3. Eigene Untersuchungen
3.2.10. Methoden beim Umgang mit den Viren 1. Virusvermehrung und -ernte
Die Virusisolate CSF 0170, 0905 und 0942 (3.1.3.3.) wurden zum einen vermehrt, um das jeweilige E2-Gen zu amplifizieren, zum anderen wurden sie als homologe Viren bei der Serumuntersuchung im Virusneutralisationstest benötigt. Um einen Vorrat der entsprechenden Virusstämme zu gewinnen, wurde die Referenzzelllinie PK (15) A (3.1.3.1.) mit einer Zelldichte von 1,7 x
106/20 ml Kulturmedium in 250 ml Gewebekulturflaschen ausgesät. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37°C ohne CO2 wurde das Medium entfernt und der Zellrasen mit 1 ml der Virussuspension inokuliert. Nach einer Stunde wurde die Kulturflasche mit frischem Medium aufgefüllt und die Zellkultur erneut im Brutschrank inkubiert. Nach 72 Stunden wurde die Flasche bei -80°C tiefgefroren, um das zellgebundene Virus durch Zerstörung der Zellmembran freizusetzen. Zur Virusernte wurde das Zell-Virus-Gemisch zügig im 37°C warmen Wasserbad aufgetaut und, bevor eine Erwärmung auftreten konnte, bei 4°C für 10 min bei 778 x g zentrifugiert, um den virushaltigen Zellkulturüberstand von den Zellbestandteilen zu separieren. Der Überstand wurde in Portionen à 1 ml bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
3.2.10.2. Virustitration
Zur Titerbestimmung einer Virussuspension wurde eine End-Punkt-Verdünnungsmethode durchgeführt. Die zu titrierende Virussuspension wurde in EDulb Medium in log10-Stufen von 10-1- 10-8 verdünnt. Jeweils vier Kavitäten einer Mikrotiterplatte wurden mit jeweils 100 µl der jeweiligen Verdünnungsstufe beschickt. Anschließend wurde zusätzlich jede dieser Kavitäten mit 50 µl einer auf 354.000 pK15-Zellen/ml EDulb-Medium (unter Zusatz von 5% FKS) eingestellten Zellsuspension befüllt. Die Kultur wurde 72 h in einer feuchten Kammer bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Das Virusantigen wurde schließlich mit der direkten bzw. indirekten Immunfärbung nachgewiesen (s. 3.2.10.4.) Die Ermittlung des KSPV-Titers (50% kulturinfektiöse Dosis, KID50) erfolgte nach der Formel von KÄRBER (1931) in KID50/ml.
log VD50 = L1,0 – Lint (S- 0,5)
VD50 Verdünungsstufe, bei der 50% der Probanden infiziert sind
L1,0 Logarithmus der höchsten Verdünnungsstufe mit der Reaktionsrate 1,0, d.h. derjenigen Verdünnungsstufe, bei der alle Probanden noch infiziert sind
Lint Logarithmus des Verdünnungsintervals
S Summe der Reaktionsraten, d.h. die Summe aus der letzten
Reaktionsrate, bei der alle Probanden noch infiziert sind (= 1) + die Reaktionsrate, bei der nicht mehr alle Probanden infiziert sind. Bei z.B.
einem infizierten Probanden (aus einer Gesamtzahl von 4) 0,25.
0,5 Konstante
3.2.10.3. Virusisolierung
Die Virusisolierung ist der ‚Goldstandard’ zum labordiagnostischen Virusnachweis der Klassischen Schweinepest. Zum Virusnachweis am lebenden Tier eignen sich Leukozyten, die aus Blutproben mit Zusatz von Gerinnungshemmern, wie z.B. EDTA, isoliert werden. Durch den Zusatz von EDTA-Dextran-Lösung zu der Blutprobe lassen sich rote und weiße Blutbestandteile voneinander trennen. Während die Erythrozyten sedimentieren, verbinden sich die Leukozyten mit dem Dextran und verbleiben im Überstand. Durch die Inokulation der Leukozyten auf PK (15) A-Zellen erfolgt eine Amplifikation des Virus über zwei Passagen (Zellkulturröhrchen und Makrotiterplatte). Mit der sich anschließenden Immunperoxidasefärbung lässt sich das Virus in der Zellkultur nachweisen und das Tier als KSP-Virus positiv erkennen.
Nach der Blutentnahme von etwa 10 ml EDTA-Blut wurde den Probenröhrchen 0,5 ml Dextran-Lösung zugesetzt und vorsichtig geschwenkt. Die Proben wurden 1-3 h bei Raumtemperatur stehen gelassen, solange, bis sich die obere weiße Phase gut abgesetzt hatte. Der weiße Überstand wurde abgenommen und 10 min bei 437 x g (1500 U/min) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation waren die Leukozyten als weißes Pellet zu erkennen. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet in 3-5 ml PBSM resuspendiert. Dies wurde erneut bei 437 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Waschvorgang wurde noch einmal wiederholt und das Leukozytenpellet danach in 2 ml PBSM
aufgenommen und entweder frisch verimpft oder bei –20°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
Zur Virusisolierung wurden Zellkulturen in Gewebekulturröhrchen vorbereitet.
150.000 PK (15) A-Zellen wurden in 1 ml Kulturmedium in Kulturröhrchen verbracht und stationär im Schrägständer bei 37°C bebrütet. Nach 1 bis 2 Tagen war der Zellrasen dicht geschlossen und konnte infiziert werden. Dazu wurde das Medium abgenommen, die Kultur mit 200 µl Leukozytensuspension inokuliert und 1-2 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde jedes Kulturröhrchen ein- bis zweimal mit jeweils 1,5 ml PBSM gewaschen, mit 1 ml EMEM-Kulturmedium mit Antibiotikazusatz und 10% FKS aufgefüllt und 3-4 Tage im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Kulturröhrchen für mindestens 1 h bei –80°C eingefroren und der Kulturüberstand nach dem Auftauen auf die Makroplatte, auf der am Vortag 200.000 PK (15) A-Zellen ausgesät wurden, inokuliert. Als positive Kontrolle wurden zwei Zellkulturröhrchen mit dem KSP-Virusstamm Alfort 0187 (3.1.3.4) infiziert. Zur Inokulation wurden die aufgetauten Kulturröhrchen bei 778 x g (2000 U/min) zentrifugiert. Von diesem Überstand wurden 200 µl in die Vertiefung der Makrotiterplatte gegeben und diese 1-2 Stunden bei 37°C und 4%
CO2-Konzentration im Brutschrank inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann mit 1 ml EMEM-Kulturmedium und 5% FKS beschickt und für 3 Tage bei 37°C mit 4% CO2 -Konzentration im Brutschrank inkubiert. Der Virusnachweis erfolgte dann mittels direkter Immunperoxidasefärbung (s. 3.2.10.4.)
3.2.10.4. Virusantigennachweis mittels direkter und indirekter Immunperoxidase-Färbung
Zum Nachweis des KSPV in PK (15) A-Zellen wurde der Zellkulturüberstand mit Hilfe einer Vakuumpumpe aus den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte entfernt.
Anschließend wurden die Vertiefungen zur Schonung der Zellen einmal mit 1/3 PBS gewaschen. Durch das Absaugen des Überstandes mit der Pumpe wurde eine minimale Feuchtigkeit der Zellen erreicht. Dies verhinderte eine
Schädigung der Zellen beim nachfolgenden Trocknungsvorgang von mindestens 3 Stunden bei 80°C. Nachdem der Zellrasen nach dem Fixieren erneut auf Zimmertemperatur herabgekühlt war, wurde die Platte einmal mit PBS-Tween befeuchtet. Dies gewährleistete eine bessere Verteilung des Konjugats. Der im Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule hergestellte mit Peroxidase gekoppelte Antikörper C16 (gerichtet gegen das NS2-3 Protein)(MOENNIG et al. 1987), wurde 1:500 mit PBS Tween 0,1%
(8.1.3.) verdünnt. Je 50 µl des gebrauchsfertigen Konjugats wurden pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte eingesetzt und die derartig befüllte Platte für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Im Anschluß wurde die Platte zunächst dreimal mit PBS Tween 0,1% und schließlich einmal mit vollentmineralisiertem (VE;
Wasseraufbereitungsanlage der Tierärztlichen Hochschule) Wasser gewaschen und so das ungebundene Konjugat entfernt. Durch Beschicken der Kavitäten mit 50 µl einer frisch angesetzten 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC)-Gebrauchslösung (8.1.4.) kommt es zu einer Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und der Peroxidase. Diese Umsetzung durch die Peroxidase wird als roter Farbumschlag im Bereich des Zytoplasmas der fixierten Zellen sichtbar. Die Färbung wurde mikroskopisch kontrolliert und nach etwa 20 min durch einmaliges Waschen mit Aqua bidest. beendet. Eine Kavität wurde dann als KSPV-positiv gewertet, wenn das Zytoplasma mindestens einer Zelle rot gefärbt war, wobei der Zellkern ungefärbt blieb.
Abhängig von der Verfügbarkeit des monoklonalen peroxidasegekoppelten Antiköpers wurde zum Teil auch auf die indirekte Immunperoxidase-Färbung zurückgegriffen. Die Platten wurden nach der Inkubationszeit ebenfalls mit 1/3 PBS gewaschen und für 3 Stunden bei 80°C fixiert.
Sobald die Platten auf Raumtemperatur abgekühlt waren, wurden sie einmal mit PBS Tween 0,1% gewaschen. Anschließend wurden in jede Vertiefung 50 µl des 1:100 verdünnten KSP-spezifischen HC 34-Antikörpers (3.1.3.5.) gegeben und die Platte 90 min im Brutschrank bei 37°C ohne CO2 inkubiert. Die Platte wurde dann 3 mal mit PBS Tween 0,1% gewaschen, bevor die Vertiefungen
mit dem 1:200 verdünnten 1. Konjugat (Sheep anti mouse IgG biotinylated, Fa.
Amersham; s. 3.1.3.5.) beschickt und erneut für eine Stunde bebrütet wurden.
Nach weiteren drei Waschschritten mit PBS-Tween 0,1% wurden die Kavitäten mit dem, ebenfalls mit PBS-Tween 0,1%, 1:200 verdünnten 2. Konjugat (Streptavidin conjugated horseradish peroxidase; s. 3.1.3.5.) beschickt. Es schloß sich eine weitere 60-minütige Inkubation, gefolgt von einem von dreimaligem Waschen mit PBS-Tween 0,1% an. Das weitere Vorgehen entsprach dem der direkten Peroxidase-Färbung.
3.2.10.5. Neutralisationstest
Der Neutralisationstest (NPLA, Neutralization Peroxidase-Linked Assay) wird in der Untersuchung von Serumproben sowohl zum qualitativen als auch quantitativen Nachweis von neutralisierenden Antikörpern gegen das KSPV eingesetzt.
Grundlage des Tests ist die Zugabe einer definierten Virusmenge zu der zu untersuchenden Serumprobe. Enthält diese Antikörper, und sind diese in der Lage, das zugegebene Virus zu neutralisieren, so sind die Zellen vor dem Eindringen des Virus geschützt und ein entsprechender Nachweis ist negativ.
Der Antikörpertiter der Serumprobe lässt sich dann mittels einer Verdünnungsreihe ermitteln.
Auf einer Mikrotiterplatte wurde eine Serumverdünnungsreihe (im Doppelansatz) in 2-er-Stufen von 1:5 bis 1:640 hergestellt.
Dazu wurden in der ersten Reihe 80 µl EDulb Kulturmedium (supplementiert mit 5% FKS) mit 20 µl des jeweiligen Serums gemischt. In die anderen Vertiefungen der Platte wurden 50 µl des Mediums vorgelegt. Aus der ersten Verdünnungsstufe (1:5) wurden 50 µl abgenommen und in die nächste Reihe gegeben, durchgemischt und die Verdünnungsreihe dergestalt bis zu 1:640 fortgesetzt. Mit dem Kulturmedium wurde eine CSF 0170-Virussuspension (s.
3.1.3.4.) auf 2000 KID50/ml (s. 3.2.10.2.) eingestellt. Je 50 µl dieser
Suspension wurden jeder Kavität der Testplatte hinzugefügt und für eine Stunde in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert.
Zum Zweck der Überprüfung der eingesetzten Virusmenge wurde eine sogenannte Rücktitration des Testvirus durchgeführt. In Kahnröhrchen (kleine Reagenzgläser mit Aluminiumdeckel) wurde eine 10er Verdünnungsreihe des Testvirus bis zur Stufe 10-4 titriert. Die im Neutralisationstest eingesetzte Virussuspension war hierbei die Verdünnungsstufe 100. Jeweils 4 Kavitäten einer Mikrotiterplatte (s. 8.5.2.) wurden mit jeweils 100 µl einer Verdünnungsstufe beschickt.
Nach einer Stunde wurde jede Kavität zusätzlich mit 50 µl einer PK (15) A-Zellsuspension (s. 3.1.3.1.) mit einem Zellgehalt von ca. 1x106 /50µl beschickt. Außerdem wurden 4 Kavitäten als Zellkontrolle mit je 100 µl Kulturmedium und ebenfalls 50 µl der Zellsuspension befüllt.
Die Mikrotiterplatte wurde weitere 72 Stunden bei 37°C und 4% CO2 Zusatz in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach 3 Tagen wurde mittels einer Vakuumpumpe die Flüssigkeit entfernt, einmal mit 1/3 PBS (s.8.1.3.)(zur Schonung der Zellen) gewaschen und mit der Pumpe die Platten erneut sorgfältig von Flüssigkeitsresten befreit.
Die Platten wurden nun für 3 h bei 80°C hitzefixiert.
Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Vertiefungen einmal mit PBS-Tween 0,1% (s. 8.1.3.) benetzt und entweder mit der direkten oder indirekten Immunperoxidasefärbung (s. 3.2.10.4.) weiter bearbeitet.
Bei der Auswertung galt es zu berücksichtigen, dass eine Kavität bereits dann als virusinfiziert gilt, wenn das Zytoplasma nur einer Zelle rot eingefärbt ist.
Der Titer der Rücktitration sollte im Idealfall bei 100 KID50/50 µl liegen; ein Schwankungsintervall von 30 bis 500 KID50/50µl wird dabei akzeptiert.
Die Berechnung des Neutralisationstiters (ND50) erfolgte analog der Berechnung des Virustiters nach der Formel von KÄRBER (3.2.10.2.)
3.2.10.6. ELISA
Parallel zu den Untersuchungen der Seren im Virusneutralisationstests wurden die Serumproben im ELISA („Enzyme Linked Immunosorbent Assay“) mit dem kommerziell erhältlichen Kit der Firma Bommeli Diagnostics-Intervet (Chekit CSF SERO s. 8.2.) untersucht. Es handelt sich dabei um einen kompetitiven Immuntest, bei dem ein CSFV-spezifischer monoklonaler Antikörper, der gegen das E2-Protein gerichtet ist, als Konjugat eingesetzt wird. Sind in der Probe CSFV-spezifische Antikörper vorhanden, so kann der peroxidasekonjugierte Testkit-Antikörper nicht oder nur in geringerem Umfang binden.
Der genaue Arbeitsablauf war wie folgt:
In Vertiefung der mitgelieferten Testplatte wurden jeweils 75µl CHEKIT-CSF-SERO-Probenverdünner vorgelegt und anschließend 50µl der Kontrollseren und der Proben in die entsprechenden Reaktionsvertiefungen pipettiert. Um eine gleichmäßige Verteilung der Proben zu gewährleisten, wurde die Testplatte kurz geschütellt. Anschließend wurde sie abgedeckt und 90 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde die Testplatte dreimal mit CHEKIT-Waschlösung gewaschen.
Nun wurde CHEKIT-Konjugat mit dem mitgelieferten Konjugatverdünner 1:200 verdünnt und 100µl in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert. Es schloss sich eine 30 minütige Inkubation in einer feuchten Kammer an. Nach erneutem dreimaligen Waschen mit der entsprechenden Waschlösung wurden 100 µl auf 25°C vorgewärmtes CHEKIT-Chromogen in jede Reaktionsvertiefung pipettiert und erneut bei Raumtemperatur inkubiert. Das Messen der Farbreaktion erfolgte bei einer Wellenlänge von 405 nm im ELISA-Reader. Die Ergebnisse wurden berechnet als die Hemmung der Probe abzüglich des Wertes der negativen Kontrolle. Alle Proben wurden dann auf die Hemmung der positiven Kontrolle (ODneg – ODpos). Ein Wert von > 60% gilt als positiv.