Methoden zum Nachweis der zellulären Immunantwort

3.2.11.1. Änderung der Leukozytenfraktionen im peripheren Blut während des Challenge Versuches

3.2.11.1.1. Durchflußzytometrie

Das Prinzip der Durchflußzytometrie beruht darauf, dass in Suspension befindliche Zellen über ein Probenführungssystem vereinzelt werden und einen Laserstrahl kreuzen. Dabei wird das Licht des eingesetzten Laserstrahls (mit unveränderlicher Wellenlänge) in Richtung des Strahls gestreut und entweder als sog. Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) in Richtung des Strahls oder im 90° Winkel dazu (Seitwärtsstreulicht, Side Scatter, SSC) registriert. Es schließt sich eine Weiterleitung als elektronisches Signal an einen angeschlossenen Computer an. Das Streuungsausmaß ist beim FSC abhängig von der Größe und dem Refraktionsindex des Partikels, beim SSC von seiner Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität).

Das hier verwendete FACScan® - Durchflußzytometer (Becton Dickinson) arbeitet mit einem Argonlaser, der Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Zusätzlich zu den Streulichtdetektoren registriert das Gerät Fluoreszenzlichtemissionen jedes Partikels in drei Wellenlängenbereichen. Der Detektor „FL1“ registriert Wellenlängen von 515- 545 nm (Grünfluoreszenz).

Orangefluoreszenz wird vom Detektor „FL2“ im Bereich 564-606 nm und Wellenlängen >650 nm im roten Spektralbereich werden vom Detektor „FL3“

gemessen. Es können damit pro erfasstem Partikel Werte für fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3) bestimmt werden. Jeder den Laserstrahl passierende Partikel liefert bei definierter Geräteeinstellung entsprechend seiner optischen Eigenschaften ein Datenmuster, das ihn als Messereignis definiert. Über die angeschlossene Computereinheit werden die

Geräteeinstellungen kontrolliert, Messergebnisse erfasst und gespeichert (ORMEROD 1990, RADBRUCH 1992).

Die computergestützte Auswertung der Daten erfolgte mit der Software

„WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999). Es erlaubt die Darstellung eines Parameters gegen die Zahl der gemessenen Ereignisse in Form eines Histogramms oder die Darstellung verschiedener Parameter gegeneinander.

Letztere kann u.a. als Konturdiagramm, Punktediagramm oder Dichtediagramm erfolgen. Die Lage der Messereignisse innerhalb der Darstellungen wird durch die Einstellungen des Durchflußzytometers bestimmt.

Es ist möglich, Untergruppen von Messereignissen einzeln zu analysieren, indem innerhalb von Zwei-Parameter-Diagrammen elektronische Fenster („gates“) gesetzt werden. Dabei können mehrere Fenster gleichzeitig gesetzt und logisch miteinander verknüpft werden. Auf diese Weise lassen sich auch die Anzahl bestimmter Messereignisse an der Gesamtereignismenge, sowie der mittlere Wert eines Parameters für eine Ereignisgruppe, ermitteln.

Morphologisch ähnliche Zellpopulationen stellen sich in einem korrelierten Diagramm, in dem für jede Zelle der FSC- gegen den SSC-Wert aufgetragen wird, als homogene Wolke dar. Lymphozyten können beispielsweise so von ruhenden Lymphozyten auf Grund ihres höheren FSC- (und auch SSC-) Wertes unterschieden werden.

Ein Beispiel für das sogenannte „gating“, sowie die prozentuale Verteilung der einzelnen Zellpopulationen ist in den folgenden Grafiken dargestellt.¹⁶

a) b)

c) d)

16 (a) Noch unbearbeitete Darstellung. Zu sehen sind die Fraktionen der Granulozyten (Gr), der Lymphozyten (L) sowie der monozytäre Zellen (M); (b) Die Anteile der einzelnen Zellpopulation werden durch die Einteilung in Quadranten ermittelt. (c) Es wurde eine Region definiert (in diesem Fall um die Lymphozyten; (d) das „gate“ wurde so gesetzt, dass nur die Lymphozytenfraktion gemessen wird. Hier lassen sich durch den Einsatz von RPE-gekoppeltem Antikörper deutlich zwischen Lymphozyten mit CD4-Rezeptor (R) und solchen ohne diesen Rezeptor (oR) differenzieren (die Darstellung der RPE-Fluoreszenz erfolgt über FL2). Analog erfolgt die durchflusszytometrische Erfassung der IgM-positiven Zellen, sowie der CD8⁺-Zellen (aufgrund der FITC-Markierung in FL1).

3.2.11.1.2. Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im peripheren Blut

Zur Ermittlung der Gesamtleukozytenzahl (G/l) wurde von Schweinen entnommenes EDTA-Blut verwendet und in Blutmischpipetten für Leukozyten bis zur vorgegebenen Marke aufgezogen. Dann wurde das gleiche Röhrchen mit 2%iger Essigsäure bis zum Gesamtvolumen aufgefüllt, so dass ein Mischungverhältnis von 1:10 entstand. Anschließend wurden die Pipettenenden mit Parafilm verschlossen und das Röhrchen etwa 1 min vorsichtig geschwenkt.

Dieser Schritt diente der Durchmischung und Hämolyse der Erythrozyten. Im nächsten Schritt wurden etwa 3 Tropfen aus der Pipette abgelassen, die Spitze vorsichtig abgetupft und eine Neugebauer-Zählkammer befüllt.

3.2.11.1.3. Bestimmung der Zellzahl

Die Auszählung der Zellen erfolgte in der Neugebauer-Zählkammer (8.5.3.). Der ermittelte Wert wurde mit dem entsprechenden Volumenkorrekturfaktor und dem Verdünnungsfaktor korrigiert.

3.2.11.1.4. Isolierung der PBMC für die durchflußzytometrische Messung Um diese Zellfraktion aus dem Blut zu isolieren, wurde von Schweinen entnommenes Natrium-EDTA-Blut in 50 ml Falcon-Tubes überführt und im Verhältnis 1:4 mit PBSM (s. 8.1.3.) versetzt. Das Blut wurde dann für 10 min bei 650 x g und 10°C ohne Einsatz der Bremsenfunktion der Zentrifuge zentrifugiert. Im nächsten Schritt wurde der Überstand vorsichtig derartig mit der Pipette abgenommen, dass der während der Zentrifugation entstandene sogenannte ‚buffy coat’, eine Schicht der weißen Blutkörperchen, im Röhrchen verblieb. Vor dem nächsten Schritt, der Lyse, wurde die Restflüssigkeit im Röhrchen kurz aufgeschüttelt. Es wurden 2 Teile A. bidest. zur Lyse der Erythrozyten hinzugefügt und das Röhrchen für ca. 20 sek. geschwenkt. Dann wurde das Falconröhrchen mit dem gleichen Volumen doppelt konzentriertem PBSM aufgefüllt und bei 400 x g und ansonsten unveränderten Zentrifugeneinstellungen zentrifugiert. Danach wurde der Überstand erneut

vorsichtig abgenommen, die Restflüssigkeit kurz aufgeschüttelt und eine zweite Lyse mit entsprechend gleichen Volumina durchgeführt. Die Zentrifugation erfolgte bei 200 x g und ansonsten unveränderten Einstellungen. Anschließend wurde der Überstand abgenommen, die PBMC einmal mit PBSM gewaschen, bei 100 x g zentrifugiert, in einem definierten Volumen PBSM aufgenommen und in einer Neugebauer-Zählkammer ausgezählt (s. 3.2.11.1.3.; 8.5.3.)

Von nun an erfolgten alle weiteren Arbeitsschritte auf Eis. Es wurden jeweils 3 x 10⁵ PBMC in Rundboden Mikrotiterplatten ausgesät. Die Platte wurde 5 min bei 179 x g und 4°C zentrifugiert, kurz ausgeschlagen und jeweils 30 µl des Mouse Anti Porcine CD8:FITC (1:400 mit PBSM verdünnt), Mouse Anti Porcine CD4:

RPE (1:30 verdünnt) oder Goat Anti Porcine IgM: FITC (1:800) ( s. 3.1.3.5.) zu den Zellen pipettiert. In die Kontrollvertiefungen wurde statt des Antikörpers Membranimmunofluoreszenz (MIF)-Puffer (s. 8.1.4.) gegeben. Die Platte wurde kurz geschüttelt und auf Eis eine Stunde im Kühlschrank inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen mit 100 µl MIF-Puffer gewaschen, die Platte mit 179 x g und 5 min, 4°C, zentrifugiert und der Überstand ausgeschlagen. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Zur Fixierung der Zellen wurde die Platte auf dem Mikrotiterplattenschüttler befestigt und jeweils 200 µl 4%iges Paraformaldehyd (8.1.4.) unter ständigem Schütteln in die Vertiefungen pipettiert. Die Platte wurde dann über Nacht in den Kühlschrank gestellt.

Am nächsten Morgen wurden die Zellen kurz aufgeschüttelt und 10 min bei 179 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden dann noch zweimal mit PBS (s. 8.1.3.) gewaschen und bei gleichen Bedingungen zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in 100 µl Sheath-Puffer (s. 8.1.3.) aufgenommen und in ein zuvor mit 100 µl Sheath-Puffer befülltes FACS-Röhrchen (s. 8.5.2.) überführt und gemessen.