3. Eigene Untersuchungen
3.2.4. Methoden zur Herstellung des E2-Konstruktes 1. Qiagen Methode
3.2.4. Methoden zur Herstellung des E2-Konstruktes 3.2.4.1. Qiagen Methode
Für die Isolierung der Plasmide wurde z.B. das Mini Prep Kit (s. 8.2.) der Firma Qiagen verwendet. Minipräparationen von Plasmid-DNA wurden immer dann durchgeführt, wenn nur geringe Mengen an DNA (<20 µg) benötigt wurden. Dies war zum Beispiel beim Screening auf positive Klone oder zum späteren Einsatz in der PCR der Fall.
Prinzip:
Die Plasmid-DNA bindet mit ihren Phosphatgruppen an die positiv geladenen DEAE-Gruppen auf der Oberfläche der Silica Anionen-Austauscher-Membran.
Diese Bindung ist auch in Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen sehr stabil, so dass es möglich ist, Verunreinigungen wie RNA, Proteine oder Kohlenhydrate zu eluieren und zu verwerfen, um schließlich mit einem Puffer, der eine hohe Salzkonzentration hat, die DNA zu gewinnen. Die DNA wird dann aufkonzentriert und der mittels Isopropanol-Präzipitation salzfrei isoliert.
Durchführung:
Gemäß Herstellerprotokoll wurden 10 ml Bakterien über Nacht angezüchtet und bei 6000 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 250 µl Puffer P1 aufgenommen. Anschließend wurden 250 µl
Puffer P2 hinzugegeben und geschwenkt. Nach Zugabe von 350 µl Neutralisationspuffer und Schwenken, wurde 10 min bei 16060 x g zentrifugiert und der Überstand auf eine mitgelieferte Säule gegeben. Es wurde erneut für eine Minute zentrifugiert, dann 750 µl Puffer P4 hinzugefügt, 60 sek bei 16060 x g zentrifugiert, der Durchlauf verworfen und die Säule ein weiteres Mal zentrifugiert. Die Säule wurde dann in ein neues Eppendorfreaktionsgefäß gesetzt und die Plasmid-DNA mit 30 µl sterilem A. bidest. mittels einminütiger Zentrifugation eluiert.
Der DNA-Gehalt wurde anschließend im Spektrophotometer ermittelt. Dazu wurden 5 µl der resuspendierten DNA mit 245 µl A. bidest. versetzt, gevortextet und gegen A. bidest. bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Bei dieser Wellenlänge entspricht ein Absorptionswert von 1.0 einer Konzentration von 50 µl / ml doppelsträngiger DNA.
DNA Konzentration (µg / ml) = Ext. 260 nm x 50 x Verdünnung
Anhand der UV Absorption kann auch die Reinheit von DNA-Präparationen überprüft werden. Bei einer gut gereinigten DNA-Probe liegt das Verhältnis der Absorptions gemessen bei 260 nm und 280 nm bei 1,7 oder höher.
3.2.4.2. HiSpeed Plasmid Midi Kit®
Prinzip:
Abhängig von dem in den Bakterien verwendeten Plasmid war es möglich, mit Hilfe dieser Methode DNA-Mengen von bis zu 200 µg zu isolieren. Die Plasmidisolierung mit dem HiSpeed Plasmid Midi Kit® (s. 8.2.) beruht wie beim Mini Prep Kit auf der alkalischen Lysis der Bakterienzellen. Die Präparation wurde gemäß Herstellerprotokoll folgendermaßen durchgeführt:
Etwa 50 ml Bakterienübernachtkultur wurden bei 6000 x g für 15 min bei 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 6 ml P1 Puffer aufgenommen, vollständig darin gelöst und kurz auf dem Vortex-Gerät gemischt. Als nächster Schritt wurden 6 ml Puffer P2 dazugegeben, 4-6 mal
geschwenkt und 5 min bei Raumtemperatur belassen. In der Zwischenzeit wurde der QIAFilter Midi Cartridge vorbereitet, die untere Öffnung mit einer Kappe verschlossen und in ein steriles Gefäß gestellt. Die Zugabe von 6 ml P3 Puffer und sofortiges Schwenken führt zur Ausbildung eines weißlichen Schleiers in der Lösung. Das Lysat wurde nun in die QIAFilter Midi Cartridge überführt und 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und zwischenzeitlich die HiSpeed Midi Tip Säule mit 4 ml QBT Puffer equilibriert.
Anschließend wurde die untere Verschlusskappe der Cartridge entfernt, der dazugehörige Spritzeneinsatz eingeführt und das Zelllysat in den vorbereiteten HiSpeed Midi Tip filtriert. Das klare Zelllysat wurde in einem sterilen Gefäß aufgefangen, und der HiSpeed Midi Tip mit 20 ml QC Puffer gewaschen. Die DNA wurde anschließend mit 5 ml QF Puffer eluiert. Zur Fällung der DNA wurden 3,5 ml Isopropanol hinzugefügt, kurz auf dem Vortexgerät geschüttelt und 5 min das DNA-Eluat für 5 min mit dem Isopropanol inkubiert. Während dieser Zeit wurde der QIAprecipitator am Spritzenkolben (‚cartridge’) angebracht und der Spritzenstempel entfernt. Der Eluat-Isopropanol-Mix wurde in die Spritze überführt und nach erneutem Aufsetzen des Spritzenstempels durch den QIAprecipitator filtriert. Dies wurde noch einmal leer wiederholt, d.h.
Luft durch den QIAprecipitator gepresst, um mögliche Reste der nicht gebundenen Flüssigkeit im Filter zu entfernen. Nun wurde der dieser auf eine neue, mit 1 ml mitgeliefertem TE-Puffer gefüllte, Spritze aufgesetzt und die DNA in ein 2,0 ml Eppendorfgefäß eluiert. Das gesamte Eluat wurde dann nochmals filtriert und der DNA-Gehalt photometrisch bestimmt (3.2.4.1.)
3.2.4.3. Agarosegelelektrophorese
Es wurden 0,8 bis 1%ige Agarose Gele (Größe ca. 6,5 x 10 cm, Dicke ca. 0,7 cm) in Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer verwendet, auf die die 5-8 µl der PCR-Produkte oder Plasmid-DNA vermischt mit 3 µl Ladepuffer aufgetragen wurden (horizontale Agarosegelelktrophorese). Zusätzlich wurde ein DNA Längenstandard als Größenmaßstab aufgetragen. Die Auftrennung der DNA
erfolgte durch Anlegen einer Spannung von 120 V für 90 min. Anschließend wurden die Gele für mindestens 10 min in einem 0,2% Ethidiumbromidbad gefärbt und mind. 20 min gewässert. Die Banden wurden mit Hilfe eines UV-Transluminators sichtbar gemacht.
3.2.4.4. Gewinnung der Virus-cDNA zur E2-Amplifikation mittels PCR 3.2.4.4.1. Isolierung der Virus-RNA mit dem RNeasy Mini Kit® (Qiagen) Prinzip:
Das Kit findet Anwendung bei der Isolierung der Gesamt-RNA aus Zellkulturen, die mit Virus infiziert wurden. Es kommt bei dieser Methode u.a. zur pH-abhängigen Bindung von RNA an eine Membran aus Silica-Gel. Es ist möglich bei einem pH-Wert von ≤ 7.5 bis zu 10 µg RNA an die Membran der Säule zu binden.
Durchführung:
Die Referenzzelllinie PK (15) A (s.3.1.3.1.) wurde mit einer Zelldichte von 1,7 x 106/20 ml Kulturmedium in 250 ml Gewebekulturflaschen ausgesät. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37°C ohne CO2 wurde das Medium entfernt und der Zellrasen mit 1 ml der Virussuspension (CSF 0942 bzw. 0170, s. 3.1.3.4.) inokuliert. Nach einer Stunde wurde die Kulturflasche mit frischem Medium aufgefüllt und die Zellkultur erneut im Brutschrank inkubiert. Nach 72 h wurden zunächst das Medium abgenommen und 500 µl eines speziellen Lysispuffers des Kits, dem RLT Puffer, dem gemäß Herstellertestprotokoll 5 µl Mercaptoethanol zugesetzt wurden, beigefügt. Die Proben wurden nun portioniert und sofort bei – 80° eingefroren, wodurch sie einige Monate haltbar sind. Zur weiteren Bearbeitung wurden sie im Eisbad aufgetaut und die Proben mit Hilfe einer Spritze und einer Kanüle durch ca. zehnmaliges Auf- und Abziehen homogenisiert. Es wurden 500 µl 70% Ethanol hinzugefügt und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Nach dem Überführen der Proben auf die RNeasy-Säule erfolgte eine einminütige Zentrifugation bei 16060 x g (Biofuge
Pico), der Durchlauf wurde verworfen. Im nächsten Schritt wurden zunächst 700 µl Puffer RW1 auf die RNeasy Säule gegeben, eine Minute bei 16060 x g zentrifugiert, der Durchlauf verworfen und die Säule auf einen neuen Auffangbehälter gesetzt.
Dann wurde die Säule zweimalig mit 500 µl RPE-Puffer gewaschen. Zwischen dem ersten und zweiten Waschschritt wurde eine Minute bei 16060 x g zentrifugiert, nach dem zweiten Waschen für 2 Minuten bei gleicher Geschwindigkeit. Nun wurde die Säule auf ein 1,5 ml fassendes Eppendorfgefäß gesetzt und 30 µl RNase-freies Wasser auf die Membran der Säule gegeben und eine Minute bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Elution erfolgte durch Zentrifugation (1 min; 16060 x g). Die eluierte RNA wurde anschließend sofort ins Eisbad gestellt und schließlich bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
3.2.4.4.2. Herstellung von cDNA aus Virus RNA
Die bei -80°C gelagerte RNA wurde in einem Eisbad aufgetaut und je 6 µl in ein PCR-Mikroreaktionsgefäß vorgelegt. Der Probe wurde dann ein Mastermix bestehend aus 8 µl 5xRT-Puffer, 8 µl dNTPs und 10 µl DEPC Wasser zugesetzt und sorgfältig mit der Pipette gemischt. Der Thermocycler war zuvor bereits auf 70°C aufgeheizt worden. Die sog. „hot-start“ - Technik verringert die unspezifische Bindung von Primern und erhöht Spezifität, Sensitivität sowie die Menge des gebildeten Amplifikats.
Die Probe wurde nun für 5 min zu 70°C in den Thermocycler gestellt. Dieser Reaktionsschritt diente der Denaturierung der RNA.
In der Zwischenzeit wurde ein zweiter Mastermix bestehend aus 3,5 µl 0,1M DTT, 2,0 µl 1:15 verdünnter Hexamere, 0,5 µl eines RNAse-Inhibitors sowie 2,0 µl Reverse Transkriptase (s. 8.3.) erstellt. Dieser wurde der Probe im nächsten Arbeitsschritt zugesetzt, gut gemischt und in den Thermocycler zurückgestellt.
Das (Gesamt-) Programm war folgendermaßen gestaltet:
70°C ∞
70°C 5 min (1. Mastermix)
4°C ∞ (Zugabe des 2. Mastermix) 22°C 5 min
37°C 15 min 42°C 30 min 99°C 5 min
4°C ∞
3.2.4.5. Herstellung der DNA-Fragmente und Klonierung 3.2.4.5.1. Amplifikation des E2-Proteins mittels PCR
Die cDNA wurde nach der Entnahme aus dem Thermocycler, ohne weitere Aufarbeitung, bei –20°C gelagert und bei der weiteren Verwendung auf Eis aufgetaut. Da die Sequenz des E2-Gens des CSF Stammes 0170 (s. 3.1.3.4.) nicht bekannt war, wurde die Sequenz des CSF-Stammes 0942 (Brescia) (s.
3.1.3.4.) zur Erstellung der Primer herangezogen. Mit Hilfe der cDNA dieses Virusstammes sollte die PCR optimiert werden und die Ergebnisse dann zur Amplifikation des E2 Gens von CSF 0170 herangezogen werden.
Der Mastermix wurde wie folgt gestaltet:
Tab. 3: Übersicht über die Zusammensetzung des verwendeten Mastermixes
Die aufgeführten Reagenzien wurden auf Eis nacheinander in ein 0,5 ml fassendes Eppendorfgefäß (für die PCR) pipettiert und anschließend in den Thermocycler gestellt. Die Zusammensetzung und Konzentrationen der einzelnen Bestandteile des Mastermixes sind unter 8.3. zu finden. Die Bezeichnung Tth bezieht sich auf das thermophile Eubacterium Thermus thermophilus spec., aus welchem die DNA-Polymerase stammt.
Die Primer wurden wie folgt gestaltet:
pst +9: 5’-ATA AGA ATG CGG CCG CCC ACC ATG GTA TTA AGA GGA CAG GTC GTG-3’
pwt -10: 5’ -ATA AGA ATG CGG CCG CCC TTA ATC AAA CCA GTA CTG ATA CTC GCC-3`
7 Zusammensetzung und Konzentration s. 8.3.
8 Konzentration s. 8.3.
9 Der unterstrichene Bezirk kennzeichnet die Schnittstelle für das Enzym, die fettgedruckten Buchstaben die Genssequenz für E2 (CSF 0942; Basen 2365-2386) (Moormann et al. 1990b).
Das Kürzel pst+ kennzeichnet den ‚forward-primer’.
10 Der unterstrichene Bezirk kennzeichnet die Schnittstelle für das Enzym, die fettgedruckten Buchstaben die Genssequenz für E2 (CSF 0942; Basen 3388-3411) (Moormann et al.
1990b).Das Kürzel pwt- bezeichnet den ‚reverse-primer’.
Es wurden 10 µl der cDNA vorgelegt und mit dem Mastermix (s. Tab. 3) sorgfältig gemischt.
Anschließend wurden die 0,5 ml Mikroreaktionsgefäße in den Thermocycler gestellt und dieser folgendermaßen programmiert:
95°C 2 min 95°C 120 sek
69°C 1.15 min 35 x 72°C 1 min
72°C 5 min
4°C ∞
3.2.4.5.2. Spaltung mit Restriktionsendonukleasen
Der Vektor pCMV (3.1.3.3.) wurde mit dem Enzym Not I (Fa Biolabs, Frankfurt;
s. 8.4.) aufgespalten. Zu diesem Zweck wurden 5 µg Vektor DNA zu 1 µl Enzym (10U) gegeben. Das 10-fach konzentrierte Enzym war zuvor mit dem mitgelieferten Puffer verdünnt worden. Das Gesamtvolumen des Verdaus betrug 50 µl. Die Spaltung erfolgte 1 Stunde bei 37°C.
3.2.4.5.3. Aufreinigung der DNA nach dem Restriktionsverdau mit QIAquick Nucleotide Removal Kit®
Prinzip:
Das QIAquick Nucleotide Removal Kit® dient der Entfernung von Oligonukleotiden und Verunreinigungen, die bei enzymatischen Reaktionen entstehen.
Die DNA wird dabei zunächst an eine Silikat-Gel-Membran gebunden, gewaschen und später mit Tris Puffer eluiert. Die Reaktionsschritte wurden gemäß Gebrauchsanweisung wie folgt durchgeführt:
Zunächst wurden zu jeweils einer Mengeneinheit DNA-Eluat 10 Volumeneinheiten Puffer PN hinzugefügt und eine im Testkit enthaltene Säule in ein ebenfalls beigefügtes Auffanggefäß mit dem Fassungsvermögen von ca.
2 ml gesetzt. Um die DNA an die Säule zu binden, wurde das DNA Eluat auf die Säule gegeben und für 1 min bei 5000 x g (Biofuge pico) zentrifugiert.
Anschließend wurde der Durchfluß verworfen, die Säule mit 750 µl PE-Puffer gewaschen und erneut bei gleicher Einstellung zentrifugiert. Nachdem der Durchfluß verworfen war, wurde die Säule noch mal für eine Minute mit ihrem Gefäß zentrifugiert (16060 x g). Dann wurde die Säule auf ein frisches Auffanggefäß gesetzt und zur Elution der DNA 100 µl EB-Puffer (Tris-Cl 10 mM) hinzugefügt. Nach erneuter Zentrifugation (16060 x g) konnte die DNA bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert werden.
3.2.4.5.4. Spaltung des E2-Amplifikates
Das E2- Amplifikat wurde mit dem Enzym Not I geschnitten. Zu diesem Zweck wurden 5 µg E2-DNA zu 1 µl Enzym (10U) gegeben. Das 10-fach konzentrierte Enzym war zuvor mit dem mitgelieferten Puffer verdünnt worden. Das Gesamtvolumen des Verdaus betrug 50 µl.
Die Spaltung erfolgte 1 h bei 37°C.
Die anschließende Aufreinigung des Verdaus erfolgte mit dem QIAquick Nucleotide Removal Kit gemäß 3.2.5.2.
3.2.4.5.5. Ligation von pCMV mit dem E2-Amplifikat
Die Ligation wurde mit der T4-Ligase (s. 8.4.) durchgeführt. Diese katalysiert die Bildung von Phosphordiesterbindungen zwischen 3’-OH- und 5’-Phosphatresten. Zur Durchführung der Ligation wurde der gespaltene Vektor zum zu klonierenden Fragment (im Verhältnis 10:1 - 4µl E2 Fragment (0,055 µg/µl) zu 2 µl pCMV (1 µg/µl) gegeben, und das Volumen auf 15 µl mit A.
bidest. ergänzt. Nach Zugabe von 4 µl 5 x T4-Ligase-Puffer und 1 µl T4-Ligase (1 U/µl) wurde der Ansatz für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden die Salmonellen mit dem Konstrukt transformiert (s. 3.2.6.
und 4.1.1.) und auf Agarplatten ausgestrichen (3.2.6.).
3.2.4.5.6. Auswahl der positiven Klone
Es wurden einige der auf den Agarplatten gewachsenen Kolonien ausgewählt und mit einer sterilen Pipettenspitze etwas Koloniematerial in LB-Medium gegeben. Das beimpfte Medium wurde dann über Nacht zur Anzucht in den Schüttelinkubator gestellt (37°C, 50rpm). Am nächsten Morgen wurde die DNA mittels Qiagen Mini Preps (s. 3.2.4.1.) isoliert und anschließend sequenziert (s 3.2.5.). Bis zur Vorlage des Sequenzierergebnisses wurden von den Flüssigkulturen Bakterienstocks angelegt (s.3.2.3.1.).
3.2.5. Sequenzierung