sie basiert auf dem Konzept, dass Fremd-DNA von Zellen aufgenommen und ihre Genprodukte von Wirtszellen exprimiert werden.
Prinzip
Zur Immunisierung werden die ausgewählten Gene in Expressionsplasmide, unter der Kontrolle starker eukaryontischer Promotoren, kloniert. In der Regel handelt es sich dabei um virale Promotoren (KOWALCZYK u. ERTL 1999).
Zum Einsatz kommen der „immediate early“-Promotor des Humanen Zytomegalievirus (HCMVie), ein Promotor des Rous-Sarkom Virus (Rous
sarcoma virus long terminal repeat (LTR)) oder der SV(simian virus) 40 Promotor. Aber auch andere Promotoren wurden in verschiedenen Experimenten getestet. In einem von KODIHALLI et al. (2000) durchgeführten Vergleich zwischen einem geflügelspezifischen nicht viralen Promotor und dem HCMVie-Promotor konnten bezüglich der erzielten schützenden Immunantwort gegen das Influenza-Virus keine Unterschiede festgestellt werden. In Experimenten von FYNAN et al. (1993) sowie VAN DRUNEN LITTLE-VAN DEN HURK et al. (1998) erzielte der HCMVie-Promotor im Vergleich mit dem LTR bzw. dem RSV-LTR Promotor die besseren Immunantworten.
Neben dem entsprechenden Promotor enthalten die meisten DNA- Vakzine-Vektoren ein Intron, welches die Genexpression steigern kann.
Flankiert von Promotor und Terminationssequenz befindet sich das zur Vakzinierung relevante Gen. Zusätzlich enthalten die Expressionsplasmide einen „origin of replication (ori)“. Dieser sichert eine hohe Anzahl (high-copy) an Plasmid-Kopien während der Vermehrung in Bakterien. In den meisten kommerziell erhältlichen Plasmiden handelt es sich dabei um einen „ori“, der an Eschericha coli-Bakterien angepasst ist.
Um ein selektives Wachstum der Bakterien zu ermöglichen, ist zudem mindestens ein Antibiotika-Resistenzgen vorhanden (KOWALCZYK u. ERTL 1999).
Promotor
Resistenzgen
Impfgen
Origin of replication (ori) Terminationssequenz
Abb. 3 Hypothetischer Aufbau eines Expressionsplasmids (modifiziert nach KOWALCZYK u. ERTL 1999).
Dargestellt sind wesentlichen Kernelemente eines Plasmids. Promotor und origin of replication sind relevant für den Beginn des Transskriptionsvorganges. Eingebettet zwischen Promotor und einer Terminationssequenz besteht die Möglichkeit Gene zur Expression in das Plasmid einzubauen (hier: Impfgen), während das Resistenzgen wichtig für die Selektion auf eine Vermehrung genau jener Bakterien ist, die das Fremdgen enthalten.
Nach der Transformation der Bakterien mit dem Expressionsplasmid werden diese vermehrt, wobei dadurch auch gleichzeitig die Plasmid-DNA amplifiziert wird.
In den meisten Fällen wird die DNA nun isoliert und aufgereinigt. Die DNA wird dann durch verschiedene Applikationstechniken z.B. in die Haut, die Blutgefäße oder die quergestreifte Muskulatur injiziert. Eine andere Methode besteht darin, die DNA nicht wieder aus der Bakterienkultur zu isolieren, sondern sich die entsprechend attenuierten Bakterien zunutze zu machen und oral zu applizieren. Es wird postuliert, dass die Plasmid-DNA von den Körperzellen des Wirtes aufgenommen und in den Zellkern transportiert wird. Dort wird die DNA in mRNA umgeschrieben, in das Zellplasma transportiert und das Protein wie bei einer natürlichen Infektion selbst hergestellt. Nach der Prozessierung wird das entsprechende Antigen entweder direkt über MHC-I präsentiert, oder von der Zelle an entsprechende Immunzellen zur MHC-II-assoziierten Präsentation abgegeben. So es sich bei der transfizierten Zelle schon um eine antigenpräsentierende Zelle handelt, ist auch eine direkte MHC-II-vermittelte
Präsentation des Antigens möglich (DUFOUR 2001; GERDTS u.
METTENLEITER 2000).
Erstmals wiesen WILL et al. 1982 nach, dass klonierte cDNA des Hepatitis B- Virus, die Affen injiziert wurde, zur Expression der entsprechenden Proteine führte (WILL et al. 1982, 1985). 1983 führte DNA, die an Liposomen gebunden und Ratten verabreicht wurde, zu einer in vivo-Expression von Insulin in diesen Tieren (NICOLAU et al. 1983). WOLFF et al. berichteten 1990 von der Expression von Plasmid-DNA im Muskelgewebe der Maus. ULMER et al.
wiesen 1993 (1993a) erstmalig die Induktion einer protektiven Immunantwort in Mäusen nach der Injektion von DNA, die für ein Protein des Influenza-Virus kodierte, nach. In zahlreichen Veröffentlichungen ist seither die Induktion von protektiver Immunität gegen Viren (z.B. DAVIES u. McCLUSKIE 1999), Bakterien (z.B. STRUGNELL et al. 1997) und Protozoen (z.B. KALINNA 1997) im murinen Modell beschrieben worden. Auch im Einsatz gegen Krebs oder autoimmune Erkrankungen ist die Verwendung von DNA-Vakzinen untersucht worden (BENTON u. KENNEDY 1998; RAMSHAW et al. 1997).
YU et al. gelang es 2001 erstmals, eine intramuskulär zu injizierende DNA- Vakzine gegen die Klassische Schweinepest zu entwickeln. Dabei wurde das Gen des Strukturproteins „E2“ in unterschiedlicher Länge in den Vektor pcDNA3 kloniert.
2.3.2. Vor- und Nachteile
Die Vorteile der DNA-Immunisierung liegen in der hohen biologischen Sicherheit, da kein infektionsfähiger Erreger eingesetzt wird. Die einfache und schnelle Herstellung des Impfstoffes bedingt zugleich preiswerte Produktionsmöglichkeiten. Darüber hinaus ist der Impfstoff einfach zu lagern und auch in Gebieten, in denen die Aufrechterhaltung der Kühlkette nicht möglich ist, gut einzusetzen.
Die DNA-Vakzinen induzieren durch die endogene Synthese des Proteins in der Wirtszelle wie bei einer Lebendvakzine sowohl eine humorale als auch zelluläre Immunantwort, wobei davon ausgegangen wird, dass die Güte der Immunantwort direkt mit der Höhe der Antigenexpression korreliert. In den DNA-Vakzinen können damit die Vorteile einer inaktivierten Vakzine bezüglich der biologischen Sicherheit mit den Vorteilen der Lebendvakzine hinsichtlich der besseren Immunantwort kombiniert werden.
In zahlreichen Studien sind Vektoren erprobt worden, die nur ein einziges Antigen oder z.T. nur ein Fragment eines solchen exprimierten. Einige Arbeiten beschreiben aber auch den Einsatz mehrerer verschiedener Antigene z.T in einem einzigen Vektor oder die erfolgreiche Immunisierung nach gleichzeitiger Verabreichung mehrerer Plasmide. Neben der Tatsache, dass eine Impfung mit derartigen Konstrukten die so wichtige serologische Differenzierung zwischen natürlich-infizierten und immunisierten Tieren ermöglicht (Markervakzine), gibt es hierbei die Möglichkeit, die Impfungen bestandsspezifisch zusammenzustellen (BRAUN et al. 1998; GRIFANTINI et al. 1998).
Ein weiterer Vorteil besteht in der Möglichkeit, trotz existierendem maternalen Antikörperschutz zu immunisieren, da die Plasmid-DNA von diesem nicht erkannt wird. Somit können bereits Neugeborene immunisiert werden, wodurch dem Abfallen maternaler Antikörperspiegel durch Aufbau der induzierten Immunität entgegengewirkt werden könnte (VAN DRUNEN LITTEL-VAN DEN HURK et al. 1999; HASSET et al. 1997).
Ein Nachteil der DNA-Vakzinen ist die meist noch unzureichende Wirksamkeit bzw. die sehr langsame Antikörperproduktion, wodurch sie besonders für einen Einsatz post infectionem eher ungeeignet sind. Auch die mäßige humorale Immunantwort stellt momentan noch ein Problem dar. In den bisherigen Zubereitungen scheinen DNA-Vakzinen eher zum priming in Kombination mit anderen Impfstoffen geeignet (KOWALCZYK u. ERTL 1999).
Als weiterer möglicher Nachteil der DNA-Immunisierung wird das Risiko des falschen ‚Anschaltens’ von möglichen Onkogenen durch die Verwendung der starken Promotoren gesehen (ULMER et al. 1993b; TEMIN, 1990). Dieser Aspekt wurde von mehreren Arbeitsgruppen untersucht, bisher konnte diese Befürchtung aber nicht bestätigt werden. Außerdem unbeantwortet sind bisher die Fragen nach der möglichen Übertragung von Antibiotikaresistenzen auf kommensale Darmbakterien sowie die mögliche Integration der Plasmid-DNA in das Wirtszellgenom (GERDTS u. METTENLEITER 2000). Auch stellt sich die Frage, ob es beim Einsatz von DNA-Vakzinen nicht auch zur Ausbildung von Autoimmunität durch die Aktivierung von T-Zellen mit kryptischen Epitopen kommen kann. Bisher gibt es keine Hinweise auf derartige Reaktionen, aber eine Beantwortung zumindest von Teilaspekten dieser Fragen dürfte erst möglich sein, wenn auch das Wirkprinzip vollständig ergründet ist.
Gegensätzlich wird in der Literatur die Frage der Gewebeveränderung nach der Applikation per injectionem beantwortet. KOWALCZYK u. ERTL (1999) stellen eine leichte entzündliche Reaktion nach i.m. Applikation als nachteilig für die Fleischnutzung heraus und regen deswegen die Entwicklung alternativer Anwendungsmöglichkeiten (oral, intranasal) an, während GERDTS u.
METTENLEITER (2000) nun gerade in der Anwesenheit einer inflammatorischen Reaktion einen großen Vorteil der DNA-Vakzinen sehen.
2.3.3. Bakterien als Carriersysteme für DNA-Vakzinen
Da Antigen-präsentierende Zellen eine wesentliche Rolle bei der Induktion von Immunantworten aufgrund von Impfungen mit Plasmid-DNA spielen, liegt es nahe, attenuierte Bakterien als Carrier-Systeme einzusetzen. Die Theorie der Plasmidübertragung sah zunächst folgendermaßen aus:
Die attenuierten Bakterien gelangen entweder in die Zielzellen, weil es sich bei diesen um Phagozyten handelt, oder die Mikroorganismen selbst Phagozytose auslösen. Es gelingt den Bakterien, die phagozytotische Vakuole bspw. durch
Nutzung ihrer eigenen Virulenzfaktoren zu verlassen. Im Zytosol kommt es dann zu einem Absterben der Mikroorganismen, die aufgrund ihrer Attenuierung bestimmte, im Wirt nicht vorhandene Nährstoffe exogen aufnehmen müssen.
Dabei wird das Expressionsplasmid freigesetzt und in den Zellkern der Wirtszelle aufgenommen, wo es schließlich zur Proteinexpression kommt (WEISS u. KRUSCH 2001).
Diese Theorie musste später insofern modifiziert werden, als dass auch für S. typhimurium ein Transfer von Expressionsplasmiden nachgewiesen werden konnte, dieses Bakterium jedoch innerhalb des Phagozytosevesikels verbleibt (DARJI et al. 1997; WEISS u. KRUSCH 2001). Dieser Transfer ist allerdings bisher nur in Primärmakrophagen und nicht in Zelllinien gelungen. NORBURRY et al. (1995) und RODRIGUEZ et al. (1999) berichten über spezielle Transportwege bei dendritischen Zellen und aus dem Knochenmark stammenden aktivierten Makrophagen, die einen Transfer von Makromolekülen aus den endocytotischen Vesikeln in das Zytosol ermöglichen. Ob diese Art von DNA-Transport auch hier stattfindet, ist ungeklärt. Möglich ist auch, dass das sekretorische System der Bakterien auf bisher unbekannte Weise die Expressionsplasmide in das Zytosol entlässt (WEISS u. KRUSCH 2001).
Da Salmonellen in infizierten Makrophagen auch Apoptose auslösen können, wird darüber hinaus diskutiert, ob die DNA von benachbarten dendritischen Zellen aufgenommen und dort exprimiert wird (SHATA et al. 2000).
Der Einsatz von attenuierten Bakterien als Carrier zur mukosalen Immunisierung bietet Vorteile im Vergleich zur DNA-Vakzinierung per injectionem.
Da über 90% der viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen über mukosale Oberflächen ihren Weg in den Wirtsorganismus finden, erscheint es sinnvoll, den körpereigenen Schutz dort besonders zu verstärken (SIRARD et al. 1999).
Viele Bakterien visieren Zellen des Immunsystems als Zielzellen an. Die Übertragung von Plasmiden und die Expression von Antigenen sowie die
Reaktion darauf, ist dort besonders effizient. Die Zellwandbestandteile der Bakterien sowie nicht-methylierte DNA-Motive des bakteriellen Genoms können als Adjuvantien fungieren und die Immunreaktion positiv verstärken.
Die Bakterien und ihre Expressionsplasmide sind dabei als getrennte Reaktionseinheiten zu betrachten und die Modulation der Immunantwort ist sowohl über Änderungen am Expressionsplasmid, als auch durch die Wahl anderer Bakterienstämme möglich.
Darüber hinaus sind Bakterien kosteneffektiv zu produzieren, problemlos zu lagern und durch den Einsatz von Antibiotika leicht zu kontrollieren.
Die bisherigen Arbeiten mit Bakterien als Carrier für mukosale genetische Immunisierung konzentrieren sich im Wesentlichen auf S. typhimurium, S. typhi, Shigella (S.) flexneri und L. monozytogenes.
2.3.3.1. S. typhimurium als Carrier für DNA-Vakzinen
S. typhimurium aroA SL 7207 ist wie S. flexneri ein gram-negatives Bakterium, welches fakultativ intrazellulär parasitiert (SCHWARZ et al. 1995). Seine Attenuierung basiert auf der Deletion bestimmter Gene, die es abhängig von der Zufuhr von Paraaminobenzoesäure machen. Diese ist im Säuger nur in geringen Mengen vorhanden, so dass es zu einer Lyse der Mikroorganismen aufgrund einer gestörten Zellwandsynthese kommt (DIETRICH et al. 1999, HOSIETH u. STOCKER 1981).
Die Bakterien gelangen nach oraler Applikation in den Darm. DARJI u. WEISS (1999) wie auch MEDINA et al. (1999) vermuten, dass die Salmonellen über spezialisierte M-Zellen in die Darmwand des Wirtsstieres eindringen. JEPSON u. CLARK (1999) gehen insofern über diese Theorie hinaus, als dass sie davon ausgehen, dass die Salmonellen zunächst die M-Zellen als Eintrittsort wählen, es aber gleichzeitig zu einer großflächigen Schädigung sowohl der M-Zellen, als auch des benachbarten Follikel-assoziierten Epithels kommt. Als Folge können
die Salmonellen in ausgedehnten Bezirken ungehindert in den Wirtsorganismus eindringen.
Obwohl S. typhimurium, wie schon ausgeführt, in den Phagosomen der Wirtszelle verbleibt, kommt es dennoch zu einer effizienten Expression von Plasmid-kodierten Reportergenen. DARJI et al. (2000) gelang es, Mäuse vor einer Erkrankung durch Listeria monozytogenes durch die orale Vakzinierung mit S. typhimurium zu schützen. Die Salmonellen waren mit einem Plasmid transformiert, in welches das Gen für Listeriolysin bzw. für ActA, ein Membran- Protein, kloniert worden war. Es kam dabei sowohl zu einer zellulären, als auch einer humoralen Immunreaktion der BALB/c-Mäuse. Versuche mit anderen Mäuserassen ergaben allerdings, dass es hier nicht zur Bildung spezifischer Antikörper kam, eine T-Zell-Antwort hingegen induziert werden konnte.
DARJI et al. (2000) fanden außerdem heraus, dass die Effizienz der Immunisierung deutlich verbessert werden konnte, wenn die Bakterien unter weitgehend anaeroben Bedingungen herangezogen wurden und zugleich die NaCl-Konzentration des Mediums erhöht wurde.
FAGAN et al. konnten 2001 in Schweinen durch die Verabreichung von attenuierten Salmonellen, welche mit einem rekombinanten Antigen von Mycoplasma hyopneumoniae transformiert waren, einen ‚priming effect’
erzeugen, der bei der nachfolgenden Belastungsinfektion zu einem signifikanten Anstieg der IgA-Immunantwort führte.
Als problematisch bei der Verwendung von S. typhimurium ist die beobachtete Instabilität der Bakterien nach der Transformation zu beurteilen. Nachdem zunächst angenommen wurde, dass die klonierten Gene für dieses Phänomen verantwortlich zu machen sind, geht man inzwischen davon aus, dass die Transformation der Bakterien insbesondere mit ‚high-copy’ Plasmiden (z.B.
pCMVß) diese in ihrer Fähigkeit, in den Wirtsorganismus einzudringen und sich in tieferen Geweberegionen anzusiedeln, behindern (COULSON et al. 1994;
GARMORY et al. 2002). Auch DARJI et al. (1997) konnten das in ihren
Experimenten verwendete pCMV-Plasmid, trotz erfolgter und erfolgreicher Immunantwort, nicht im Gewebe nachweisen.
