Funktionsstudien von Vektor und Carriersystem in vivo

Um die Erfolgsaussichten dieses Systems auch in vivo zu beurteilen, sollte zunächst untersucht werden, ob die attenuierten Salmonellen nach Injektion in intestinale Loops in der Lage sind, in das Darmepithel des Schweines einzudringen.

Allgemein wird angenommen, dass die Salmonellen spezielle Zellen des gut associated lymphatic tissue (GALT), die M-Zellen, als Eintrittspforte in den Wirt nutzen (DARJI et al. 1997, MEDINA et al. 1999) Die histologischen Untersuchungen des Darmgewebes im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass die in die Loops injizierten Salmonellen in das oberflächliche Epithel des Dünndarmes eingedrungen waren und diesem nicht nur anheftete. Es konnte anhand der Gewebeschnitte allerdings keine eindeutige Zuordnung von Oberflächenepithel und den dazugehörigen Lymphfollikeln getroffen werden, anhand derer sich die These beweisen ließe, dass die Salmonellen das Gewebe tatsächlich nur im Bereich der M-Zellen/Peyerschen Platten durchdringen (MEDINA et al. 1999).

Die Dosis sowohl für die Injektion in die Darmloops, als auch für die ersten Immunisierungen, bei denen die Plasmide pCMVß, pSecTag2AE2 bzw.

pCMVE2 oral verabreicht wurden, lag bei ca. 5 x 10⁹

S. typhimurium aroA SL 7207. Diese Dosierung wurde in Anlehnung an die Versuche zur oralen Immunisierung bei Mäusen gewählt. Auch der zur Vakzinierung gegen S. typhimuirum – Infektionen eingesetzte S. typhimurium Lebendimpfstoff SALMOPORC enthält diese Dosis (SPRINGER et al. 2001).

Zudem ist die Applikation höherer Dosen, als die in diesem Projekt gewählten, nicht praktikabel.

Die Auswertung der Gewebeschnitte ergab weiterhin, dass die Salmonellen offensichtlich nur sehr kurze Zeit im Darm überleben, was mit den von DARJI et al. (1999) gemachten Beobachtungen übereinstimmt. Im jejunalen Darmabschnitt konnten zahlreiche fluoreszierende Bakterien im oberflächlichen Epithel nachgewiesen werden, in den ilealen Abschnitten, die zeitlich etwas später entnommen wurden, verhältnismäßig weniger.

Aufbauend darauf musste untersucht werden, ob es nach der Invasion der Carrier-Bakterien in das Darmgewebe zur gewünschten Freisetzung der Vektoren mit nachfolgender Proteinexpression kommt.

Im Jejunum konnte die Expression des GFP-Proteins nach 3 Stunden nachgewiesen werden, nicht jedoch in denjenigen Gewebeproben, die 24 Stunden alt waren, bzw. aus dem Ileum stammten. Auch LOEHR et al. (2000) beschreiben eine gute mukosale GFP-Fluoreszenz bei direkter DNA-Injektion nach 6 Stunden, während nach 24 Stunden kaum noch fluoreszierende Zellen zu finden waren.

Eine mögliche Ursache für die fehlende Fluoreszenz in den ilealen Gewebeproben könnte eine Beschädigung des Proteins bei der Herstellung der histologischen Schnitte sein. Aufgrund der Empfindlichkeit von GFP wurde beispielsweise auf die sonst übliche Aceton-Fixierung des Gewebes verzichtet.

Die Expression der Plasmide aus den Carrierbakterien heraus kann aufgrund der sehr homogenen zytoplasmatischen Fluoreszenz ausgeschlossen werden.

Im nächsten Schritt musste nun bewiesen werden, dass es auch nach oraler Applikation von pCMVß zu einer Expression des Reportergens im Wirtstier kommt.

Aufgrund der unter 4.4.4. beschriebenen Schwierigkeit, die Expression des LacZ-Gens mittels Farbreaktion im Gewebe zu beurteilen, wurde zum Nachweis des Reportergens auf eine PCR-Reaktion zurückgegriffen. Damit gelang es, das gewünschte Fragment zu amplifizieren und somit zu beweisen, dass das Plasmid nach oraler Applikation ins Zielgewebe des Versuchstiers gelangte. Es ist unwahrscheinlich, dass das mittels PCR-Reaktion erzeugte Vektor-LacZ-Amplifikat noch direkt aus residualen Salmonellen stammte, denn die letzte orale Applikation der attenuierten Bakterien lag mehr als 72 Stunden zurück.

Darüber hinaus wurden die Gewebeproben nach der Entnahme gründlich gespült. Auch von einer längeren Überlebenszeit der Salmonellen ist aufgrund der Ergebnisse der Vorversuche und den Berichten in der Literatur nicht auszugehen. Da keine PCR-Reaktion zum Nachweis von residualen Salmonellen in diesem Gewebe durchgeführt wurde, ist es allerdings auch nicht auszuschließen, dass sich das nachgewiesene Plasmid noch in seinem Salmonellenvektor befand.

Auf der Basis dieses Ergebnisses konnte auch keine Aussage getätigt werden, ob es nach der oralen Verabreichung der Bakterien zur gewünschten Genexpression im Wirt kommt.

Auf die Wiederholung des Versuches mit einem anderen, intestinal besser zu identifizierenden Reportergens wurde allerdings zugunsten der Untersuchung der Eignung von pSecTag2AE2 unter in vivo Bedingungen verzichtet. Die mit dem plasmidkodierten Gen transformierten Salmonellen wurden analog dem Vorgehen in den Vorversuchen zunächst in verschiedene jejunale und ileale Loops injiziert.

Anders als beim GFP-Reportergen gelang es, die E2-Expression in einigen Zellen in beiden Darmabschnitten nachzuweisen. Allerdings konnte auch hier

keine Fluoreszenz in denjenigen Geweben, die erst 24 Stunden nach der Applikation entnommen wurden, beobachtet werden.

Nachdem feststand, dass die Salmonellen nach direkter intestinaler Applikation ihre Carrierfunktion erfüllen und es zur E2-Expression im Wirtstier kommt, wurden zwei Gruppen von Läuferschweinen die beiden Konstrukte pCMVE2 und pSecTag2AE2 oral verabreicht. Die Tiere waren vor der Applikation der Salmonellen mittels Untersuchung von Serum- und Sammelkotproben negativ auf Salmonellen getestet.

Die Tatsache, dass bei zwei Tieren der mit pSecTag2AE2 immunisierten Gruppe nach der oralen Applikation mittels ELISA-Technik Antikörper gegen S. typhimurium nachgewiesen werden konnten, bestätigt, dass die Bakterien den Wirt besiedeln konnten. Ein möglicher Grund für die negative Antikörperantwort der beiden anderen Tiere der Gruppe könnte in einer mangelnden Sensitivität des verwendeten ELISAs liegen, andererseits erfolgte die Immunantwort der antikörperpositiven Tiere erst eine bzw. zwei Wochen nach der dritten Salmonellenapplikation, so dass eher von einer mangelnden Induktion der Bakterien auszugehen ist. Unterstellt man, dass die verabreichte Dosis ausreichend hoch gewesen ist, so ist denkbar, dass beispielsweise die Transformation der Bakterien mit den ‚high-copy’-Plasmiden diese in ihrer Fähigkeit, in den Wirtsorganismus einzudringen, behindern (COULSON et al.

1994). Unterstützt wird diese Theorie von der Tatsache, dass das Plasmid pSecTag2AE2 sich sehr stabil in den Salmonellen anzüchten ließ und somit eine relativ große Anzahl an Bakterien in ihrer Fähigkeit, den Wirtsorganismus effizient zu besiedeln, beeinträchtigt sind. Andererseits kam es in der zweiten Gruppe, die mit pCMVE2, immunisiert wurde, nicht zur Ausbildung einer messbaren Antikörperbildung gegen Salmonellen. Da aber dieses ‚high copy’-Plasmid bei der Anzucht in Salmonellen sehr instabil war und somit ein Teil der Salmonellen in der Lage gewesen sein müsste, den Vektor und damit auch das Plasmid auszuschleusen und ungehindert in die Darmwand einzudringen , kann

die mangelnde Antikörperantwort nicht allein auf den Einsatz des ‚low-copy’-Plasmids‚ zurückzuführen sein.

Die Ergebnisse des ersten Immunisierungsversuches führten nicht zum gewünschten Nachweis der Antikörperbildung gegen das E2-Protein. Neben den oben ausgeführten möglichen Defiziten der Salmonellen als effiziente Carrier der gewählten Expressionsplasmide, war es auch denkbar, dass im Schwein eher die T-Zell-Antwort bei dieser Art der Immunisierung im Vordergrund steht und sich die beobachtete Antikörperbildung im Mausmodell nicht mit der beim Schwein vergleichen lässt.

Die in die Expressionsplasmide klonierten E2-Gene enthielten neben B-Zell-Epitopen gleichzeitig auch 5 Sequenzen für T-Zell-Epitope (ARMENGOL et al., 2002), so dass eine Untersuchung der zellulären Immunmechanismen sinnvoll möglich war.

Der Versuch einer gezielten Stimulation der T-Lymphozyten unter Einsatz eines BrdU-Lymphozytenproliferationskits wurde zwar durchgeführt, konnte aber nicht ausgewertet werden, da das in der Blutprobe enthaltene Lithium-Heparin die Zellen so stark schädigt, das funktionelle Studien nicht mehr möglich sind (LEIBOLD, persönliche Mitteilung 24.10.03).

Auch wenn der Einsatz der transformierten Bakterien nicht unmittelbar in der eindeutigen Ausbildung einer stabilen humoralen Immunantwort resultierte, so war es doch möglich, dass zumindest ein ‚priming-effect’ im Immunsystem der Schweine erzielt werden konnte.

Um dies zu beurteilen, wurden die mit den beiden E2-Klonen vorbehandelten Tiere mit einem kommerziell erhältlichen E2-Impfstoff gegen das KSPV geimpft.

Die Auswertung dieses Versuchsansatzes ergab schließlich in der mit pSecTag2AE2-immunisierten Gruppe einen messbaren Effekt. Die Schweine dieser Gruppe entwickelten schneller als die Kontrolltiere Antikörpertiter, die zudem über den gesamten Messzeitraum höher als bei der Vergleichsgruppe waren. Da die Titer zwischen den beiden Gruppen allerdings nie um mehr als eine Titerstufe differierten, können diese Ergebnisse einen ‚priming-effect’ nicht

belegen. Gleichzeitig kam es aber bei der mit pCMVE2-immunisierten Gruppe nur zu einer sehr langsamen Bildung von Antikörpern, die zudem über den Messzeitraum betrachtet stets um bis zu einer Titerstufe unterhalb der Kontrollgruppe lagen, und so erscheint es möglich, dass das Ergebnis des Klons pSecTag2AE2 nicht nur zufällig, sondern auf einen Effekt des Plasmids zurückzuführen ist.

Zum Zeitpunkt der geplanten Durchführung des Virus-Challenge gab es vermehrt Hinweise, dass das Zusammenspiel zwischen Plasmiden und attenuierten Salmonellen ein wesentlicher Faktor beim Einsatz von S. typhimurium aroA SL 7207 als Carrier ist (COULSON et al. 1994, GARMORY et al. 2002, S.Weiss, persönliche Mitteilung v. 02.10.02).

Aus diesem Grund wurden bei der Durchführung des Challenge-Versuches neben pSecTag2AE2 auch Plasmide mit ‚low-copy’-origins of replication eingesetzt (pCMVE2n, pSecTag2AE2n). Da für den Vektor pCMVE2 bis zu diesem Zeitpunkt keine immunstimulatorischen Effekte nachgewiesen werden konnten, wurde auf den Einsatz dieses Plasmides verzichtet.

Eine weitere Änderung im Vergleich zu den Vorversuchen bestand in einem zusätzlichen Einsatz des Salmonellen-Impfstammes SALMOPORC. Es handelt sich hierbei um einen zugelassenen S. typhimurium-Impfstamm, der zur Bekämpfung der porcinen Salmonellose auf dem Markt ist. Vorteilhaft ist hierbei, dass sein Einsatz als Carrier in der geplanten Vakzine aufgrund der bereits für die Zulassung durchgeführten Sicherheitsuntersuchungen einfacher wäre, als bei den bisher noch nicht näher charakterisierten S. typhimurium aroA SL 7207.

Gleichzeitig war seine Invasivität gesichert, so dass es problemlos möglich war, SALMOPORC in den Challenge-Versuch zu integrieren.

Die verabreichte Salmonellendosis wurde im Vergleich zu den Vorversuchen auf ca. 5 x 10¹¹ Bakterien angehoben, um zu versuchen, mögliche Plasmid-Salmonellen-Interaktionen, die die Invasivitätsrate reduzieren, auszugleichen.

Als Virusisolat wurde aufgrund seiner Verwandtschaft zu den Isolaten CSF 0905 und CSF 0170, sowie seiner hohen Virulenz, CSF 0634 ausgewählt. Ein geringvirulentes Isolat kam dabei nicht in Frage. Zum einen waren die Schweine aufgrund der vorangegangenen Immunisierungen zum Zeitpunkt der geplanten Infektion etwa 4 Monate alt. Dies erschwerte eine Infektion, denn mit zunehmendem Alter werden die Tiere weniger empfänglich für das Virus.

Darüber hinaus sollte mit der Auswahl des Isolates gesichert sein, dass die Kontrollgruppe an KSP erkrankt, um die mögliche protektive Wirkung der Immunisierung in den anderen Gruppen besser beurteilen zu können. Der Einsatz eines geringvirulenten Isolates hätte aber möglicherweise bei mehreren Tieren nicht zum Ausbruch der Krankheit geführt.

Um in einer Mehrzahl der Fälle eine Erkrankung zu erhalten, wurde eine Virusdosis von 10^5,5 KID50 eingesetzt. Die Einhaltung des natürlichen Infektionsweges über den Nasen-Rachenraum sollte die authentische Ausbreitung des Virus in den Versuchtieren gewährleisten. Zur Beurteilung des Infektionsverlaufes am lebenden Tier wurden neben den klinischen Untersuchungen Blutproben herangezogen.

Die Kontrollgruppe hatte nicht-transformierte Salmonellen erhalten und wurde ebenfalls mit dem CSF 0634 infiziert. Diese Tiere zeigten die bei Einsatz eines hochvirulenten KSP-Virus zu erwartenden klinischen Reaktionen, Leukopenie und das Auftreten von infektiösem Virus im Blut.

Die Challenge-Infektion rief bei den mit pSecTag2AE2n (SALMOPORC), sowie den beiden mit pCMVE2n (SALMOPORC und S. typhimurium aroA SL7207) immunisierten Versuchstieren eindeutige klinische Symptome hervor. Diese Schweine mussten, ebenso wie ein weiteres Tier aus der mit pSecTag2AE2 (SALMOPORC) immunisierten Gruppe, moribund euthanasiert werden.

Auffällig war bei diesen Tieren eine frühzeitig auftretende, bis zur Tötung der Tiere anhaltende Leukopenie. Um auch Erkenntnisse in Bezug auf das Verhalten einzelner Blutzellpopulationen zu erhalten, wurden durchflußzytometrische Analysen durchgeführt. Es kam dabei zu einer sehr frühen Abnahme der IgM⁺-Fraktion, die vor allem aus B-Zellen besteht. Die beobachtete Depletion steht in Übereinstimmung mit Befunden von VAN OIRSCHOT (1988), der eine relative Abnahme sIg⁺-Zellen nach Infektion mit dem hochvirulenten Isolat Brescia beobachtete. Die CD4⁺-Zellen verhielten sich bei den einzelnen Tieren sehr unterschiedlich. Dies wurde allerdings auch schon von SUMMERFIELD et al. (2001) beschrieben. Auch bei den CD8⁺-Zellen war die Entwicklung in den einzelnen Gruppen sehr heterogen. Bis etwa 10 Tage p.i. kam es in allen Gruppen zu einer Abnahme dieser Zellpopulation, was ebenfalls in Übereinstimmung mit den von SUMMERFIELD et al. (2001) gemachten Beobachtungen steht, danach erhöhten sich die Zellzahlen z.T. wieder.

Auch die Analyse der Granulozyten-Subpopulation, sowie die der monozytoiden Zellen ergab keine Hinweise auf eine stattgefundene spezifische Immunstimulation durch eines der verabreichten Plasmide. Möglicherweise kamen aber aufgrund der kleinen Tierzahl auch die individuellen Schwankungen unverhältnismäßig stark zum Tragen und verfälschten so die Entwicklungen.

Zur Analyse der Erregerausbreitung über das Blut wurde Virus aus den Leukozyten der Versuchstiere isoliert. Dies gelang bei allen Tieren in allen Gruppen ab Tag 6 p.i. Darüber hinaus wurden ab Tag 13 p.i. neutralisierende Antikörper im Serum aller Tiere nachgewiesen. Da die Schweine der Kontrollgruppe bereits ab Tag 17 p.i. verstorben waren, gelang es nicht, die Entwicklung der Antikörpertiter gruppenweise zu vergleichen und so mögliche Unterschiede zu erfassen.

Zwei der drei mit pSecTag2AE2 (SALMOPORC) immunisierten Tiere unterschieden sich in ihrer Reaktion auf die Belastungsinfektion deutlich von den übrigen Versuchstieren. Bei beiden Tieren (169, 170) kam es während des Versuches zu einer geringgradigen Erhöhung der Körpertemperatur, es traten keine sonstigen klinischen Symptome auf. Es ist auszuschließen, dass die milde Reaktion der Tiere auf den Virus-Challenge mit ihrem Alter in Verbindung steht. Zwar sind ältere Tier generell weniger empfänglich für eine Infektion, jedoch erkrankten alle anderen, gleichaltrigen Tiere in den verschiedenen Versuchsgruppen akut. Auch erscheint es zumindest sehr unwahrscheinlich, dass die beiden Tiere als einzige statt an der akuten an der klinisch milden bzw.

inapparent verlaufenden Form der KSP erkrankt sind, denn diese wird v.a. nach Infektionen mit schwach- und nicht mit hochvirulenten Isolaten beobachtet (VAN OIRSCHOTT, 1988).

Aufgrund der Art der Durchführung der Infektion kann zudem ausgeschlossen werden, dass die Tiere möglicherweise gar nicht oder mit einer sehr geringen Virus-Dosis infiziert wurden. Die virale Infektionsdosis wurde für alle Gruppen zusammen angesetzt und anschließend aliquotiert. Zudem beweisen die positiven Virusisolierungen aus den Leukozyten, sowie die Ausbildung eines protektiven Antikörpertiters, dass auch diese Schweine eine KSP-Infektion durchmachten.

Es kam weiterhin generell zu einer bis Tag 13 p.i. andauernden Depletion der Gesamtleukozyten, danach stiegen die Werte wieder etwas an.

Allgemein wird das Ansteigen der Leukozytenzahlen zwar als Hinweis auf eine Erholung von akuter Schweinepest gesehen (KORN et al. 1973), die Werte blieben jedoch bei fast allen Tieren unter dem physiologischen Grenzwert von 10 G/l. Auch finden sich in der Finalphase letal verlaufender KSP durchaus neutralisierende Antikörper, aufgrund der vorangegangenen Schädigungen der verschiedenen Organsysteme kommt es aber dennoch zum Verenden der Tiere (LIESS et al. 1977). Immundepression mit nachfolgenden Sekundärinfektionen, endotheliale Schäden und die Bildung von Mikrothromben sind sicherlich daran

beteiligt (s. 2.2.1.3.). Darüber hinaus scheint eine dekompensierte intravasale Gerinnung beim Versterben der Tiere eine wichtige Rolle zu spielen (unveröffentlichte Studie, Institut für Virologie; A. MEINDL, persönliche Mitteilung vom 13.11.03).

Insgesamt kann aufgrund der Ergebnisse vermutet werden, dass die Immunisierung mit pSecTag2AE2 (SALMOPORC) zu einem partiellen Schutz gegenüber der Infektion mit dem hochvirulenten KSPV bei den beiden Tieren führte.

Man könnte allerdings auch einwenden, dass die Tiere möglicherweise durch das Challengevirus immunisiert wurden. Dagegen spricht allerdings die Tatsache, dass alle anderen Tiere nach der Infektion mit dem hochvirulenten CSF 0634 erkrankten.

Interessant war die Auswertung der Untersuchung auf Antikörper gegen S. typhimurium. Alle Tiere waren vor Versuchsbeginn frei von Ak, die Kontrolluntersuchung nach erfolgter doppelter oraler Applikation ergab außer bei den beiden klinisch unauffälligen Tieren positive Titer. Über den Zusammenhang zwischen diesem Befund und dem Ausgang der Belastungsinfektion kann nur spekuliert werden. Unter Umständen ist es aufgrund einer sehr effektiven zellulären Abwehr nach dem Durchdringen der Darmwand durch die M-Zellen bei den Tieren 169 und 170 nicht mehr zur Ausbildung von Antikörpern gekommen. Möglich ist auch, dass eine tiefe Penetration der Salmonellen in das Gewebe für die Induktion einer Immunantwort nicht unbedingt notwendig ist. DARJI et al. (1997) konnten beispielsweise zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Applikation die eingesetzten Salmonellenkonstrukte im murinen Gewebe nicht auffinden.

Trotzdem kam es in vivo zu einer protektiven Immunantwort.

5.4. Ausblick

Bisher ist über den Weg von der Verabreichung der DNA-Vakzine hin zur protektiven Immunantwort sehr wenig bekannt. Empirische Untersuchungen bringen v.a. im murinen System immer wieder neue Erkenntnisse dahingehend, in welchen Bereichen das System möglicherweise gewinnbringend einzusetzen wäre.

Bisher haben aber alle am nicht-murinen System durchgeführten Studien ergeben, dass sich die vielversprechenden Ergebnisse in der Maus nicht 1:1 auf größere Tiere übertragen lassen und die Immunantwort z.T. enttäuschend ausfällt. Es kam in verschiedenen Großtiersystemen und im Menschen zu sehr unterschiedlichen Immunreaktionen, die zudem häufig nur durch multiple und sehr große Plasmiddosen zu erzielen waren (BABIUK et al. 2002, TURNES et al. 1999, UGEN et al. 1998). Zugleich konnte allerdings auch nachgewiesen werden, dass durch DNA Vakzinen ein effizienter ‚priming effect’ im Immunsystem dieser Großtiere erzielt werden kann (ROBINSON et al. 1999).

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Erhöhung der Salmonellendosis im Challengeversuch (x 1000 im Vergleich zu den Vorversuchen) führte nicht zu einer zufriedenstellenden Immunantwort. Es steht zu vermuten, dass die Ursache eher in einer suboptimalen Freisetzung der Plasmide, denn in einer zu geringen verabreichten Bakteriendosis liegt. Es wäre hierbei interessant zu untersuchen, ob die Integration beispielsweise von Interleukinen die Immunreaktion verstärken könnte.

Problematisch bei der Beurteilung der Ergebnisse ist, dass die Vorgänge auf zellulärer Ebene bisher nur Hypothesen sind. Gleiches gilt für die Mechanismen, die es den Salmonellen erlauben, plasmidkodierte Gene in die verschiedenen Wirtstierorganismen zu bringen und dort die Expression der gewünschten Proteine zu ermöglichen. In Zusammenarbeit mit einer anderen Arbeitsgruppe soll deshalb versucht werden, auch unter Einsatz des hier

verwendeten Carriersystems, die zellulären Ereignisse näher zu charakterisieren.

Aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse erscheint es auch sinnvoll den Vektor pSecTag2AE2 (SALMOPORC) nochmals in einem in vivo Versuch, diesmal mit einer größeren Tierzahl, einzusetzten, um die Ergebnisse des Challenge-Versuches zu verifizieren. Zur Beurteilung des Effektes wäre es sicherlich auch interessant, den ‚low-copy’ pSecTag2AE2-Vektor vergleichend einzusetzen und darüber hinaus die Kinetik der Antikörperbildung gegen S. typhimurium genauer zu betrachten.

Möglich wäre auch, die Plasmide in einem anderen u.U. stabileren Carriersystem, z.B. in Bacillussporen einzusetzen. Zahlreiche Bacillus spp.

werden bereits als sogenannte Probiotika im Lebensmittelbereich eingesetzt, wobei der immunstimulatorische Effekt, der von den Sporen ausgeht, ausgenutzt werden soll (OGGIONI et al. 2003).

Trotz der Problematik der Etablierung einer Carrier-gebundenen DNA-Vakzine beim Großtier, erscheint es sinnvoll, diesen Weg weiter zu verfolgen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dargestellt werden, dass auch porcine Zellen für diese Art der Vakzinierung empfänglich sind. Die Immunantwort zu verstärken und zu verbessern wird Gegenstand künftiger Projekte sein.

6. Zusammenfassung

Christiane Linne

Entwicklung einer oral applizierbaren Vakzine gegen das Virus der Klassischen Schweinepest – vorrangig zum Einsatz beim Schwarzwild

Untersucht wurde die Eignung von attenuierten Salmonellen (S. typhimurium aroA SL 7207) als oral applizierbare Carrier für eine, ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit zu erstellende E2-basierte DNA-Vakzine. Der eingesetzte Salmonellenstamm ist im murinen System bereits erfolgreich eingesetzt worden.

Das E2-Gen des KSP-Virus wurde in die eukaryontischen Expressionsplasmide pCMV (high-copy), pCMV (low-copy) und pSecTag2A (low-copy) kloniert.

Darüber hinaus wurde das im Institut für Virologie vorhandene Konstrukt pSecTag2AE2 in die Untersuchungen einbezogen.

Mittels direkter und indirekter Immunperoxidase-Färbung, sowie Western-blotting konnte die transiente Expression der authentischen Proteine in Zellkultur nachgewiesen werden.

Auf primären porcinen Makrophagen wurde die Eignung von S. typhimurium als Carrier in vitro untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Plasmide

Auf primären porcinen Makrophagen wurde die Eignung von S. typhimurium als Carrier in vitro untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Plasmide

Im Dokument Entwicklung einer oral applizierbaren DNA-Vakzine gegen das Virus der Klassischen Schweinepest (Seite 152-170)