Bakterien als Carriersysteme für DNA-Vakzinen

Da Antigen-präsentierende Zellen eine wesentliche Rolle bei der Induktion von Immunantworten aufgrund von Impfungen mit Plasmid-DNA spielen, liegt es nahe, attenuierte Bakterien als Carrier-Systeme einzusetzen. Die Theorie der Plasmidübertragung sah zunächst folgendermaßen aus:

Die attenuierten Bakterien gelangen entweder in die Zielzellen, weil es sich bei diesen um Phagozyten handelt, oder die Mikroorganismen selbst Phagozytose auslösen. Es gelingt den Bakterien, die phagozytotische Vakuole bspw. durch

Nutzung ihrer eigenen Virulenzfaktoren zu verlassen. Im Zytosol kommt es dann zu einem Absterben der Mikroorganismen, die aufgrund ihrer Attenuierung bestimmte, im Wirt nicht vorhandene Nährstoffe exogen aufnehmen müssen.

Dabei wird das Expressionsplasmid freigesetzt und in den Zellkern der Wirtszelle aufgenommen, wo es schließlich zur Proteinexpression kommt (WEISS u. KRUSCH 2001).

Diese Theorie musste später insofern modifiziert werden, als dass auch für S. typhimurium ein Transfer von Expressionsplasmiden nachgewiesen werden konnte, dieses Bakterium jedoch innerhalb des Phagozytosevesikels verbleibt (DARJI et al. 1997; WEISS u. KRUSCH 2001). Dieser Transfer ist allerdings bisher nur in Primärmakrophagen und nicht in Zelllinien gelungen. NORBURRY et al. (1995) und RODRIGUEZ et al. (1999) berichten über spezielle Transportwege bei dendritischen Zellen und aus dem Knochenmark stammenden aktivierten Makrophagen, die einen Transfer von Makromolekülen aus den endocytotischen Vesikeln in das Zytosol ermöglichen. Ob diese Art von DNA-Transport auch hier stattfindet, ist ungeklärt. Möglich ist auch, dass das sekretorische System der Bakterien auf bisher unbekannte Weise die Expressionsplasmide in das Zytosol entlässt (WEISS u. KRUSCH 2001).

Da Salmonellen in infizierten Makrophagen auch Apoptose auslösen können, wird darüber hinaus diskutiert, ob die DNA von benachbarten dendritischen Zellen aufgenommen und dort exprimiert wird (SHATA et al. 2000).

Der Einsatz von attenuierten Bakterien als Carrier zur mukosalen Immunisierung bietet Vorteile im Vergleich zur DNA-Vakzinierung per injectionem.

Da über 90% der viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen über mukosale Oberflächen ihren Weg in den Wirtsorganismus finden, erscheint es sinnvoll, den körpereigenen Schutz dort besonders zu verstärken (SIRARD et al. 1999).

Viele Bakterien visieren Zellen des Immunsystems als Zielzellen an. Die Übertragung von Plasmiden und die Expression von Antigenen sowie die

Reaktion darauf, ist dort besonders effizient. Die Zellwandbestandteile der Bakterien sowie nicht-methylierte DNA-Motive des bakteriellen Genoms können als Adjuvantien fungieren und die Immunreaktion positiv verstärken.

Die Bakterien und ihre Expressionsplasmide sind dabei als getrennte Reaktionseinheiten zu betrachten und die Modulation der Immunantwort ist sowohl über Änderungen am Expressionsplasmid, als auch durch die Wahl anderer Bakterienstämme möglich.

Darüber hinaus sind Bakterien kosteneffektiv zu produzieren, problemlos zu lagern und durch den Einsatz von Antibiotika leicht zu kontrollieren.

Die bisherigen Arbeiten mit Bakterien als Carrier für mukosale genetische Immunisierung konzentrieren sich im Wesentlichen auf S. typhimurium, S. typhi, Shigella (S.) flexneri und L. monozytogenes.

2.3.3.1. S. typhimurium als Carrier für DNA-Vakzinen

S. typhimurium aroA SL 7207 ist wie S. flexneri ein gram-negatives Bakterium, welches fakultativ intrazellulär parasitiert (SCHWARZ et al. 1995). Seine Attenuierung basiert auf der Deletion bestimmter Gene, die es abhängig von der Zufuhr von Paraaminobenzoesäure machen. Diese ist im Säuger nur in geringen Mengen vorhanden, so dass es zu einer Lyse der Mikroorganismen aufgrund einer gestörten Zellwandsynthese kommt (DIETRICH et al. 1999, HOSIETH u. STOCKER 1981).

Die Bakterien gelangen nach oraler Applikation in den Darm. DARJI u. WEISS (1999) wie auch MEDINA et al. (1999) vermuten, dass die Salmonellen über spezialisierte M-Zellen in die Darmwand des Wirtsstieres eindringen. JEPSON u. CLARK (1999) gehen insofern über diese Theorie hinaus, als dass sie davon ausgehen, dass die Salmonellen zunächst die M-Zellen als Eintrittsort wählen, es aber gleichzeitig zu einer großflächigen Schädigung sowohl der M-Zellen, als auch des benachbarten Follikel-assoziierten Epithels kommt. Als Folge können

die Salmonellen in ausgedehnten Bezirken ungehindert in den Wirtsorganismus eindringen.

Obwohl S. typhimurium, wie schon ausgeführt, in den Phagosomen der Wirtszelle verbleibt, kommt es dennoch zu einer effizienten Expression von Plasmid-kodierten Reportergenen. DARJI et al. (2000) gelang es, Mäuse vor einer Erkrankung durch Listeria monozytogenes durch die orale Vakzinierung mit S. typhimurium zu schützen. Die Salmonellen waren mit einem Plasmid transformiert, in welches das Gen für Listeriolysin bzw. für ActA, ein Membran-Protein, kloniert worden war. Es kam dabei sowohl zu einer zellulären, als auch einer humoralen Immunreaktion der BALB/c-Mäuse. Versuche mit anderen Mäuserassen ergaben allerdings, dass es hier nicht zur Bildung spezifischer Antikörper kam, eine T-Zell-Antwort hingegen induziert werden konnte.

DARJI et al. (2000) fanden außerdem heraus, dass die Effizienz der Immunisierung deutlich verbessert werden konnte, wenn die Bakterien unter weitgehend anaeroben Bedingungen herangezogen wurden und zugleich die NaCl-Konzentration des Mediums erhöht wurde.

FAGAN et al. konnten 2001 in Schweinen durch die Verabreichung von attenuierten Salmonellen, welche mit einem rekombinanten Antigen von Mycoplasma hyopneumoniae transformiert waren, einen ‚priming effect’

erzeugen, der bei der nachfolgenden Belastungsinfektion zu einem signifikanten Anstieg der IgA-Immunantwort führte.

Als problematisch bei der Verwendung von S. typhimurium ist die beobachtete Instabilität der Bakterien nach der Transformation zu beurteilen. Nachdem zunächst angenommen wurde, dass die klonierten Gene für dieses Phänomen verantwortlich zu machen sind, geht man inzwischen davon aus, dass die Transformation der Bakterien insbesondere mit ‚high-copy’ Plasmiden (z.B.

pCMVß) diese in ihrer Fähigkeit, in den Wirtsorganismus einzudringen und sich in tieferen Geweberegionen anzusiedeln, behindern (COULSON et al. 1994;

GARMORY et al. 2002). Auch DARJI et al. (1997) konnten das in ihren

Experimenten verwendete pCMV-Plasmid, trotz erfolgter und erfolgreicher Immunantwort, nicht im Gewebe nachweisen.