Aus dem Institut für Virologie Zentrum für Infektionsmedizin der Tierärztliche Hochschule Hannover
Zur Pathogenese der Klassischen Schweinepest:
Analysen der Blutgerinnungsstörungen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Sandra Blome
aus Herne
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Volker Moennig
1. Gutachter: Prof. Dr. Volker Moennig 2. Gutachter: Prof. Dr. Ingo Nolte
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05. 2006
Das Promotionsvorhaben wurde gefördert durch ein Stipendium des Evangelischen Studienwerks e. V. Villigst
Meiner Familie in Dankbarkeit
1 EINLEITUNG... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ... 2
2.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest ... 2
2.1.1 Taxonomie ... 2
2.1.2 Morphologie und Genomorganisation ... 2
2.1.3 Virale Proteine ... 3
2.2 Die Klassische Schweinepest ... 3
2.2.1 Übertragungswege und Epidemiologie ... 4
2.2.2 Verlaufsformen der Klassischen Schweinepest ... 5
2.2.3 Pathologie ... 8
2.2.3.1 Makroskopische Veränderungen ... 8
2.2.3.2 Mikroskopische und ultrastrukturelle Veränderungen... 9
2.2.4 Pathogenese... 10
2.3 Virale hämorrhagische Fieber ... 18
2.3.1 Klassische Vertreter ... 19
2.3.2 Pathogenese der viralen hämorrhagischen Fieber ... 20
2.4 Hämostase und Hämostasekomponenten ... 23
2.4.1 Zelluläre Bestandteile ... 24
2.4.2 Endothel ... 25
2.4.3 Das plasmatische Gerinnungssystem ... 26
2.4.3.1 Der extrinsische Aktivierungsweg... 27
2.4.3.2 Der intrinsische Aktivierungsweg ... 27
2.4.3.3 Gemeinsame Endstrecke und Regulation ... 28
2.4.4 Fibrinolyse ... 30
2.4.5 Diagnostik des plasmatischen Gerinnungssystems - Globaltests ... 31
2.4.6 Fibrinogenkonzentration ... 32
2.4.7 Disseminierte intravasale Gerinnung ... 33
2.5 Pharmakologische Beeinflussung des Gerinnungssystems... 36
2.5.1 Direkt wirkende Antikoagulantien ... 36
2.5.1.1 Hirudin... 36
2.5.2 Hemmstoffe der Thrombozytenaggregation bzw. –funktion ... 37
2.5.2.1 Acetylsalicylsäure... 37
2.5.2.2 Abciximab ... 37
2.5.2.3 Tirofiban ... 38
2.5.2.4 Clopidogrel ... 38
3 MATERIAL UND METHODEN... 39
3.1 Tiere und Material... 39
3.1.1 Tiere und Versuchsaufbau... 39
3.1.2 Pharmakologisch wirksame Substanzen ... 44
3.1.3 Gewinnung und Aufbereitung der Blutproben... 45
3.1.4 Viren ... 45
3.1.5 Diagnostische Antikörper ... 46
3.1.6 Zelllinien ... 46
3.1.7 Sonstige Materialien ... 47
3.2 Methoden ... 48
3.2.1 Behandlung der Versuchstiere und klinische Parameter ... 48
3.2.1.1 Applikation und Dosierung der eingesetzten Pharmaka ... 48
3.2.1.2 Bestimmung des Clinical Score nach MITTELHOLZER et al. (2000)... 48
3.2.1.3 Erfassung der Körpertemperatur... 49
3.2.1.4 Erfassung pathologisch-anatomischer Veränderungen... 49
3.2.2 Virologische Methoden... 49
3.2.2.1 Zellkulturtechnik ... 49
3.2.2.2 Virusvermehrung und Virusernte ... 50
3.2.2.3 Virusisolierung ... 51
3.2.2.4 Virustitration ... 52
3.2.2.5 Virusneutralisationstest ... 53
3.2.2.6 Direkte Immunfärbung (Peroxidase-linked assay, PLA)... 54
3.2.2.7 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)... 55
3.2.2.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)... 56
3.2.3 Hämatologische Methoden... 58
3.2.3.1 Parameter des weißen Blutbildes... 58
3.2.3.2 Thrombozytenparameter... 58
3.2.4 Hämostaseologische Methoden... 59
3.2.4.1 Prothrombinzeit (Quick-Test)... 59
3.2.4.2 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) ... 60
3.2.4.3 Thrombinzeit ... 61
3.2.4.4 Fibrinogenbestimmung... 62
3.2.4.5 Ethanol-Gelation-Test (EGT) ... 64
3.2.4.6 Thrombozytenaggregationstest... 65
3.2.5 Pharmakokinetik ... 67
3.2.6 Statistik ... 69
3.2.7 Sonstige Methoden... 69
3.2.7.1 Ecarin Clotting Time ... 69
3.2.7.2 Einzelfaktorenbestimmung ... 70
3.2.7.3 Histopathologische Untersuchungen ... 71
4 ERGEBNISSE... 73
4.1 Voruntersuchungen zum Verlauf der Infektion mit KSPV- Stamm CSF0634 ... 73
4.1.1 Clinical Score und Körpertemperatur ... 73
4.1.2 Pathologisch-anatomische Befunde ... 76
4.1.3 Histopathologie ... 76
4.1.4 Virus-, Antigen- und Antikörpernachweis ... 78
4.1.5 Hämatologische Parameter... 79
4.1.6 Hämostaseologische Parameter... 84
4.2 Untersuchungen zur Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems mittels PEG-Hirudin ... 93
4.2.1 Nachweis des therapeutischen PEG-Hirudinspiegels... 93
4.2.2 Nachweis der Infektion ... 93
4.2.3 Entwicklung der Körpertemperatur... 93
4.2.4 Dokumentation der klinischen Symptome ... 94
4.2.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde... 96
4.2.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen ... 98
4.2.6.1 Gesamtleukozytenzahl... 98
4.2.6.2 Thrombozytenzahl und Thrombozytenparameter... 99
4.2.6.3 Hämostaseologische Parameter ... 101
4.3 Pharmakokinetische Vorversuche in vitro und in vivo... 105
4.4 Untersuchungen zur Rolle der Plättcheninteraktionen mittels Clopidogrel und ASS ... 107
4.4.1 Nachweis der Wirkung... 107
4.4.2 Nachweis der Infektion ... 107
4.4.3 Entwicklung der Körpertemperatur... 108
4.4.4 Dokumentation der klinischen Symptome ... 108
4.4.5 Erfassung der pathologisch-anatomischen Befunde... 110
4.4.6 Ergebnisse der hämatologischen Untersuchungen ... 110
4.4.6.1 Gesamtleukozytenzahl... 110
4.4.6.2 Thrombozytenzahl ... 112
4.4.6.3 Hämostaseologische Parameter ... 113
5 DISKUSSION ... 116
5.1 Auswahl und Virulenz des KSPV-Isolates... 117
5.2 Charakteristika der KSPV-Infektion mit Isolat CSF0634 ... 117
5.3 Auswirkungen der Hemmung des plasmatischen Gerinnungssystems ... 123
5.4 Auswirkungen der Thrombozytenaggregationshemmung ... 124
5.5 Schlussfolgerungen ... 128
5.5.1 Rolle des plasmatischen Gerinnungssystems und einer disseminierten intravasalen Gerinnung.... 128
5.5.2 Rolle der Thrombozyten und Thrombozyteninteraktionen ... 131
5.6 Ausblick ... 134
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 135
7 LITERATURVERZEICHNIS ... 139
8 ANHÄNGE ... 167
8.1 Tabellen und Abbildungen... 167
8.2 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Reagenzien ... 173
8.2.1 Zellkulturmedien... 173
8.2.2 Lösungen und Reagenzien ... 174
8.3 Sonstige Chemikalien ... 177
8.4 Pharmakologisch wirksame Substanzen... 178
8.5 Kommerzielle Reagenzien und Kits ... 179
8.6 Geräte und Gebrauchsgegenstände... 180
8.7 Verbrauchsmittel ... 183
8.8 Abbildungsverzeichnis... 185
8.9 Tabellenverzeichnis ... 187
DANKSAGUNG ... 189
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest. Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser
ADP Adenosindiphosphat
AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol
α alpha
α1-PI α1-Proteaseinhibitor
α2-AP α2-Antiplasmin
α2-MG α2-Makroglobulin
APACT automated platelet and coagulation tracer
aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit
ASP Afrikanische Schweinepest
ASPV Virus der Afrikanischen Schweinepest
ASS Acetylsalicylsäure
ATV adjusted trypsin-versen
BD Border Disease
BDV Border Disease Virus
BMHC-Zellen bone marrow hematopoietic cells
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
BVD Bovine Virus Diarrhoe
BVDV Bovines Virus Diarrhoe Virus
cDNA komplementäre DNA
CO2 Kohlenstoffdioxid
COX Cyclooxygenase
CS Clinical Score
CSFV Classical Swine Fever Virus, Virus der Klassischen Schweinepest
Da Dalton
DIC disseminated intravascular coagulation, disseminierte intravasale Gerinnung
DIF direkte Immunfärbung
DIN Deutsches Institut für Normung
Abkürzungsverzeichnis
DNA Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Didesoxynukleotidtriphosphate
ECT Ecarin Clotting Time
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EDulb EMEM modifiziert nach DULBECCO und FREEMAN
EGT Ethanol-Gelation-Test
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
EMEM Eagle´s Minimum Essential Medium
et al. et alii, und andere
EU Europäische Union
EURL Europäisches Referenzlabor für Klassische Schweinepest
FKN fetale Kälbernierenzellen
FKS fetales Kälberserum
fl Femtoliter
g Erdanziehungskonstante
G Giga
GPIIb/IIIa Glykoprotein IIb/IIIa, Integrin der Thrombozytenmembran
H2O Wasser
H2O2 Wasserstoffperoxid
HE Hämatoxylin/Eosin
HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung
HMWK High Molecular Weight Kininogen
i.v. intravenös
IL Interleukin
κ kappa
kb Kilobasen
KID50 kulturinfektiöse Dosis50
KSP Klassische Schweinepest
KSPV Virus der Klassischen Schweinepest
Lnn. Lymphonodi, Lymphknoten
log10 Logarithmus zur Basis 10
LPS Lipopolysaccharid
Abkürzungsverzeichnis
M Molarität
mAk monoklonaler Antikörper
µl Mikroliter
µm Mikrometer
min Minute
MW Mittelwert
N Normalität
NaCl Natriumchlorid
nAk neutralisierender Antikörper
NaOH Natronlauge
ND50 Neutralisationsdosis50
NFκB Nuclear Factor κB (Transkriptionsfaktor)
nm Nanometer
nt Nukleotide
NTR nicht-translatierte Region
OIE Office International des Èpizooties, internationales Tierseuchenamt
ORF Open reading frame, offener Leserahmen
p.i. post infectionem, nach der Infektion
p.o. per os
Pa Pascal
PAF plättchenaktivierender Faktor
PAI Plasminogenaktivatorinhibitor
PALS periarterielle lymphatische Scheiden
PBS phosphate buffered saline
PBSM phosphat buffered saline minus
PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion
PEG Polyethylenglykol
PK(15)A Porzine Zelllinie, porcine kidney (15) Amsterdam
PLA peroxidase linked assay
pmol Picomol
PO Peroxidase
PPP platelet poor plasma, plättchenarmes Plasma
Abkürzungsverzeichnis
PRP platelet rich plasma, plättchenreiches Plasma
RNA Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RT Reverse Transkriptase
RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
sec Sekunde
SFT-R permanente Schafthymuszelllinie
TF Tissue factor, Gewebefaktor
TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
TNF-α Tumornekrosefaktor α
t-PA tissue-type plasminogen activator
TXA2 Thromboxan A2
ut-PA urokinase-type plasminogen activator
VEGF vascular endothelial cell growth factor
VNT Virusneutralisationstest
vWF von-Willebrand-Faktor
1 Einleitung
Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine weltweit vorkommende, verlustreiche Tierseuche mit großer handelspolitischer und ökonomischer Relevanz. Sie zählt zu den Krankheiten, die beim internationalen Tierseuchenamt, dem Office International des Épizooties (OIE), und in allen europäischen Staaten, anzeigepflichtig sind. Die KSP wird durch ein kleines, behülltes RNA-Virus aus dem Genus Pestivirus hervorgerufen. Natürliche Wirte des Virus sind ausschließlich Haus- und Wildschweine.
Die akute Verlaufsform der Infektion mit dem KSP-Virus (KSPV) geht mit den klinischen Symptomen und pathologisch-anatomischen Befunden eines viralen hämorrhagischen Fiebers einher, wie man sie auch bei Ebola- oder Hantavirusinfektionen des Menschen beobachten kann. Bis heute ist die Pathogenese dieser Erkrankung nicht hinreichend geklärt.
Die klinischen Symptome der KSP wurden in den 1970er Jahren im Sinne einer disseminierten intravasalen Gerinnung bzw. einer Verbrauchskoagulopathie gedeutet. In jüngerer Zeit konnte jedoch gezeigt werden, dass andere Mechanismen beteiligt sind, und eine Fehlregulierung des plasmatischen Gerinnungssystems, die mit der disseminierten intravasalen Gerinnung gemeinhin verknüpft wird, nicht die Hauptursache für die Entstehung der Blutungen zu sein scheint.
Im Rahmen dieser Arbeit sollen die pathogenetischen Mechanismen der Gerinnungsstörungen sowie der Haut- und Organblutungen näher untersucht und charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurden zwei Versuchsansätze gewählt, die die pharmakologische Intervention an unterschiedlichen Stellen der Hämostase vorsahen.
2 Literaturübersicht
2.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest
2.1.1 Taxonomie
Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) wird mit den Erregern der Border Disease der Schafe (BD) und der Bovinen Virus Diarrhoe (BVD) in das Genus Pestivirus der Familie Flaviviridae eingruppiert (WENGLER et al., 1995; RICE, 1996; PRINGLE, 1999).
Zur Familie Flaviviridae gehören neben dem Genus Pestivirus die Genera Flavivirus und Hepacivirus (PRINGLE, 1999). Das Genus Hepacivirus enthält ausschließlich das Virus der Hepatitis C (BARTENSCHLAGER und LOHMANN, 2000). In das Genus Flavivirus sind u. a. das Dengue-Virus, das Virus der Frühsommer-Meningoenzephalitis, das West-Nile- Virus und das Gelbfiebervirus sowie das veterinärmedizinisch relevante Louping-Ill-Virus eingruppiert. Einige dieser Erkrankungen können mit hämorrhagischen Symptomen einhergehen. Zu den klassischen viralen hämorrhagischen Fiebern zählen u. a. das Dengue Haemorrhagic Fever und das Gelbfieber (BRAY, 2005).
2.1.2 Morphologie und Genomorganisation
Das KSPV ist ein behülltes, ikosaedrisches RNA-Virus. Der Durchmesser des vollständigen Viruspartikels beträgt zwischen 40 und 60 nm (HORZINEK et al., 1967; MOENNIG und PLAGEMANN, 1992a; WENGLER et al., 1995).
Das Genom liegt in Form eines einzelsträngigen, linearen RNA-Moleküls vor, welches Plusstrangorientierung besitzt. Das Genom besitzt eine durchschnittliche Länge von 12,5 kb und kodiert in einem einzigen offenen Leserahmen („open reading frame“ - ORF) für ein hypothetisches Polyprotein von ca. 4000 Aminosäuren, das sowohl post- als auch kotranslational prozessiert wird. Nach den Prozessierungsschritten durch virale und zelluläre Enzyme liegen elf virale Proteine vor. Der ORF wird von zwei nicht-translatierten Regionen (NTR) flankiert (RÜMENAPF et al., 1991; COLLETT, 1992; RÜMENAPF et al., 1993;
MEYERS und THIEL, 1996).
2 Literaturübersicht 3
Abbildung 2-1: Genomorganisation von Pestiviren. Strukturproteine sind in dunkelblau, Nichtstrukturproteine in hellblau dargestellt (modifiziert nach MEYERS und THIEL, 1996). Die unterschiedliche Breite der Rechtecke symbolisiert ohne direkte oder indirekte Skalierung die unterschiedlichen Längen der Proteine im Genom.
2.1.3 Virale Proteine
Das Genom kodiert vom 5´- zum 3´-Terminus für die Proteine Npro, C, Erns, E1, E2, p7, NS2-3, NS4A sowie NS5A und NS5B (Abbildung 2-1). Zu den Strukturproteinen, die das Viruspartikel bilden, gehören die Proteine C, Erns, E1 und E2. Während das Core-Protein C das Nukleokapsid bildet, besteht die Virushülle aus den Glykoproteinen Erns, E1 und E2 (THIEL et al., 1991).
Das Nichtstrukturprotein Npro ist charakteristisch für das Genus Pestivirus und besitzt autoproteolytische Aktivität (WISKERCHEN et al., 1991; STARK et al., 1993; TRATSCHIN et al., 1998). Die anderen Nichtstrukturproteine p7, NS2-3, NS4A sowie NS5A und NS5B nehmen unterschiedliche, zum Teil nicht im Detail bekannte Funktionen in der Virusreplikation wahr (MEYERS et al., 1989; GREISER-WILKE et al., 1992a; ELBERS et al., 1996; STEFFENS et al., 1999; HARADA et al., 2000; TAUTZ et al., 2000).
2.2 Die Klassische Schweinepest
Die KSP zählt zu den wichtigsten Tierseuchen weltweit und ist daher sowohl in allen Staaten der Europäischen Union (EU) als auch bei der OIE anzeigepflichtig. Das Virus ist weltweit verbreitet, wurde jedoch in einigen Ländern erfolgreich bekämpft. So sind z. B. Australien und Neuseeland sowie die USA KSPV-frei (VAN OIRSCHOT, 1999; EDWARDS et al., 2000). Aktuelle Informationen wurden dem Handistatus der OIE entnommen (http://www.oie.int/hs2/report.asp, besucht am 18.12. 2005).
5´ 3´
Strukturproteine
Npro C Erns E1 E2 p7 NS2-3 NS4A NS4B NS5A-B
NS2 NS3 NS5A NS5B
2 Die Klassische Schweinepest 4
Der Ursprung der KSP ist nicht genau festzulegen (VAN OIRSCHOT, 1999), ein Bericht des Bureau of Animal Industry (United States Department of Agriculture) aus dem Jahre 1887 weist jedoch darauf hin, dass die KSP erstmals 1833 in Ohio, USA offiziell festgestellt wurde (LIESS, 1981). Im Jahre 1903 wurde der Erreger als filtrierbares Virus nachgewiesen (DE SCHWEINITZ und DORSET, 1904).
Natürliche Wirte des KSPV, die an KSP erkranken, sind ausschließlich Haus- und Wildschweine (LIESS, 1981; LADDOMADA, 2000). Von subklinischen Infektionen wurde auch bei Kälbern, Ziegen, Schafen, Hirschen und Pekaris berichtet (LOAN und STORM, 1968).
2.2.1 Übertragungswege und Epidemiologie
Unter natürlichen Bedingungen scheint die oronasale Infektion mit dem KSPV die wichtigste Übertragungsroute darzustellen (DUNNE, 1970; PATON und GREISER-WILKE, 2003b).
Die künstliche Besamung bzw. der Deckakt stellen ebenfalls mögliche Infektionswege dar (FLOEGEL et al., 1998; DE SMIT et al., 1999), was auch retrospektive Studien zum Seuchengeschehen 1997/98 in den Niederlanden zeigten (HENNECKEN et al., 2000). Das Virus wird im Verlaufe der Erkrankung mit allen Sekreten und Exkreten, wie Urin, Kot, Speichel und Tränenflüssigkeit ausgeschieden und kann bei infizierten, tragenden Sauen die Plazentarschranke überschreiten und somit die Feten in der Gebärmutter infizieren (DAHLE und LIESS, 1992a; VAN OIRSCHOT, 1999).
Direkter Kontakt zwischen infizierten und empfänglichen Schweinen ist als Hauptweg der Virusausbreitung anzusehen (RIBBENS et al., 2004). Sowohl die (illegale) Verfütterung nicht ausreichend erhitzter Speiseabfälle als auch mechanische Vektoren wie Transportfahrzeuge und Stallgeräte spielen bei der Verbreitung des KSPV ebenfalls eine Rolle (VAN OIRSCHOT, 1999). Die retrospektive Analyse der KSP-Epidemie in den Niederlanden 1997/98 sowie die Quantifizierung der Übertragungsraten zeigten, dass dem Transport lebender Tiere die größte Bedeutung zukam, gefolgt von Transportfahrzeugen und Personenkontakt (STEGEMAN et al., 2002).
In Ländern mit endemischem KSP-Krankheitsgeschehen in der Wildschweinpopulation, kommt dem Eintrag des Virus in Hausschweinbestände durch infizierte Wildschweine eine wichtige Rolle zu (DAHLE und LIESS, 1992a; KADEN, 1998; KERN et al., 1999;
2 Literaturübersicht 5
LADDOMADA, 2000; FRÖLICH et al., 2002). Neben der oben erwähnten illegalen Fütterung von Speiseabfällen ist der direkte oder indirekte Kontakt mit infizierten Wildschweinen die häufigste Ursache für primäre KSP-Ausbrüche in Hausschweinbeständen (FRITZEMEIER et al., 2000). Infizierte Wildschweine stellen daher eine ständige Infektionsgefahr für die Hausschweinpopulation dar (MOENNIG, 2000).
2.2.2 Verlaufsformen der Klassischen Schweinepest
Die KSP kann mit einer Vielzahl von Symptomen einhergehen, die äußerst variabel auftreten und kaum spezifisch sind. Die Ausprägung der Symptome wird durch verschiedene Faktoren sowohl des Wirtes, als auch des Virus beeinflusst. So ist das Krankheitsbild stark vom Alter der betroffenen Tiere abhängig. Weitere Faktoren sind die Virulenz des KSPV-Stammes sowie Wirtsfaktoren, wie Immunstatus und Sekundärinfektionen (VAN OIRSCHOT, 1999;
MOENNIG et al., 2003). Die Inkubationszeit beträgt für das Einzeltier etwa eine Woche, wobei zwei bis zehn Tage oder noch längere Zeiträume möglich sind.
Prinzipiell können drei Verlaufsformen der KSP unterschieden werden: Die akute, die chronische und die pränatale Form. Unter Feldbedingungen sind diese Verlaufsformen nicht immer gut zu trennen, da verschiedene Krankheitsbilder in einem Bestand nebeneinander auftreten können (DEPNER et al., 1996a).
Akute Verlaufsform
Die akute Verlaufsform betrifft vor allem Absatzferkel und junge Mastschweine, wenn diese mit moderaten oder hochvirulenten KSPV-Stämmen in Berührung kommen. Zu den ersten Anzeichen der akuten KSPV-Infektion gehören hohes Fieber (häufig über 41°C), Abgeschlagenheit, verminderte Futteraufnahme und Bindehautentzündungen (DUNNE, 1970). Viele Tiere stehen mit aufgekrümmtem Rücken und gesenktem Kopf, wenn sie aufgetrieben werden (VAN OIRSCHOT, 1999) und legen sich rasch wieder ab, wobei sie Wärme suchend in Stapeln aufeinander liegen. Geschwollene Lymphknoten, die vor allem in der Leistengegend sichtbar werden, sowie Atemwegsbeschwerden wie Husten, Niesen und Atemgeräusche treten hinzu. Während der ersten Phase des hohen Fiebers zeigen die betroffenen Tiere häufig Erbrechen, Hyperämie der Haut und Verstopfung (VAN OIRSCHOT, 1999). Im weiteren Verlauf tritt schwerer Durchfall auf. Im Verlauf der
2 Die Klassische Schweinepest 6
Erkrankung können zentralnervöse Symptome auftreten, die sich in Hinterhandschwäche, unkoordinierten Bewegungen, Lähmungen oder Krämpfen äußern können (MOENNIG et al., 2003). In der Spätphase der Erkrankung können punktförmige (Petechien) und flächige (Ekchymosen) Blutungen in der Haut sowie unregelmäßig blaurote Verfärbungen an Ohren, Schwanz und im Bereich der Gliedmaßen und des Unterbauchs auftreten (VAN OIRSCHOT, 1999; MOENNIG et al., 2003). Die betroffenen Tiere versterben in der Regel zehn bis 20 Tage nach der Infektion.
Labordiagnostisch ist eine schwere Leukopenie zu finden. Die dadurch bedingte Immunsuppression ist verantwortlich für teils schwere Sekundärinfektionen der Lunge bzw.
des Magen-Darm-Traktes (SCHMIDT und KAADEN, 1968; VAN OIRSCHOT, 1999). Diese Symptome überlagern häufig die typischen Schweinepestanzeichen, was unter Feldbedingungen zu Problemen in der Diagnose führen kann (DEPNER et al., 1999;
MOENNIG et al., 2003). Neben der Leukopenie tritt eine schwere Thrombozytopenie auf (DUNNE, 1970).
Bei letal verlaufenden KSPV-Infektionen werden keine oder nur geringe Mengen neutralisierender Antikörper gebildet, die ggf. kurz vor dem Verenden der Tiere nachweisbar sind (RESSANG, 1973a; LIESS et al., 1977; DEPNER et al., 1994).
Neben dieser typischen akuten Verlaufsform treten auch perakute und subakute bzw.
transiente Verläufe auf. Die perakute Verlaufsform kann bei jungen Ferkeln auftreten, die nach einer kurzen Phase hohen Fiebers plötzlich versterben (DUNNE, 1970). Untersucht man diese Tiere, sind in der Regel ausschließlich Schocksymptome zu verzeichnen (TRAUTWEIN, 1988). Transiente, oft subklinische Verläufe, die mit der vollständigen Genesung der Tiere enden, treten bei älteren Mastschweinen oder Zuchttieren sowie im Zusammenhang mit schwach virulenten Virusstämmen auf. Nach einer kurzen Phase milder klinischer Symptome bilden diese Tiere eine effektive Immunantwort aus. Während ein Antigen- bzw. Virusnachweis in diesen Fällen zeitweilig möglich ist, deuten die klinischen Befunde nicht auf eine KSPV-Infektion hin. Dieser Umstand hat zur Bezeichnung „atypische“
Verlaufsform geführt (DAHLE und LIESS, 1992b; DEPNER et al., 1996a).
2 Literaturübersicht 7
Chronische Verlaufsform
Die chronische Verlaufsform tritt auf, wenn die betroffenen Tiere nicht in der Lage sind, eine adäquate und effektive Immunantwort auszubilden. Sie ist gekennzeichnet durch eine Krankheitsdauer von mehr als 30 Tagen (MENGELING und PACKER, 1969) und ist häufig mit moderat virulenten KSPV-Stämmen assoziiert (VAN OIRSCHOT, 1999). Während der Erkrankung, die in diesem Fall einen protrahierten Verlauf nimmt, zeigen die Tiere abwechselnd Phasen akuter klinischer Erkrankung und zeitweiliger Besserung (DEPNER et al., 1996a; DEPNER et al., 1996b). Chronisch erkrankte Schweine können mehrere Monate überleben, die Erkrankung endet jedoch immer tödlich (MENGELING und PACKER, 1969;
VAN OIRSCHOT, 1999). Unspezifische Krankheitszeichen wie Mattigkeit und Fressunlust, wiederkehrende Fieberschübe, Hautveränderungen, chronische Darmentzündungen und fortschreitende Auszehrung sind im Verlauf der Erkrankung zu verzeichnen. Jungtiere sind in ihrer Entwicklung gestört und kümmern (VAN OIRSCHOT, 1999; MOENNIG et al., 2003).
Pränatale Infektion
Das KSPV ist in der Lage, die Plazentarschranke tragender Sauen zu überschreiten (VAN OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977). Während die Infektion bei der Sau häufig mild oder subklinisch verläuft, hängen die Folgen für die Feten vom Entwicklungsstadium und der Virulenz des Erregers ab (MOENNIG und PLAGEMANN, 1992b). In der frühen Phase der Trächtigkeit führt eine KSPV-Infektion meistens zu Aborten bzw. Totgeburten, aber auch zu Mumifikationen und Missbildungen. Eine Infektion zwischen dem 50. und 70. Tag der Trächtigkeit kann zur Geburt persistierend infizierter Ferkel führen (VAN OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977; MEYER et al., 1981). Diese Ferkel können bei der Geburt gesund erscheinen, zeigen jedoch im weiteren Verlauf die so genannte Spätform („late onset“) der KSP und verenden schließlich. Wachstumsstörungen, Kümmern, Bindehautentzündungen, Hautentzündungen und Bewegungsstörungen stehen dabei im Vordergrund. An der Spätform erkrankte Tiere können bis zu elf Monate überleben und scheiden konstant große Mengen an Virus aus, was sie zu einer bedeutsamen Gefahr für andere Schweine werden lässt (VAN OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977). Nach dem 85. Tag der Trächtigkeit infizierte Ferkel werden i. d. R. nicht virämisch geboren (MOENNIG und PLAGEMANN, 1992b).
2 Die Klassische Schweinepest 8
2.2.3 Pathologie
2.2.3.1 Makroskopische Veränderungen
Die Ausprägung des pathologischen Bildes hängt vom Alter der Tiere, dem Infektionszeitpunkt und vom involvierten KSPV-Stamm ab. Das typische pathologisch- anatomische Bild der akuten KSPV-Infektion ist geprägt durch multiple Blutungen unterschiedlichen Ausmaßes in nahezu allen Organen und durch Entzündungssymptome katarrhalischen, fibrinösen und hämorrhagischen Charakters, die sich v. a. in der Lunge, im Magen-Darm-Trakt sowie im Urogenitaltrakt finden (RÖHRER und PEHL, 1960). Die Entzündungssymptome sind nicht selten die Folge sekundärer Infektionen (VAN OIRSCHOT, 1999). RÖHRER und PEHL (1960) beschreiben das Sektionsbild als hämorrhagische Septikämie, deren charakteristische Blutungen auf eine Permeabilitätsstörung im Blutgefäßsystem hindeuten.
Die augenfälligsten Befunde treten in Lymphknoten und Nieren auf. Die Lymphknoten sind hochgradig vergrößert, ödematös und in vielen Fällen hämorrhagisch infarziert. In den Nieren sind petechiale und ekchymatöse Blutungen häufig, die vor allem die Nierenrinde, seltener auch das Nierenmark und die Hilusregion betreffen und vielfach von einer lehmartigen Farbe des Parenchyms begleitet sind (RÖHRER und PEHL, 1960; VAN OIRSCHOT, 1999).
Ein pathologisch-anatomischer Befund, der als fast pathognomonisch für die KSP angesehen wird, jedoch nicht immer auftritt, sind Milzrandinfarkte (RÖHRER und PEHL, 1960;
TRAUTWEIN, 1988; VAN OIRSCHOT, 1999).
Nekrotische, durch Infarkte hervorgerufene Herde treten nicht selten in den Tonsillen auf, wo sie durch bakterielle Besiedlung zu eitrigen Entzündungen führen (DUNNE, 1970; VAN OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000). Ein typischer Befund, welcher durch Sekundärinfektionen mit bakteriellen Erregern hervorgerufen wird, sind schwere katarrhalisch-eitrige und fibrinöse Pneumonien, die in einigen Fällen von interstitiellen Ödemen begleitet sind (RÖHRER und PEHL, 1960). Eine nicht-eitrige Enzephalitis ist in fast allen Fällen nachweisbar (RÖHRER und PEHL, 1960; GRUBER et al., 1995).
Chronisch erkrankte Schweine zeigen weniger ausgeprägte Befunde. Hämorrhagien und Infarkte können vollständig fehlen. Charakteristische Befunde sind Thymusatrophie und Lymphozytendepletion in peripheren lymphatischen Organen (VAN OIRSCHOT, 1999). Bei chronisch erkrankten Tieren ist eine Hyperplasie der Nebennierenrinde charakteristisch
2 Literaturübersicht 9
(CHEVILLE und MENGELING, 1969; VAN DER MOLEN und VAN OIRSCHOT, 1981).
Nekrotische und ulzerative Veränderungen in der Darmwand sind ebenfalls häufig mit der chronischen Verlaufsform assoziiert. Diese so genannten „Boutons“ treten v. a. in Zäkum und Kolon auf und bilden kraterförmige Ulzerationen. Ossifikationsdefekte bzw. Läsionen im Bereich von Knorpel-Knochen-Übergängen treten v. a. an den Rippen als deutliche Auftreibungen mit heller Streifung zu Tage (DUNNE, 1970; TEIFKE et al., 2002).
2.2.3.2 Mikroskopische und ultrastrukturelle Veränderungen
Das Ausmaß der histopatholgischen Veränderungen steht ebenfalls in Beziehung zur Virulenz des beteiligten KSPV-Stammes. Eine generalisierte Vaskulitis und Lymphozytennekrose sowie Enzephalitis ist für die Infektion mit hochvirulenten KSPV-Stämmen charakteristisch (NARITA et al., 2000). Die genannten Läsionen konnten mit der Lokalisation des Antigens in Verbindung gebracht werden. Die Lymphozytendepletion betrifft v. a. die B-Lymphozyten (SUSA et al., 1992; QUEZADA et al., 2000).
Die oben beschriebenen makroskopischen Veränderungen in den Lymphknoten korrellieren mit einer ausgeprägten Lymphozytendepletion und retikulärer Hyperplasie im histopatho- logischen Bild (VAN OIRSCHOT, 1999). Kleinste Gefäße können Thrombosierungen, Nekrosen und fibrinoide Quellungen zeigen. Größere Gefäße sind dagegen nicht betroffen (RÖHRER und PEHL, 1960).
Mit den makroskopischen Veränderungen in den Nieren korrespondiert ein Blutaustritt in das Nierenparenchym aus interstitiellen Kapillaren, die Glomeruli scheinen hingegen nicht betroffen. Die Kapillarschlingen können fibrinoide Veränderungen zeigen, was sekundär zu einer Verödung der Glomeruli führt (RÖHRER und PEHL, 1960). QUEZADA et al. (2000) beschreiben Hämorrhagien und Mikrothromben vor allem in glomerulären Kapillaren.
Die Milzrandinfarkte zeigen sich im histopathologischen Bild als gemischte Infarkte mit ischämischer zentraler Nekrose und sekundär ausgebildetem hämorrhagischen Hof.
Mikrothromben und hyalinisierende Veränderungen in arteriellen Endothelien wurden in diesem Zusammenhang von QUEZADA et al. (2000) beschrieben. In dieser Arbeit wurden auch Fibrinnetze in der roten Pulpa nachgewiesen (QUEZADA et al., 2000).
Fast alle KSPV-infizierten Schweine zeigen eine nicht-eitrige Enzephalitis, deren Hauptcharakteristikum perivaskuläre Infiltrationen sind (RÖHRER und PEHL, 1960;
GRUBER et al., 1995; VAN OIRSCHOT, 1999; QUEZADA et al., 2000).
2 Die Klassische Schweinepest 10
In den Krypten der Tonsillen finden sich leukozytäre Infiltrationen des Epithels und Veränderungen der lymphoiden Zellsubstanz die in späten Erkrankungsstadien nekrotischen Charakter haben können. Die ersten Veränderungen sind jedoch follikuläre Hyperplasie, Proliferation der Retikulumzellen und Aktivierung der Endothelzellen (RÖHRER und PEHL, 1960).
Das histopathologische Äquivalent der Veränderungen an den Knorpel-Knochen-Grenzen sind hypertrophierte Chondrozyten, erweiterte Lakunen, hyperämische Kapillaren und multifokale Blutungen (TEIFKE et al., 2002). TEIFKE et al. (2002) fanden im Bereich der Metaphyse zudem ein fast vollständiges Fehlen von Osteoblasten und Osteozytennekrosen.
Die dort entstehende osteoporotische Zone wurde auch von anderen Autoren beschrieben (DUNNE et al., 1957).
Chronisch erkrankte Tiere zeigen hämotopoietische Aktivität in der Milz (VAN OIRSCHOT und TERPSTRA, 1977; SUMMERFIELD et al., 1998a; NARITA et al., 2000).
Disseminierte Mikrothrombosen wurden im Zusammenhang mit akuten KSPV-Verläufen beschrieben (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; QUEZADA et al., 2000).
2.2.4 Pathogenese
Die primäre Virusvermehrung erfolgt in den Tonsillen (DUNNE, 1970; RESSANG, 1973b;
LIESS, 1987). Von dort aus findet eine Ausbreitung des Virus in das umliegende lymphoretikuläre Gewebe statt. Über die Lymphgefäße bzw. den Lymphstrom gelangt das Virus in die regionären Lymphknoten. Hier findet eine ausgeprägte Virusreplikation mit anschließender Ausbreitung über das Blutgefäßsystem mit massiver Virämie statt. Das Virus gelangt so an die sekundären Replikationsorte. Die sekundäre Virusvermehrung findet vor allem in Milz, Knochenmark, viszeralen Lymphknoten und den lymphatischen Geweben des Darms statt. (RÖHRER und PEHL, 1960; RESSANG, 1973b). Hauptzielzellen des Virus sind Makrophagen (SUMMERFIELD et al., 1998b; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2001;
SANCHEZ-CORDON et al., 2003), Endothelzellen (TRAUTWEIN, 1988), lymphoretikuläre Zellen und Epithelzellen (MOENNIG, 2000). Nach fünf bis sechs Tagen ist die Virusausbreitung im Organismus abgeschlossen (RESSANG, 1973b).
2 Literaturübersicht 11
Das klinische Bild der akuten KSP gleicht anderen viralen hämorrhagischen Erkrankungen, zu denen u. a. auch die Afrikanische Schweinepest (ASP) gehört. Beide Erkrankungen haben die Replikation des Virus in monozytären Zellen und einen ähnlichen pathogenetischen Mechanismus gemein, der zu den charakteristischen Blutungen führt (ANDERSON, 1986;
GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Im Folgenden soll daher besonders auf die Veränderungen der Makrophagenpopulationen, die möglichen Ursachen der Lymphopenie und Thrombozytopenie sowie die Entstehungsmechanismen der Hämorrhagien während der akuten Verlaufsform der KSP eingegangen werden.
Einfluss der KSPV Infektion auf Makrophagen
Veränderungen der Zahl der Makrophagen während einer KSPV-Infektion treten im Sinne eines kurzfristigen Anstiegs in der Anfangsphase der Erkrankung bzw. eines Abfalls im weiteren Verlauf zu Tage. Infektion, apoptotische Prozesse sowie phagozytotische und sekretorische Aktivierung treten in allen Makrophagenpopulationen auf (GOMEZ- VILLAMANDOS et al., 2003a). Betroffen sind Makrophagenpopulationen der Milz (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2001; SANCHEZ-CORDON et al., 2005b), des Knochen- marks (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 1998; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b), der Nieren (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001), der Lunge (CARRASCO et al., 2001), des Thymus (SANCHEZ-CORDON et al., 2002), des Darms (SANCHEZ-CORDON et al., 2003) sowie der Leber (NUNEZ et al., 2005).
GOMEZ-VILLAMANDOS et al. (2001) konnten für Milzmakrophagen nachweisen, dass die phagozytotische und sekretorische Aktivität der Makrophagen zunimmt und apoptotische Prozesse stattfinden. Es wird angenommen, dass die Makrophagen der periarteriellen lymphatischen Scheiden (PALS) in andere Gebiete auswandern. Die Phagozytose infizierter apoptotischer Körperchen (Makrophagen, Lymphozyten, neutrophile Granulozyten) könnte zur Ausbreitung des Virus beitragen und das Fehlen entzündlicher Veränderungen in durch Zelltod betroffenen Arealen in der frühen Phase der Infektion erklären (GOMEZ- VILLAMANDOS et al., 2003a).
Es wird angenommen, dass aktivierte bzw. qualitativ veränderte Makrophagen und deren Mediatoren, die sie an unterschiedlichen Orten freisetzen, eine Hauptrolle in der Pathogenese
2 Die Klassische Schweinepest 12
der KSPV-Infektion spielen (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Eine direkte Schädigung durch das KSPV wurde für viele Läsionen, die im Rahmen der KSP-Erkrankung auftreten, weitgehend ausgeschlossen. So ließen sich weder die Lymphopenie (SUMMERFIELD et al., 1998b; SATO et al., 2000; SANCHEZ-CORDON et al., 2002), noch die beschriebenen Hämorrhagien in den Nieren (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000) auf direkte Viruseinwirkung zurückführen. Auch für die Thrombozytopenie konnte ein solcher pathogenetischer Mechanismus nicht nachgewiesen werden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 1998). Es ist vielmehr anzunehmen, dass unterschiedliche Zytokine ursächlich beteiligt sind. Zu diesen Mediatoren gehören der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL- 1β) und 1α (IL-1α) (SANCHEZ-CORDON et al., 2002) sowie Interleukin-6 ( IL-6).
In KSPV-infizierten Alveolarmakrophagen (in vitro) und den Lymphknoten infizierter Schweine konnte eine erhöhte Expression von TNF-α bzw. TNF-α-Protein nachgewiesen werden (CHOI et al., 2004). TNF-α ist in der Lage, Apoptose in unterschiedlichen Zellpopulationen auszulösen (ZHENG et al., 1995; NAGATA, 1997) und kommt somit als Induktor der Leukopenie in Frage. Bei den betroffenen Zellen handelt es sich vorwiegend um Leukozyten, den morphologischen Kriterien nach speziell um Makrophagen. Ferner konnten CHOI et al. (2004) apoptotische Vorgänge sowohl in KSPV-infizierten als auch nicht- infizierten lymphatischen Zellen nachweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass KSPV sowohl auf direktem, als auch auf indirektem Wege Apoptose auslösen kann (CHOI et al., 2004). Wie die KSPV-Infektion die TNF-α Produktion anregt, ist bisher nicht ausreichend geklärt. Das Vorhandensein von KSPV-Antigen in den TNF-α positiven Makrophagen legt jedoch nahe, dass virale Komponenten über die Bindung an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche oder Mechanismen im Inneren der Zelle den Trigger für die TNF-α Synthese darstellen (CHOI et al., 2004).
Neben TNF-α können auch IL-1 und IL-6 Apoptose in unterschiedlichen Zellspezies induzieren. Dies wurde für andere virale Erkrankungen bereits nachgewiesen (RAZVI und WELSH, 1993; GOMEZ DEL MORAL et al., 1999). Für die KSP konnte die Rolle des TNF-α und IL-1 demonstriert werden (SANCHEZ-CORDON et al., 2002). Eine erhöhte IL-1- Produktion nach einer KSPV-Infektion wurde auch in vitro gezeigt (KNOETIG et al., 1999), in diesem Fall in Kombination mit erhöhter Prostaglandin-E2-Produktion. Eine Beteiligung des TNF-α oder IL-6 konnte in vitro nicht nachvollzogen werden (KNOETIG et al., 1999).
2 Literaturübersicht 13
Für die Makrophagen der Leber konnte gezeigt werden, dass im Verlauf der akuten KSPV- Infektion neben einer Aktivierung der Phagozytose eine Überexpression pro- inflammatorischer Zytokine stattfindet. Sowohl TNF-α, als auch IL-6 und IL-1α wurden vermehrt exprimiert (NUNEZ et al., 2005). Besonders der Verlauf der IL-1α Produktion wies einen Zusammenhang mit dem Auftreten klinischer Symptome und pathologisch-anatomisch nachweisbarer Hämorrhagien auf (NUNEZ et al., 2005).
Einfluss des KSPV auf Lymphozyten und Pathogenese der Lymphopenie
Die KSPV-Infektion verursacht vor allem in ihrer akuten Verlaufsform eine schwere Lymphopenie und eine damit verbundene Immunsuppression, die bereits vor Auftreten der ersten Symptome nachweisbar ist (TRAUTWEIN, 1988; PAULY et al., 1998). Eine Depletion verschiedener Lymphozytenpopulationen konnte schon vor dem Auftreten einer nachweisbaren Virämie gezeigt werden (SUMMERFIELD et al., 2001a). In den lympho- retikulären Organen kommt es zu einer ausgeprägten Depletion der Lymphozyten, v. a. der B- Lymphozytenpopulation (SUSA et al., 1992; NARITA et al., 2000; QUEZADA et al., 2000).
Eine direkte Schädigung der Lymphozyten durch das Virus konnte nicht nachgewiesen werden (SATO et al., 2000; SUMMERFIELD et al., 2001b; SANCHEZ-CORDON et al., 2002), obwohl eine Nekrose lymphatischer Zellen durch direkte Viruseinwirkung (NARITA et al., 1996) bzw. Apoptoseinduktion durch virale Komponenten (BRUSCHKE et al., 1997) diskutiert wurden. Das Phänomen der außerordentlich früh auftretenden Leukopenie wird mit einer indirekt induzierten Apoptose lymphatischer Zellen in Verbindung gebracht (SATO et al., 2000, SUMMERFIELD et al., 1998). Jedoch könnten sowohl eine direkte als auch indirekte Apoptoseinduktion durch das KSPV ein Rolle spielen (CHOI et al., 2004). Eine Möglichkeit der direkten Einwirkung ist die Wirkung viraler Proteine auf umliegende Zellen.
BRUSCHKE et al. (1997) zeigten, dass das Glykoprotein Erms in Lymphozyten unterschiedlichster Spezies Apoptose auslöst. Da Erns in bedeutsamen Mengen in die Umgebung der infizierten Zellen abgegeben wird, könnte es in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen (BRUSCHKE et al., 1997; CHOI et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass die Depletion der Lymphozyten in Thymus und Milz zeitlich mit dem vermehrten Auftreten von Makrophagen zusammenfiel, die phagozytierte Zelltrümmer enthielten („tingible body“ macrophages). Zudem ging die Lymphozytendepletion mit eindeutigen Hinweisen
2 Die Klassische Schweinepest 14
apoptotischer Veränderungen wie Kernpyknose und Karyorrhexis einher (SANCHEZ- CORDON et al., 2005a). Quantitative Veränderungen der T-Lymphozytenpopulationen sowie qualitative Veränderungen der Zytokinexpression durch diese Zellen wurden von SANCHEZ- CORDON et al. (2005) im Sinne einer zellvermittelten Immunantwort vom Typ 1 interpretiert, die im späteren Verlauf von einer Typ 2 Immunantwort abgelöst wird.
Neben einer ausgeprägten Lymphopenie, kommt es im Verlauf der Infektion mit dem KSPV auch zu einer markanten Granulozytopenie (SUSA et al., 1992; SUMMERFIELD et al., 1998a; SUMMERFIELD et al., 1998b). Die Depletion der Granulozyten, die bereits drei Tage nach der Infektion auftritt, betrifft sowohl reife Blutgranulozyten als auch unreife Vorläuferzellen im Knochenmark (SUMMERFIELD et al., 2000). Es konnte von SUMMERFIELD et al. (2000) gezeigt werden, dass sowohl apoptotische, als auch nekrotische Veränderungen im Knochenmark eine Rolle spielen. Für die Caspasen 3 und 9 konnten erhöhte Aktivitäten besonders an Tag sieben der Infektion ermittelt werden, wobei letzteres für die Beteiligung des mitochondrialen Weges der Apoptoseinduktion spricht (BUDIHARDJO et al., 1999). Die Fähigkeit zur Differenzierung und somit der Granolozytopoese war in Knochenmarkszellen infizierter Tiere über den gesamten Verlauf der Erkrankung nicht gestört. Unreife Granulozyten nahmen, relativ gesehen, über den Zeitraum der Infektion zu. Eine Zellschädigung bzw. Apoptoseinduktion durch die KSPV- Infektion an sich erscheint in diesem Zusammenhang unwahrscheinlich, da die Anzahl apoptotischer bzw. toter Zellen die Anzahl infizierter Zellen, besonders zu Beginn der Infektion, bei weitem überstieg (SUMMERFIELD et al., 2000). Eine weitere Beobachtung in einem in vitro Modell an BMHC-Zellen (bone marrow hematopoietic cells) war, dass die Mehrzahl infizierter Zellen keine Anzeichen einer Apoptose zeigten, bzw. fast alle apoptotischen Zellen nicht mit KSPV infiziert waren. Somit scheint ein indirekter Mechanismus der Apoptoseinduktion die Hauptrolle zu spielen (SUMMERFIELD et al., 2001b). In vitro konnten SUMMERFIELD et al. (2001b), im Gegensatz zu den Ergebnissen in vivo (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b), keine Beteiligung von Makrophagen, Zytokinen oder reaktiven Sauerstoffspezies nachweisen.
2 Literaturübersicht 15
Einfluss der KSPV Infektion auf Thrombozyten
Ein charakteristisches Symptom im Verlauf der akuten KSP ist eine hochgradige Thrombozytopenie, deren Beginn mit dem Auftreten von Fieber und einer messbaren Virämie korrelliert (HEENE et al., 1971; HOFFMANN et al., 1971a; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 1998). Prinzipiell kann eine Thrombozytopenie durch verminderte oder fehlende Thrombozytopoiese (Bildungsstörung), erhöhten peripheren Verschleiß durch Verbrauch, Verlust bzw. Zerstörung (Umsatzstörung oder Verlust) oder eine veränderte Plättchenverteilung (Verteilungsstörung) hervorgerufen werden (BAUTISTA et al., 2002).
Als Ursache der Thrombozytopenie im Rahmen der KSPV-Infektion werden verschiedene Mechanismen diskutiert. HOFFMANN et al. (1971) und CALDERON et al. (1998) führten dieses Phänomen auf eine massive Degeneration der Megakaryozyten im Knochenmark zurück. HEENE et al. (1971) und HOFFMANN et al. (1971) brachten die auftretende Thrombozytopenie zudem mit den Auswirkungen einer Verbrauchskoagulopathie bzw.
disseminierten intravasalen Gerinnung in Verbindung. WEISS et al. (1973) wies Virus in Thrombozyten akut erkrankter Schweine nach und brachte die Thrombozytopenie in Zusammenhang mit einer vorausgehenden Infektion von Megakaryozyten und nachfolgenden Zerstörung der Thrombozyten.
GOMEZ-VILLAMANDOS et al. konnten 1998 zeigen, dass nur eine geringe Zahl Megakaryozyten (2-4%) eine Infektion aufweist und postulierten, dass die Intensität der Thrombozytopenie durch eine Zerstörung der Megakaryozyten im Zuge einer Infektion nicht hinreichend erklärt werden kann. BAUTISTA et al. (2002) beschreiben Zellveränderungen an Tag zwei und vier post infectionem in Milz und Leber, die auf eine Plättchenaktivierung und -aggregation sowie sekretorische und phagozytotische Aktivierung der residenten Makrophagen hindeuten. In diesem Zusammenhang wird eine massive Aktivierung und nachfolgende Phagozytose der Plättchen, ausgelöst durch die Freisetzung plättchenaktivierender Faktoren durch aktivierte Makrophagen als primäre Ursache der massiven Thrombozytopenie im Verlauf der KSP diskutiert. Eine Aktivierung und Aggregation der Plättchen durch den Tissue Factor (TF, Gewebefaktor) wird von oben genannten Autoren aufgrund mangelnder Fibrinablagerungen in den betroffenen Organen ausgeschlossen, während eine disseminierte intravasale Gerinnung mit der Begründung ausgeschlossen wird, dass Mikrothromben erst in der Finalphase der Erkrankung, also nach
2 Die Klassische Schweinepest 16
Auftreten der Thrombozytopenie zu finden sind (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Morphologische Zeichen eines Endothel- oder sonstigen Gewebeschadens, der eine Aktivierung des Gerinnungssystems herbeigeführt haben könnte, konnten von BAUTISTA et al. (2002) ebenfalls nicht aufgespürt werden.
In verschiedenen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass es zu ausgeprägten Veränderungen im Knochenmark KSPV-infizierter Schweine kommt, die jedoch erst nach dem Auftreten der Thrombozytopenie nachweisbar sind (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 1998; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003b).
Die von HOFFMANN et al. (1971) und CALDERON et al. (1998) beschriebenen degenerativen Veränderungen der Megakaryozyten konnten auch in diesen Studien als
„nackte Megakaryozytenkerne“ gezeigt werden, werden jedoch hier im Sinne einer Folge (Versuch einer Wiederherstellung normaler Plättchenzahlen) diskutiert (GOMEZ- VILLAMANDOS et al., 2003b).
In vitro konnte gezeigt werden, dass in KSPV-infizierten Endothelzellen der Transkriptions- faktor NFκB aktiviert wird, welcher für die Kontrolle der Aktivierung von Endothelzellen verantwortlich ist. Es kommt zusätzlich zu einer erhöhten Expression von proinflammatorischen (IL-1α, IL-6 und IL-8) und prokoagulatorischen Faktoren (BENSAUDE et al., 2004). Sowohl die Expression des Gewebefaktors als auch des Endothelzellwachstumsfaktors VEGF (vascular endothelial cell growth factor) und des Zelloberflächen-Adhäsionsmoleküls E-Selektin waren in vitro erhöht. Somit könnten aktivierte Endothelzellen eine wichtige Rolle in der Entstehung hämostaseologischer Störungen spielen (BENSAUDE et al., 2004). NUNEZ et al. (2005) konnten Plättchenaggregate und aktivierte Plättchen in der Leber infizierter Tiere nachweisen, die in räumlicher Nähe zu von Kupffer-Zellen auftraten. Es wird diskutiert, ob die IL-1 Produktion durch die von Kupffer-Zellen eine Rolle bei der Entstehung der Thrombozytopenie spielt (NUNEZ et al., 2005), da IL-1 nachgewiesenermaßen zu einer Aktivierung von Plättchen führen kann (REALE et al., 1996).
Pathogenese der Hämorrhagien im Verlauf der akuten KSPV Infektion
Hämorrhagien, vor allem in den Lymphknoten und Nieren, gehören zum klassischen Bild der akuten KSPV-Infektion (RÖHRER und PEHL, 1960; VAN OIRSCHOT, 1999). Die
2 Literaturübersicht 17
zugrunde liegenden pathogenetischen Mechanismen wurden in verschiedene Richtungen diskutiert (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a). Zu diesen Mechanismen gehören die direkte Schädigung des Endothels durch das KSPV (HEENE et al., 1971), die ursächliche Beteiligung der Thrombozytopenie durch veränderte Plättchen (WEISS et al., 1973) und eine disseminierte intravasale Gerinnung (HOFFMANN et al., 1971a; GRUBER et al., 1995;
BENSAUDE et al., 2004) bzw. eine diffuse Aktivierung des Blutgerinnungssystems durch eine Schädigung des Endothels (TRAUTWEIN, 1988). TRAUTWEIN (1988) diskutiert zudem, dass eine durch Mikrothromben hervorgerufene Endothelschädigung die Ursache für Plasmaverluste und perivaskuläre Hämorrhagien sein könnte. Petechien, die v. a. in Assoziation mit Kapillaren auftreten, sind in den Nieren akut an KSP erkrankter Schweine ab dem siebten Tag nach der Infektion in Kombination mit Erythrodiapedese (Austritt von Erythrozyten aus den Blutgefäßen durch Lücken der Gefäßwand) nachgewiesen worden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001). Mit der beschriebenen Erythrodiapedese gehen eine Vergrößerung der Kapillarlichtung, mononukleäre Infiltrate und eine Erhöhung der Mastzellzahl und -degranulierung einher (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001; GOMEZ- VILLAMANDOS et al., 2003a). Ultrastrukturelle und morphometrische Untersuchungen zeigten in diesem Zusammenhang, dass es zu einer ausgeprägten Vasodilatation und herabgesetzter Wanddicke des Endothels kommt (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000).
Die mononukleären Infiltrate, die im Zusammenhang mit den renalen Hämorrhagien auftraten, wurden hauptsächlich als T- und B-Lymphozyten charakterisiert, Makrophagen wurden nur in geringer Zahl gefunden (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2000). Sowohl die kapilläre Vasodilatation und erhöhte Permeabilität, als auch die Auswanderung von Erythrozyten und Leukozyten aus den Kapillaren, können durch Zytokine vermittelt werden (MANTOVANI et al., 1992). Makrophagen, die zu den Hauptzielzellen des KSPV gehören (RESSANG, 1973a; TERPSTRA, 1991), sind zwar nur in geringem Maße an den perivaskulären Infiltraten im Bereich renaler Hämorrhagien beteiligt (GOMEZ- VILLAMANDOS et al., 2000), besitzen jedoch eine ausgeprägte Kapazität, die vaskuläre Permeabilität zu beeinflussen, was auch im Zusammenhang mit anderen viralen hämorrhagischen Fiebern gezeigt werden konnte (BRAY, 2005). Im Verlauf der KSPV Infektion zeigen sie eine sekretorische Aktivierung und können somit eine wichtige Rolle für
2 Virale hämorrhagische Fieber 18
den Entstehungsmechanismus KSPV induzierter Hämorrhagien spielen (GOMEZ- VILLAMANDOS et al., 2000; GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Weitere pathogenetische Mechanismen
Als pathogenetischer Auslöser wird eine hypoxische Nekrose der Osteoklasten und Osteoblasten ausgelöst durch geschädigte Kapillarendothelien (PALMER 1992, zitiert durch TEIFKE et al. 2002) bzw. ein Stillstand des Knorpelabbaus und der Ossifikation durch einen KSPV induzierten Verlust osteoblastischer Aktivität diskutiert (TEIFKE et al., 2002). Eine erhöhte Produktion von Zytokinen und Entzündungsmediatoren wird im Zusammenhang mit Knochenerkrankungen unterschiedlicher Genese ursächlich mit der erhöhten osteoklastischen Aktivität, aber auch einer Osteoblasten-Apoptose in Verbindung gebracht (BOYCE et al., 1999).
In den Nieren KSPV-infizierter Schweine konnten im chronischen Verlauf der Infektion bzw.
ab dem zehnten Tag nach der Infektion Immunkomplexe nachgewiesen werden (CHEVILLE et al., 1970; RUIZ-VILLAMOR et al., 2001), die aus den Immunglobulinen M und G sowie dem Komplementfaktor C1q bestanden; virales Antigen war nicht als Komponente dieser Komplexe nachweisbar (RUIZ-VILLAMOR et al., 2001). Es wird diskutiert, ob diese Immunkomplexe aus einer Überproduktion nicht-spezifischer Antikörper resultieren, wie sie für persistent BVDV-infizierte Rinder beschrieben wurden (HEWICKER et al., 1987).
2.3 Virale hämorrhagische Fieber
Virale hämorrhagische Fieber, zu denen auch die akute Verlaufsform der KSP zählt, weisen trotz unterschiedlicher Genese einige Gemeinsamkeiten auf, die sich besonders in der Pathogenese der Erkrankungen widerspiegeln (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a).
Zum Verständnis der pathogenetischen Mechanismen der KSP könnten daher auch Erkenntnisse beitragen, die für andere virale Erkrankungen gewonnen wurden, die mit den Symptomen eines hämorrhagischen Fiebers einhergehen. Aus diesem Grund wird ein kurzer Einblick in die pathogenetischen Mechanismen gegeben, die für klassische Vertreter viraler hämorrhagischer Fieber bekannt sind.
2 Literaturübersicht 19
2.3.1 Klassische Vertreter
Die Erreger charakteristischer viraler hämorrhagischer Fieber finden sich in den Virusfamilien Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae und Filoviridae (FELDMANN et al., 1996; CHEN und COSGRIFF, 2000). Die genannten Familien enthalten behüllte, einzelsträngige RNA-Viren (BRAY, 2005). Das Virus der ASP (ASPV) stellt insofern eine Ausnahme dar, als es sich um ein DNA-Virus aus der Familie Asfarviridae handelt (DIXON et al., 2004). Zur ersten Familie gehören z. B. die Erreger des Lassa-Fiebers (Lassavirus), des argentinischen hämorrhagischen Fiebers (Juninvirus) und des bolivianischen hämorrhagischen Fiebers (Machupovirus) (OLDSTONE, 2002a; OLDSTONE, 2002b; JAY et al., 2005). Vertreter der Familie Bunyaviridae sind u. a. das Hantaanvirus und das Sin- Nombre-Virus sowie das Virus des Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (SIMMONS und RILEY, 2002; LEDNICKY, 2003; TAI et al., 2005). Diese Viren verursachen beim Menschen oftmals schwere fieberhafte Erkrankungen mit hämorrhagischen Symptomen, die in Abhängigkeit vom Virustyp zudem mit schweren renalen und pulmonalen Begleitsymptomen einhergehen können (WHITEHOUSE, 2004). Ein Vertreter des Genus Phlebovirus, das Virus des Rift-Valley-Fiebers, kann beim Menschen in seltenen Fällen ebenfalls zu einem hämorrhagischen Fieber führen (GERDES, 2004). Das Rift-Valley-Fieber- Virus besitzt tiermedizinische Bedeutung, da es neben dem zoonotischen Potential zu schweren Erkrankungen bei Wiederkäuern führt, die mit gastrointestinalen Symptomen, Hepatitiden und seuchenhaften Aborten einhergehen (GERDES, 2004).
Die Familie Flaviviridae beinhaltet in den Genera Flavivirus (NEYTS et al., 1999;
SOLOMON und MALLEWA, 2001) und Pestivirus (BAKER, 1995; GOMEZ- VILLAMANDOS et al., 2003a) Erkrankungen, die mit hämorrhagischen Symptomen einhergehen können. Zu den hämorrhagischen Erkrankungen des Genus Flavivirus gehören das Dengue hämorrhagische Fieber (JOHN, 2003; MALAVIGE et al., 2004) und die schwere Verlaufsform des Gelbfiebers (MONATH, 2001). Im Genus Pestivirus können Infektionen mit dem KSPV und dem BVDV mit Symptomen eines hämorrhagischen Fiebers einhergehen.
Die Erreger der schwersten hämorrhagischen Fieber sind in der Familie Filovirus zu finden (FELDMANN et al., 1996; PETERS und KHAN, 1999; CASILLAS et al., 2003). Die Ebolaviren und das Marburgvirus verursachen schwerste Erkrankungen mit hoher Mortalität (30-80%).
2 Virale hämorrhagische Fieber 20
2.3.2 Pathogenese der viralen hämorrhagischen Fieber
Eine Gemeinsamkeit viraler hämorrhagischer Fieber ist die primäre Replikation des Virus in Monozyten bzw. Makrophagenpopulationen (GOMEZ-VILLAMANDOS et al., 2003a;
BRAY, 2005) und ihre Affinität zu Endothelzellen. Eine Ausnahme bilden die Hantaviren, die primär in Endothelzellen replizieren. Obwohl einige dieser Viren auch einen direkt zellschädigenden Effekt haben, werden die meisten klinischen Erscheinungen durch Reaktionen des Immunsystems und durch Mediatoren der infizierten Makrophagen verursacht (BRAY, 2005). Die Erreger fast aller hämorrhagischer Fieber sind in der Lage, sehr unterschiedliche Zelltypen zu infizieren (GEISBERT und JAHRLING, 2004).
Untersuchungen zur Pathogenese der Ebolavirusinfektion haben gezeigt, dass Interaktionen des Virus mit Makrophagen und dendritischen Zellen eine tragende Rolle bei der Entstehung unterschiedlichster Läsionen spielen (GEISBERT et al., 2003b; GEISBERT et al., 2003c;
GEISBERT et al., 2003d). Die Erreger viraler hämorrhagischer Fieber sind nicht nur in der Lage, das unspezifische Abwehrsystem zu umgehen, sie können sich in Makrophagen, die eigentlich eindringende Pathogene abwehren sollten, vermehren und diese als Transportvehikel zu parenchymatösen Organen nutzen. Die Hemmung der Typ 1 Interferonproduktion spielt dabei eine unterstützende Rolle (BRAY, 2005). Die Infektion aktiviert die sekretorische Aktivität der Makrophagen, die Zytokine und andere Mediatoren ausschütten. Dadurch wird Fieber hervorgerufen und das Gefäßsystem im Sinne einer Endothelzellaktivierung beeinflusst. Das Blutgerinnungssystem wird in einen prokoagulatorischen Zustand versetzt (HENSLEY et al., 2002; GEISBERT und JAHRLING, 2004; HENSLEY und GEISBERT, 2005). Für das Ebolavirus konnte gezeigt werden, dass es zu einer, von den infizierten Makrophagen induzierten, Aktivierung des extrinsischen Weges der Blutgerinnung kommt. Die Überexpression des TFs scheint hier eine Schlüsselrolle zu spielen (GEISBERT et al., 2003c). GEISBERT et al. (2003) sehen zudem Parallelen zwischen Ebolavirusinfektionen und dem septischen Schock (Lymphozytenapoptose, Dysregulation proinflammatorischer Zytokine, Aktivierung der Gerinnungskaskade im Sinne einer disseminierten intravasalen Gerinnung).
Infizierte dendritische Zellen scheinen in ihrer Fähigkeit gestört zu sein, naïve Lymphozyten zu aktivieren. In Kombination mit durch Mediatoren hervorgerufenen Effekten könnte dies zu der massiven Lymphozytenapoptose beitragen, die im Krankheitsverlauf zu verzeichnen ist
2 Literaturübersicht 21
(GEISBERT et al., 2000; GEISBERT et al., 2003b; MAHANTY und BRAY, 2004; BRAY und GEISBERT, 2005).
Im Gegensatz zum KSPV induzieren Filoviren einen direkten zytopathischen Effekt, der sich sowohl in den infizierten Makrophagen und dendritischen Zellen als auch in parenchymatösen Zellen der Leber, der Nebenniere und anderer Organe manifestiert. Der Mechanismus ist noch weitgehend ungeklärt. Die entstehenden nekrotischen Zelltrümmer verstärken die systemische Entzündungsreaktion und die Freisetzung von Zytokinen aus aktivierten Zellen (BRAY und MAHANTY, 2003; HOTCHKISS und KARL, 2003; BRAY, 2005).
Die indirekten Wirkungen der Infektionen mit den angesprochenen Viren wurden besonders anhand der Ebolavirusinfektion erforscht.
Die Replikation der Viren in Makrophagen resultiert in einer Interaktion einzelsträngiger viraler RNA, doppelsträngiger RNA-Intermediate und anderer virus-spezifischer Substanzen mit Typ 1 Transmembranproteinen, Toll-like receptors sowie anderen Mustererkennungs- molekülen des unspezifischen Immunsystems. Dadurch werden NFκB, Interferon regulierende Faktoren bzw. andere Aktivierungspfade angesprochen. Diese Aktivierung führt zur Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren wie IL-1, IL-6, TNF-α und Stickstoffoxid (HOTCHKISS und KARL, 2003; BRAY, 2005).
Dendritische Zellen setzen Chemokine frei, die zusätzliche Monozyten und dendritische Zellen zu den Orten viraler Replikation locken. Damit gelangen weitere empfängliche Zellen an die Orte der Virusreplikation und tragen zur Verbreitung des Virus bei (HENSLEY et al., 2002; MAHANTY et al., 2003; BRAY und GEISBERT, 2005).
Die vaskulären Permeabilitätsstörungen und Koagulopathien wurden in älteren Studien häufig direkten Wirkungen des Virus auf infizierte Endothelzellen zugeschrieben (PETERS und ZAKI, 2002; SCHNITTLER und FELDMANN, 2003). In jüngster Zeit konnte jedoch gezeigt werden, dass eine Virusreplikation in Endothelzellen erst in der Finalphase der Erkrankung nachweisbar wird, wenn Gerinnungsstörungen und Schocksymptomatik bereits ausgeprägt sind. Die auftretenden Vasodilatationen, die erhöhte Gefäßpermeabilität sowie die Expression von Adhäsionsmolekülen im Bereich des Endothels werden daher mit der Wirkung unterschiedlicher Entzündungsmediatoren in Verbindung gebracht (MAHANTY und BRAY, 2004; BRAY, 2005).
2 Virale hämorrhagische Fieber 22
Die systemische Entzündungsreaktion ist eng verknüpft mit der Aktivierung des Gerinnungssystems. Entzündungsmediatoren wie IL-6 können die Synthese des TFs initiieren und somit einen starken Aktivator der Gerinnung einbeziehen (BRAY, 2005).
Fibrinablagerungen konnten ebenfalls nachgewiesen werden (GEISBERT et al., 2003c). Die bedeutsame Beziehung zwischen viraler Infektion, Entzündungsreaktion und Blutgerinnung konnte experimentell belegt werden (GEISBERT et al., 2003a).
Für Infektionen mit Erregern viraler hämorrhagischer Fieber ist eine ausgeprägte Apoptose vorwiegend nicht-infizierter lymphatischer Zellen charakteristisch, die zu einer massiven Immunsuppression führt. Die Apoptoseinduktion scheint in allen Fällen durch Zytokine infizierter monozytärer Zellen herbeigeführt zu werden (MAHANTY und BRAY, 2004;
BRAY, 2005; BRAY und GEISBERT, 2005).
2 Literaturübersicht 23
2.4 Hämostase und Hämostasekomponenten
Im Folgenden werden zum besseren Verständnis der pathologischen Vorgänge bei schweren Virusinfektionen kurz die physiologischen Vorgänge im Rahmen der Blutgerinnung dargestellt. Detailliertere Beschreibungen sind u. a. bei TROY (1988) und DODDS (1988) bzw. in einschlägigen humanmedizinischen Monographien (NAWROTH, 1998;
HARBRECHT, 1998; GAWAZ, 1999) und Übersichtspublikationen zu finden (BLOOM, 1990; BOON, 1993; NARAYANAN und HAMASAKI, 1998; STASSEN et al., 2004; JURK und KEHREL, 2005).
Die Hämostase umfasst die Vorgänge, die im intakten Gefäßsystem die kontinuierliche Strömung des Blutes gewährleisten und im Bedarfsfall, d. h. bei Verletzungen und Störungen dieses Systems, die rasche Blutstillung aktivieren und auf den Ort des Geschehens beschränken (TROY, 1988). Somit laufen unter physiologischen Bedingungen ständige Antikoagulations- und Koagulationsprozesse ab. Die Antikoagulation ist auf die besonderen Eigenschaften des intakten, nicht benetzbaren Endothels, das Nichtaggregieren der inaktiven Thrombozyten und die Inaktivität der als Proenzyme vorliegenden Gerinnungsenzyme gestützt (BARTHELS und VON DEPKA, 2003a). Die Aktivatoren der Blutgerinnung befinden im extravasalen Bereich. Die Blutstillung kann, da die Komponenten nicht synthetisiert, sondern nur aktiviert werden müssen, energiearm und schnell erfolgen. Wichtige Prozesse sind dabei die Kontraktion der Arterienwände, die Aktivierung der Thrombozyten und der Zellen der verletzten Zelloberflächen sowie die Aktivität des fibrinolytischen Systems. Beide Prozesse, d. h., Gerinnungsprozesse und Fibrinolyse müssen auf den Ort des Geschehens beschränkt werden, dafür sorgt u. a. die Inaktivierung der Enzyme durch ihre physiologischen Inhibitoren (LEWIS, 1996; NAWROTH, 1998).
Nach Virchow werden drei Hämostasebereiche unterschieden (Virchow´sche Trias, benannt nach Rudolf Virchow, der diese Bereiche 1856 beschrieb): Thrombozyten (zelluläre Bestandteile), Gefäßsystem (Endothel) und das plasmatische Gerinnungssystem.