Virus-Challenge

4.4.8.1. Untersuchung der Schutzwirkung der plasmidtransformierten Salmonellenvakzine gegen CSFV-Belastungsinfektion

Mit insgesamt 15, zuvor zweimalig im Abstand von ca. 3 Wochen mit plasmidtransformierten Salmonellen (Dosis ca. 5 x 10¹¹ Bakterien) immunisierten Tieren sollte untersucht werden, ob es bei Infektion mit dem hochvirulenten KSP-Virusisolat 0634 zur Ausbildung einer belastbaren humoralen und/oder zellvermittelten Immunität kommt. Alle Tiere waren vor Beginn des Versuches im ELISA frei von Antikörpern gegen Salmonellen. Zwei Wochen nach der zweiten oralen Bakterienapplikation wurden die Tiere intranasal infiziert.

Tab. 6: Immunisierungsschema und Aufbau des Belastungsversuches.

Die Schweine waren in Gruppen zu jeweils drei Tieren in einem gemeinsamen Stallabteil (Gruppe 1-5) untergebracht und anhand ihrer Ohrmarken zu identifizieren (Spalte zwei (Tiernummern)). Sie wurden mit unterschiedlichen Plasmidkonstrukten (3.1.3.3.) und zwei verschiedenen Salmonellenstämmen (3.1.3.2.; 3.1.3.7.) behandelt. Zur Methodik der Transfektion vgl.3.2.6.; 4.1.1.)

4.4.8.2. Untersuchung auf die Bildung von Antikörpern gegen S. typhimurium Um den Erfolg der oralen Applikation der transformierten Salmonellen zu überwachen, wurden die Tiere vor der Infektion mit dem CSF 0634 nochmals mittels ELISA-Technik auf die Entwicklung von Antikörpern gegen die Bakterien untersucht (3.2.1.3.; durchführendes Labor: IVD, Bischofholer Damm, Hannover). In den Gruppen 1-3 und 5 konnten Antikörper gegen S. typhimurium

Gruppe Tiernr. Salmonellenstamm Plasmid Anzahl der Immunisierungen

Isolat

1 160-162 S. typhimurium aroA SL 7207 pCMVE2n 2 (im Abstand von 3

Wochen) CSF 0634

2 163-165 SALMOPORC pCMVE2n 2 (im Abstand von 3

Wochen) CSF 0634

3 166-168 SALMOPORC pSecTag2AE2n 2 (im Abstand von 3 Wochen)

CSF 0634 4 169-171 SALMOPORC pSecTag2AE2 2 (im Abstand von 3

Wochen) CSF 0634

5 171-173 S. typhimurium aroA SL 7207 kein Plasmid

(Kontrollgruppe) 2 (im Abstand von 3

Wochen) CSF 0634

nachgewiesen werden. In der Gruppe 4 galt dies ebenfalls für Tier 171, nicht jedoch für die Tiere 169 und 170. Die Daten sind hier nicht aufgeführt.

4.4.8.3. Das klinische Bild

Für die Darstellung der Entwicklung der Körpertemperaturen vgl. auch Abb. 13 auf den folgenden Seiten und 8.7.1., Tab.9.

Gruppe 1 (160 - 162)

Alle Tiere reagierten ab 4 dpi mit einem Anstieg der Körpertemperatur²⁰. Ab 5 dpi (days post infection) (161), 6 dpi (160) bzw. 9 dpi (162) kam es zu Fieber, zu dem ab 10/11 dpi Hautveränderungen (zu Beginn mit Hyperämie, später mit z.T. ausgeprägten Hämorrhagien), Durchfall und Teilnahmslosigkeit kamen.

Zugleich fielen Appetitlosigkeit und zunehmende Bewegungsstörungen auf. Die Tiere wurden an 17 dpi (160), 20 dpi (161) bzw. 15 dpi (162) aufgrund ihres moribunden Zustandes euthanasiert.

Gruppe 2 (163 - 165)

Bei Tier 163 traten ab 6 dpi Fieber sowie weitere klinische Symptome, die denen in Gruppe 1 vergleichbar waren, auf. Bei Tier 164 war dies schon ab 4 dpi der Fall. Tier 165 entwicklelte ab 10 dpi Fieber und zeigte zusätzliche Symptome, die ebenfalls Hauthämorrhagien, Bewegungsstörungen, Durchfall und Appetitlosigkeit umfassten. Die Tiere wurden aufgrund ihres schlechten Zustandes an Tag 16 (163), 15 (164) und 15 (165) p.i. eingeschläfert.

Gruppe 3 (166 - 168)

Das klinische Bild entsprach bei allen drei Tieren dem der Tiere aus den ersten beiden Gruppen. Fieber trat an den Tagen 12, 4 bzw. 9 p.i. erstmalig auf, die ersten weiteren klinischen Symptome zeigten sich ab den Tagen 12 (166) bzw.

10 (167, 168). Die Tiere wurden 20 (166;168) bzw. 16 (167) Tage nach der Infektion mit dem KSP-Virus eingeschläfert.

Gruppe 4 (169 - 170)

Tier 171 entwickelte mit Tag 10 p.i. die ersten klinischen Symptome (inkl.

Fieber). Aufgrund seines schlechten Zustandes wurde es 17 Tage p.i.

euthanasiert.

Ganz anders verhielt es sich bei den anderen Tieren dieser Gruppe. Bei diesen Tieren war zwischen Tag 4 p.i. die Temperatur gering- (170) bis mittelgradig (169) erhöht, ab Tag 18 bzw. 20 p.i. lag sie wieder innerhalb der physiologischen Schwankungsbreite. Die Tiere wiesen keine weiteren klinischen Symptome auf und überlebten die Belastungsinfektion.

Gruppe 5 (172 - 174)

Zwei Tiere der Kontrollgruppe entwickelten sehr früh p.i. Fieber (172 – 5 dpi, 173 – 4 dpi) und ab Tag 9 p.i. weitere klinische Symptome, die denen, die in den anderen Gruppen auftraten vergleichbar waren. Tier 174 zeigte wie seine Gruppengenossen ab Tag 6 p.i. Fieber und ebenfalls ab Tag 9 p.i. klinische Symptome, die auf eine Infektion hindeuteten.

Abb. 13: Entwicklung der Körpertemperaturen im Verlauf der CSFV- Belastungsinfektion²¹’22.

Zur Beurteilung des Impferfolges in den einzelnen Immunisierungsgruppen wurde als ein Merkmal die Entwicklung der Körpertemperaturen nach erfolger Virusinfektion mit CSF 0634 (3.1.3.4.) herangezogen. Das Entstehen von Fieber wurde dabei als Beginn einer klinischen Infektion mit der Klassischen Schweinepest gewertet.

In den Grafiken sind die Körpertemperatur auf der Y-Achse, sowie die Tage nach erfolgter Virusinfizierung (X-Achse) aufgetragen. Zudem sind zur besseren Übersicht der zur Immunisierung verwendete Salmonellenstamm sowie das eingesetzte Plasmid aufgeführt.

Entwicklung der Körpertemperatur (S. typhimurium aroA SL 7207 pCMVE2n)

37,0

21 Ein Abbrechen der einzelnen Kurven signalisiert, dass das jeweilige Tier zwischen dem Zeitpunkt der Ermittlung des letzten Messwertes und dem nächsten, geplanten Blutentnahmezeitpunkt aufgrund eines moribunden Zustandes euthanasiert werden musste.

22 An Tag 2 p.i. wurde die Körpertemperatur nicht gemessen, da die klinisch gesunden Tiere zur Blutentnahme nüchtern sein sollten, die Temperaturmessung aber nur bei gefülltem Futtertrog

Entwicklung der Körpertemperatur

Entwicklung der Körpertemperatur

4.4.8.4. Entwicklung der Gesamtleukozytenzahlen im peripheren Blut unter der CSFV-Belastungsinfektion.

Bei einer akuten CSFV-Infektion gehört eine ausgeprägte Leukopenie, die bei Infektionen mit hochvirulenten Isolaten bereits kurz nach der Infektion zu beobachten ist, zu den markantesten Veränderungen (VAN OIRSCHOT, 1988).

Der Abfall der Leukozytenzahlen unter den physiologischen Wert von 10 G/l (10⁹/l) (PLONAIT, 1980) kann häufig schon vor dem Anstieg der Körpertemperatur nachgewiesen werden (DUNNE, 1973).

Für die folgende Darstellung der Entwicklung der Gesamtleukozytenzahlen vgl.

auch Abb. 14 auf den folgenden Seiten und 8.7.2., Tab.10.

Aus frisch gewonnenem, mit EDTA versetztem Vollblut wurden nach Lyse der Erythrozyten die Gesamtleukozytenzahlen ermittelt (3.2.11.2.2. f.) Vor der Infektion lagen bei zwei Tieren (169, 171) mit 9,75 G/l geringgradig erniedrigte Werte vor, bei allen anderen Tieren bewegten sich die Werte im Normbereich (arithmetisches Mittel ( x) 11,7 G/l).

Am dritten Tag p.i. lagen die Leukozytenzahlen im peripheren Blut bei allen Tieren ≤ 10 G/l (x = 6,6 G/l). Betrachtet man die arithmetischen Mittelwerte in allen fünf Gruppen, so ist festzustellen, dass die Leukozytenzahl sich im weiteren Verlauf der Infektion in den Gruppen 1 - 3 und 5 stetig weiter verringerte. Für Gruppe 4 trifft dies auf Tier 171 ebenfalls zu. Anders hingegen bei den Tieren 169 und 170. Auch hier sanken die Leukozytenwerte bis zum Tag 13 p.i. ab, stiegen danach wieder, z.T. bis in den physiologischen Bereich, an.

Abb. 14: Änderung der Gesamtleukozytenzahlen während einer CSFV-Belastungsinfektion in den einzelnen Tiergruppen²³.

In jeder Grafik sind die Gesamtleukozytenwerte (G/l, vgl. Tab. 10) einer Immunisierungsgruppe (drei Tiere, s. 3.1.3.8.) in G/l gegen die Tage nach der Virusinfektion (dpi) mit KSPV CSF 0634 (s.3.1.3.4.) aufgetragen. Zur Gewährleistung einer besseren Übersichtlichkeit, wurde bei 10 G/l eine Hilfsachse eingezogen.

Änderung der Gesamtleukozytenzahlen (S. typhimurium aroA SL7207 pCMVE2n)

0 10 20

0 10 20 30

dpi

G/l

160 161 162

23 Ein Abbrechen der einzelnen Kurven signalisiert, dass das jeweilige Tier zwischen dem Zeitpunkt der Ermittlung des letzten Messwertes und dem nächsten, geplanten Blu

Änderung der Gesamtleukozytenzahlen (SALMOPORC pCMVE2n)

0 10 20

0 10 20 30

dpi

G/l 163

164 165

Änderung der Gesamtleukozytenzahlen (SALMOPORC pSecTag2AE2n)

0 10 20

0 10 20 30

dpi

G/l 166

167 168

Änderung der Gesamtleukozytenzahlen (SALMOPORC pSecTag2AE2)

0 10 20

0 10 20 30

dpi

G/l

169 170 171

Änderung der Gesamtleukozytenzahlen (Virus-Kontrollgruppe)

0 10 20

0 10 20 30

dpi

G/l 172

173 174

4.4.8.5. Nachweis neutralisierender Antikörper

Bei akutem Verlauf der Klassischen Schweinepest können in letal verlaufenden Fällen 13-16 Tage p.i. (MENGELING, 1970) neutralisierende Antikörper mitunter zusammen mit infektiösem Virus im Serum auftreten.

Bis zum Tag 10 p.i. konnten keine neutralisierenden Antikörper nachgewiesen werden. An Tag 13 p.i. begann Tier 167 einen Antikörpertiter zu entwickeln. 17 Tage p.i. ließen sich bei allen bis zu diesem Zeitpunkt überlebenden Tieren neutralisierende Antikörper nachweisen. Die Ergebnisse ab diesem Tag sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst, die vollständigen Daten finden sich im Anhang unter 8.7.9., Tab. 17, eine grafische Darstellung findet sich in Abb. 15 auf den folgenden Seiten.

Tab. 7: Entwicklung der Antikörpertiter (Ak-Titer) ab Tag 17 p.i. (dargestellt als arithmetisches Gruppenmittel (x), bei n>1).

Die mit der Schätzformel nach Kärber (1931) (s. 3.2.10.2.) ermittelten Ak-Titer wurden mit Beginn der Entwicklung nachweisbarer neutralisierender Antikörper ab Tag 17 p.i. für die einzelnen Immunisierungsgruppen (s. 3.1.3.8.oder 4.4.8.2.f.) als arithmetische Mittelwerte hier dargestellt.

* Die erste Zahl gibt die Höhe des gemittelten Antikörpertiters an, die Zahl in Klammern die Anzahl der in der Gruppe zu diesem Zeitpunkt noch lebenden Tiere.

Abb. 15: Entwicklung der Antikörpertiter in den einzelnen Tiergruppen während des Belastungsversuches²⁴.

In jeder Grafik sind die Antikörpertiter (G/l) einer Immunisierungsgruppe (drei Tiere, s. 3.1.3.8.) gegen die Tage nach der Virusinfektion (dpi) mit KSPV CSF 0634 (s.3.1.3.4.) aufgetragen. Zur Gewährleistung einer besseren Übersichtlichkeit, wurde bei 30 und 60 G/l zwei Hilfsachsen eingezogen.

Entwicklung der Antikörpertiter (S. typhimurium aroA SL7207 pCMVE2n)

0

24 Ein Abbrechen der einzelnen Kurven signalisiert, dass das jeweilige Tier zwischen dem Zeitpunkt der Ermittlung des letzten Messwertes und dem nächsten, geplanten Blutentnahmezeitpunkt aufgrund seines moribunden Zustandes euthanasiert werden musste.

Entwicklung der Antikörpertiter (SALMOPORC pSecTag2AE2n)

0 30 60 90

0 10 20 30

dpi

Titer 166

167 168

Entwicklung der Antikörpertiter (SALMOPORC pSecTag2AE2)

0 200 400 600 800

0 10 20 30

dpi

Titer 169

170 171

Entwicklung der Antikörpertiter (Virus-Kontollgruppe)

0 30 60 90

0 10 20 30

dpi

Titer 172

173 174

4.4.8.6. Isolierung von infektiösem Virus aus peripheren Blutleukozyten

Es konnten in diesem Versuch keine Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Bei allen Tieren konnte ab Tag 6 p.i. Virus aus den peripheren Blutleukozyten isoliert werden.

4.4.8.7. Untersuchung der Veränderungen in der B- und T-Lymphozytenpopulationen während der Belastungsinfektion

Um die Veränderungen der B- und T-Lymphozyten näher zu erfassen, wurden wöchentlich PBMC isoliert. Die Proben wurden für die durchflußzytomertischen Analysen mit monoklonalen, Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern gegen porcine IgM (für B-Lymphozyten, CD4⁺ und CD8⁺ (T-Lymphozyten)) (s.

3.1.3.5., 3.2.11.2. ff. ) markiert. Die in der „density-blot-“ Darstellung ermittelten relativen Anteile der Subpopulation im peripheren Blut des einzelnen Tieres wurden dann unter Bezugnahme auf die Gesamtleukozytenzahl (G/l) in absolute Werte umgerechnet und die einzelnen Gruppen, unter Bezugnahme auf die absoluten Lymphozytenzahlen miteinander verglichen. Bei der Beurteilung der Zahlen gilt es allerdings zu berücksichtigen, dass bei der

Einzelmarkierung der CD8 -Zellen auch die „natürlichen Killerzellen“ (NK) mit erfasst werden. Zudem wurde ein gewisser Anteil an T-Lymphozyten aufgrund der schweinespezifischen CD4⁺CD8⁺-Zellen doppelt erfasst.

Im Anschluss an die Textdarstellung der Entwicklung einer jeden Population finden sich die entsprechenden grafischen Darstellungen. Die ermittelten Werte für alle Subpopulationen befinden sich zur Referenz im Anhang (s. 8.7.ff.).

Anders als bei der Darstellung der Fieberkurve (4.4.8.3., Abb 13) und der Gesamtleukozytenzahlen (s. 4.4.8.4., Abb. 14) mit klar definierten Grenzwerten, wurden bei der Darstellung der FACS-Analysen nur die Werte bis Tag 13 p.i.

berücksichtigt. Danach war die notwendige Vergleichbarkeit mit der Kontrollgruppe nicht mehr gegeben, denn zwei Tiere dieser Gruppe mussten vor dem Tag 17 p.i. euthanasiert werden.

Entwicklung der IgM-positiven Leukozytenpopulation unter der Belastungsinfektion (s. auch Abb. 16; 8.7.3., Tab. 11)

Wie in den folgenden Grafiken illustriert, kam es in allen Gruppen zu einem deutlichen Absinken der IgM-positiven Zellen, welches vor dem Auftreten von klinischen Symptomen messbar war.

Gruppe 1 (160 - 162)

Die IgM-positiven Zellen sanken von 2,17 G/l (160), 1,31,G/l (161), 1,83 G/l (162) in einen Bereich um 0,3 G/l (Tag 6 p.i.) ab. Die Abnahme dieser Subpopulation war bereits 3 Tage p.i. festzustellen. Bis Tag 13 p.i. kam es zu einer leichten Erholung der Subpopulation, das Ursprungsniveau wurde aber nicht erreicht.

Gruppe 2 (163 - 165)

Die Entwicklung der IgM-positiven Zellpopulation entsprach weitgehend derjenigen in Gruppe 1. Bei Tier 164 kam es zwischen Tag 10 und 13 p.i. zu einem Absinken der Zellzahlen.

Gruppe 3 (166 - 168)

Auffällig war das sehr starke Absinken der Werte (um etwa den Faktor 100) bei Tier 166, die sich dann aber wieder auf Werte im Bereich des Ursprungsniveaus erholten. Bei Tier 167 kam es zu einem, zwischen Tag 3 und 10 p.i. auffälligen, Absinken der Zellpopulation, bis Tag 13 p.i. erreichten die Werte das Ursprungsniveau.

Bei Tier 168 kam es zunächst zu einem Absinken der Zellzahlen, dann pendelten sich die Werte auf einem Niveau um 0,6 G/l ein.

Gruppe 4 (169 - 171)

In dieser Gruppe sanken die Zellzahlen zwischen Tag 0 und Tag 3 p.i. zunächst ab, um bei Tier 171 dann langsam auf ca. 0,55 G/l anzusteigen. Bei Tier 169 sanken die Werte auf ca. ein Drittel des Ursprungsniveaus ab, bei Tier 170 war an Tag 6 p.i. der Tiefpunkt der Werte erreicht, an Tag 10 p.i. konnten keine Werte ermittelt werden, an Tag 13 p.i. lag der Wert ebenfalls bei etwa ein Drittel des Ursprungswertes.

Gruppe 5 (Virus-Kontrollgruppe 172 - 174)

Bei den Tieren 172 und 173 kam es zu einer den Gruppen 1 und 2 vergleichbaren Abnahme der IgM-positiven Zellen. Bei Tier 174 kam es zunächst bis 3 dpi zu einem deutlichen Anstieg der IgM⁺-Subpopulation, ab 6 p.i. glich sich die Entwicklung der Zellzahlen der der beiden anderen Tiere an.

Die folgenden Abbildungen geben die Entwicklung in einer halblogarithmischen Darstellung wieder.

Abb. 16: Entwicklung der IgM-positiven Leukozytensubpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion²⁵.

In jeder Grafik sind die Werte der IgM-positivenSubpopulation (G/l, vgl. Tab. 11) einer Immunisierungsgruppe (drei Tiere, s. 3.1.3.8.) in einer halblogarithmischen Darstellung gegen die Tage nach der Virusinfektion (dpi) mit KSPV CSF 0634 (s.3.1.3.4.) aufgetragen. Zur Gewährleistung einer besseren Übersichtlichkeit wurden bei 1 und 0,1 G/l zusätzliche Hilfsachsen eingezogen.

Tag 13 p.i. ist im Rahmen dieser Darstellung der letzte Betrachtungszeitpunkt, da an den folgenden Betrachtungszeitpunkten einzelne Tiere aufgrund ihres moribunden Zustandes euthanasiert werden mussten (vgl. 8.7.1., Tab. 9) und die kleine Tierzahl keine Vergleichbarkeit mehr zuließ. Zur Methodik vgl. 3.2.11.2.

Entwicklung der IgM- positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion (S. typhimurium aroA SL7207 pCMVE2n)

0,01

Entwicklung der IgM-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

25 An Tagen mit fehlenden Werten lagen aufgrund von technischen Schwierigkeiten keine

Entwicklung der IgM-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pSecTag2AE2n)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 166

167 168

Entwicklung der IgM-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pSecTag2AE2)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 169

170 171

Entwicklung der IgM-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(Virus-Kontrollgruppe)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 172

173 174

Entwicklung der CD4⁺-Leukozytensubpopulation unter der Belastungsinfektion (s. auch Abb. 17 und 8.7.4, Tab.14)

Gruppe 1 (160 -162)

Die Zellzahlen sanken bis Tag 6 p.i. auf Werte zwischen 0,2 - 0,3 G/l ab. Von diesem Zeitpunkt an, kam es zu einem kontinuierlichen Anstieg auf Werte, die zwischen 20 % bis 50 % unterhalb des Ursprungsniveaus lagen.

Gruppe 2 (163 - 165)

An Tag 3 p.i. konnten von den Tieren keine Werte ermittelt werden, es kam aber zwischen Tag 0 p.i. und Tag 6 zu einem Absinken der Zellzahlen, gefolgt von einem Anstieg bis Tag 10. Bei Tier 164 sanken die Werte dann erneut, Tier 163 blieb etwa auf dem erreichten Niveau, während es bei Tier 165 zu einem Anstieg kam.

Gruppe 3 (166 - 168)

Auch in dieser Gruppe war, was die Entwicklung der CD4⁺-Subpopulation angeht, ein sehr heterogener Verlauf zu verzeichnen. Auffällig war bei Tier 166 das starke Absinken der Subpopulation um den Faktor 100 zwischen Tag 3 und 6 p.i. und ein ebenso starker Anstig auf Werte im Bereich des Ursprungsniveaus bis Tag 13 p.i.

Bei Tier 167 erfolgte ein leichter Anstieg bis Tag 3 p.i., dann kam es zu einem bogenförmigen Verlauf der halblogarithmischen Kurve mit Absinken der Zellzahlen, gefolgt von einer Erholung der Werte.

Bei Tier 168 kam es zunächst zu einem leichten Absinken der Werte, anschließend pendelten sie sich auf etwa 0,5 G/l ein.

Gruppe 4 (169 - 171)

Auch in dieser Gruppe kam es zunächst zu einer Verringerung der Werte, gefolgt von einer Erholung. Bei den Tieren 169 und 170 sind dabei höhere Werte als bei Tier 171 zu konstatieren. Ähnlich wie im Verlauf der Kontrollgruppe kam es bei diesem Tier an Tag 13 p.i. zu einem geringen Absinken der Zellzahlen.

Gruppe 5 (Virus-Kontrollgruppe 172 - 174)

Auch in der Kontrollgruppe waren sehr schwankende Zellzahlen zu verzeichnen. Bei den Tieren 172 und 173 kam es zunächst zu einer kontinuierlichen Reduktion der Zellpopulation, die bis etwa 6 Tage p.i.

andauerte. Danach stiegen die Werte bis Tag 10 p.i. etwa in den Bereich des Ursprungsniveaus an, um dann bis Tag 13 p.i. wieder etwas abzusinken.

Bei Tier 174 kam es bis 3 dpi zu einem Anstieg der Zellzahlen und schwankte dann zwischen Zu- und Abnahme der Leukozytensubpopulation.

Die folgenden Diagramme illustrieren die Verläufe nochmals.

Abb. 17: Entwicklung der CD4 Leukozytensubpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion²⁶.

In jeder Grafik sind die Werte der CD4⁺-Subpopulation (G/l, vgl. Tab. 13) einer Immunisierungsgruppe (drei Tiere, s. 3.1.3.8.) in einer halblogarithmischen Darstellung gegen die Tage nach der Virusinfektion (dpi) mit KSPV CSF 0634 (s.3.1.3.4.) aufgetragen. Zur Gewährleistung einer besseren Übersichtlichkeit wurden bei 1 und 0,1 G/l zusätzliche Hilfsachsen eingezogen.

Tag 13 p.i. ist im Rahmen dieser Darstellung der letzte Betrachtungszeitpunkt, da an den folgenden Betrachtungszeitpunkten einzelne Tiere aufgrund ihres moribunden Zustandes euthanasiert werden mussten (vgl. 8.7.1., Tab. 9) und die kleine Tierzahl keine Vergleichbarkeit mehr zuließ. Zur Methodik vgl. 3.2.11.2.

Entwicklung der CD4-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion (S. tyhimurium aroA SL 7207 pCMVE2n)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 160

161 162

26 An Tagen mit fehlenden Werten lagen aufgrund von technischen Schwierigkeiten keine

Entwicklung der CD4-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pCMVE2n)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 163

164 165

Entwicklung der CD4-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pSecTag2AE2n)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 166

167 168

Entwicklung der CD4positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pSecTag2AE2)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 169

170 171

Entwicklung CD4-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(Virus-Kontrollgruppe)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 172

173 174

Entwicklung der CD8 Leukozytensubpopulation unter der Belastungsinfektion (s. auch Abb. 18 und 8.7.4., Tab. 12)

Auch bei dieser Subpopulation war die Veränderungen bei den einzelnen Tieren sehr unterschiedlich. Generell kam es bis etwa Tag 6 p.i. zu einem Absinken der Zellzahlen, danach war entweder ein kurzfristiger peak der Werte, gefolgt von einer erneuter Abnahme, oder ein steter Anstieg zu ermitteln.

Gruppe 1 (160 - 162)

Hier kam es bis 6 Tage p.i. zu einem Absinken der Zellzahlen, gefolgt von einer kontinuierlichen Erholung der Werte, die allerdings deutlich unterhalb des Ursprungsniveaus blieben.

Gruppe 2 (163 - 165)

Bei Tier 163 war die Entwicklung der Leukozytensubpopulation etwa der von Tier 161 vergleichbar. Bei Tier 164 kam es an Tag 10 p.i. bei ansonsten ähnlichem Verlauf zu einem kurzfristiegen Anstieg. Tier 165 zeigte einen Abfall der Zellzahlen zwischen Tag 0 und 3 dpi um 50%, blieb aber im weiteren Verlauf etwa auf diesem Niveau.

Gruppe 3 (166 - 168)

Die CD8⁺-Werte von Tier 167 schienen an Tag 10 p.i. ihren Tiefpunkt erreicht zu haben und stiegen dann bis Tag 13 p.i. wieder leicht an.

Die Entwicklung bei Tier 166 war aufgrund zweier fehlender Werte nur schwer zu beurteilen. Es schien zwischen Tag 0 und Tag 10 p.i. zu einem Absinken der Werte zu kommen. Zwischen Tag 10 und 13 p.i. stiegen die Werte in einen Bereich, der vergleichbar mit denen der anderen Tiere dieser Gruppe war

Bei Tier 168 war die Entwicklung der CD8⁺-Subpopulation mit der von Tier 164 vergleichbar.

Gruppe 4 (169 - 171)

Auch in dieser Gruppe war der Verlauf sehr unterschiedlich. Es kam bei allen drei Tieren zu einem initialen Abfall der CD8⁺-Zellzahl, danach schwankten die Werte zwischen 0,16 G/l und 0,83 G/l.

Gruppe 5 (Virus-Kontrollgruppe 172 -174)

In der Virus-Kontrollgruppe war der Verlauf etwas einheitlicher. Bei zwei von drei Tieren sanken die Werte zwischen Tag 0 und 3 p.i. ab; sie erreichten bei allen Tieren an Tag 6 ihren Tiefpunkt, bis Tag 10 p.i. kam es zu einem Anstieg der Werte, die sich bis Tag 13 p.i. wieder auf Werte im Bereich des Ursprungsniveaus einpendelten.

Abb. 18: Entwicklung der CD8 -Leukozytensubpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion²⁷.

In jeder Grafik sind die Werte der CD8⁺-Subpopulation (G/l, vgl. Tab. 12) einer Immunisierungsgruppe (drei Tiere, s. 3.1.3.8.) in einer halblogarithmischen Darstellung gegen die Tage nach der Virusinfektion (dpi) mit KSPV CSF 0634 (s.3.1.3.4.) aufgetragen. Zur Gewährleistung einer besseren Übersichtlichkeit wurden bei 1 und 0,1 G/l zusätzliche Hilfsachsen eingezogen.

Tag 13 p.i. ist im Rahmen dieser Darstellung der letzte Betrachtungszeitpunkt, da an den folgenden Betrachtungszeitpunkten einzelne Tiere aufgrund ihres moribunden Zustandes euthanasiert werden mussten (vgl. 8.7.1., Tab. 9) und die kleine Tierzahl keine Vergleichbarkeit mehr zuließ. Zur Methodik vgl. 3.2.11.2.

Entwicklung CD8-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion (S. typhimurium aroA SL 7207 pCMVE2n)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 160

161 162

27 An Tagen mit fehlenden Werten lagen aufgrund von technischen Schwierigkeiten keine

Entwicklung der CD8-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pCMVE2n)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 163

164 165

Entwicklung der CD8-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pSecTag2AE2n)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 166

167 168

Entwicklung der CD8-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(SALMOPORC pSecTag2AE2)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 169

170 171

Entwicklung der CD8-positiven Subpopulation unter der CSFV-Belastungsinfektion

(Virus-Kontrollgruppe)

0,01 0,1 1 10

0 3 6 9 12 15

dpi

G/l 172

173 174

Entwicklung der Granulozyten und monozytoiden Zellen, sowie der Verhältnisses von CD4⁺/CD8⁺-Zellen unter der Belastungsinfektion.

Zusätzlich zu den schon beschreibenen Subpopulationen wurde auch die Entwicklung der Granulozyten und der monozytoiden Zellen während des Challenge-Versuches beurteilt. Es konnten dabei allerdings keine einheitlichen Trends im gruppenübergreifenden Vergleich ermittelt werden.

Während die Entwicklung der Granulozytensubpopulationen in der gruppeninternen Betrachtung noch relativ einheitlich ist, wichen die Werte der monozytoiden Subpopulation der einzelnen Tiere stark voneinander ab.

Darüber hinaus wurde das Verhältnis von CD4⁺ zu CD8⁺-Zellen ermittelt und grafisch dargestellt. Hiermit sollten mögliche Unterschiede, die aus den sehr unterschiedlichen Ausgangsniveaus der Zellzahlen resultierten, nivelliert werden.

Allgemein lag das Verhältnis zwischen 1 und 2; das CD4/CD8-Verhältnis schwankte während des gesamten Untersuchungszeitraumes ohne nennenswerte Abweichungen in den einzelnen Gruppen um diese Werte.

Die grafischen Darstellungen, wie auch die ermittelten Werte dieser Subpopulationen befinden sich im Anhang (s. 8.7.6. ff., Tab. 14 – 17,

Abb. 19 – 21)

5. Diskussion

5.1. Einleitung

Die Injektion von nackter DNA als Immunisierungsmethode ist seit Beginn der 90er Jahre bekannt. Seither wird diese Art der Immunisierung gegen verschiedene parasitäre, bakterielle und virale Erkrankungen erprobt. Der Einsatz von attenuierten bakteriellen Carriern, anstelle der direkten Injektion der DNA, stellt eine Erweiterung dieses Immunisierungsverfahrens dar. Im murinen System führt diese Adaptation zu zufriedenstellenden Impfergebnissen, für das porcine System, wie auch für die anderen Nutztiere, ist diese Übertragung plasmidkodierter Gene bisher nicht beschrieben.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Möglichkeit der DNA-Vakzinierung gegen die Klassische Schweinepest untersucht werden, die aufgrund der oralen Applizierbarkeit beim Wildschwein eingesetzt werden und so die Infektionskette unterbrechen könnte. Neben der Einsatzmöglichkeit bei der Eindämmung dieser verlustreichen Erkrankung, bietet sich hier auch die Möglichkeit, das Potential der DNA-Vakzinierung mit Einsatz bakterieller Carriersysteme in einem natürlichen Virus-Wirtssystem unter praxisrelevanten Bedingungen zu

In der vorliegenden Arbeit sollte die Möglichkeit der DNA-Vakzinierung gegen die Klassische Schweinepest untersucht werden, die aufgrund der oralen Applizierbarkeit beim Wildschwein eingesetzt werden und so die Infektionskette unterbrechen könnte. Neben der Einsatzmöglichkeit bei der Eindämmung dieser verlustreichen Erkrankung, bietet sich hier auch die Möglichkeit, das Potential der DNA-Vakzinierung mit Einsatz bakterieller Carriersysteme in einem natürlichen Virus-Wirtssystem unter praxisrelevanten Bedingungen zu

Im Dokument Entwicklung einer oral applizierbaren DNA-Vakzine gegen das Virus der Klassischen Schweinepest (Seite 119-150)