Entwicklung einer real-time multiplex multitube RT-PCR zur Differentialdiagnostik der Klassischen Schweinepest

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Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2006

ISBN 3-938026-83-9

Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89

35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net

www.dvg.net

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Institut f¨ur Virologie

der Tier¨arztlichen Hochschule Hannover

Entwicklung einer real-time multiplex multitube RT-PCR zur Differentialdiagnostik

der Klassischen Schweinepest

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterin¨armedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tier¨arztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Andreas Gavrilenko

aus Anapskaja

Hannover 2006

(6)

1. Gutachter: Prof. Dr. V. Moennig 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Schierwater

Tag der m¨undlichen Pr¨ufung: 23.05.2006

(7)

(8)

(9)

1 Einleitung 1

2 Literatur¨ubersicht 3

2.1 Klassische Schweinepest . . . 3

2.1.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest . . . 4

2.1.1.1 Taxonomie . . . 4

2.1.1.2 Morphologie . . . 4

2.1.1.3 Genomorganisation und virale Proteine . . . 4

2.1.2 Klinik und Pathologie . . . 8

2.2 Diagnostik der Klassischen Schweinepest . . . 9

2.2.1 Virus- und Antigennachweis . . . 9

2.2.2 Antik¨orpernachweis . . . 10

2.3 Differentialdiagnostik der KSP . . . 10

2.3.1 Afrikanische Schweinepest . . . 12

2.3.1.1 Das Virus der Afrikanischen Schweinepest . . . 12

2.3.1.1.1 Taxonomie, Morphologie und physikalische Ei- genschaften . . . 12

2.3.1.1.2 Genomorganisation und virale Proteine . . . 12

(10)

2.3.1.3 Diagnostik . . . 14

2.3.2 Aujeszkysche Krankheit . . . 15

2.3.2.1 Suides Herpesvirus Typ 1 . . . 15

2.3.2.1.1 Taxonomie und Morphologie . . . 15

2.3.2.2 Klinik und Pathologie . . . 17

2.3.2.3 Diagnostik . . . 17

2.3.3 Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom . . . 18

2.3.3.1 Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus 18 2.3.3.1.1 Taxonomie und Morphologie . . . 18

2.3.3.3 Diagnostik . . . 20

2.3.4 Porzine Influenza . . . 21

2.3.4.1 Das Influenza-A-Virus . . . 21

2.3.4.3 Diagnostik . . . 23

2.3.5 Porzine Parvovirus - Infektionen . . . 23

2.3.5.1 Das Porzine Parvovirus . . . 23

(11)

2.3.5.3 Diagnostik . . . 26

2.3.6 Porzine Circovirus-Infektionen . . . 27

2.3.6.1 Das Porzine Circovirus . . . 27

2.3.6.3 Diagnostik . . . 30

2.4 Polymerasekettenreaktion . . . 31

2.4.1 Prinzip . . . 31

2.4.2 Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion . . . 32

2.4.3 Real-time PCR . . . 32

2.4.3.1 Prinzip und Techniken . . . 32

2.4.3.2 SYBR^TM-Greenreal-time PCR . . . 33

2.4.3.3 TaqMan real-time PCR . . . 34

2.4.3.4 Primer-probe energy transfer PriProET . . . 35

2.4.3.5 Quantitative real-time PCR . . . 36

2.4.3.5.1 Absolute Quantifizierung . . . 37

2.4.3.5.2 Relative Quantifizierung . . . 37

2.4.4 Design und Optimierung einer PCR . . . 38

2.4.4.1 Auswahl der nachzuweisenden Genomregionen . . . 38

2.4.4.2 Primer- und Sondendesign . . . 38

(12)

2.4.4.4 Optimierungsschritte . . . 40

2.4.5 Multiplex real-time PCR . . . 41

2.4.6 Interne Kontrollen . . . 43

2.5 Prinzipien der Validierung von Diagnosetests . . . 43

2.5.1 Allgemein . . . 43

2.5.2 Validierung von PCR . . . 44

3 Material und Methoden 47 3.1 Material . . . 47

3.1.1 Zelllinien . . . 47

3.1.1.1 PK(15)A . . . 47

3.1.1.2 EFN-R . . . 47

3.1.1.3 MARC-145 . . . 48

3.1.1.4 Rie 255 . . . 48

3.1.2 Untersuchungsmaterial . . . 48

3.1.2.1 Virusisolate und klinische Proben . . . 48

3.1.2.2 Plasmide . . . 51

3.1.2.3 Antik¨orper und weitere Materialien . . . 52

3.1.2.4 Kits zur Nukleins¨aureisolierung . . . 52

3.2 Methoden . . . 52

3.2.1 Klassische virologische Methoden . . . 52

3.2.1.1 Zellkultur . . . 52

3.2.1.1.1 PK(15)A . . . 52

(13)

3.2.1.1.3 MARC-145 . . . 53

3.2.1.2 Virustitration . . . 53

3.2.1.3 Peroxidase-Linked-Assay . . . 53

3.2.1.4 Virusvermehrung . . . 54

3.2.2 Molekularbiologische Methoden . . . 55

3.2.2.1 Nukleins¨aureisolierung . . . 55

3.2.2.1.1 RNA Isolierung aus Zellkultur und Serum . . . . 55

3.2.2.1.2 RNA-Isolierung aus Organmaterial und Blut . . . 55

3.2.2.1.3 DNA-Isolierung aus Zellkultur und Serum . . . . 56

3.2.2.1.4 DNA Isolierung aus Organmaterial und Blut . . . 57

3.2.2.2 Reverse Transkription . . . 58

3.2.2.3 Primer- und Sondendesign . . . 58

3.2.2.3.1 Sequenzsuche und Alignment . . . 58

3.2.2.3.2 Auswahl von Primern und Sonden . . . 59

3.2.2.3.3 Evaluierung von Primern und Sonden . . . 59

3.2.2.4 Polymerasekettenreaktion . . . 61

3.2.2.4.1 Gel-basierte PCR . . . 61

3.2.2.4.2 SYBR^TM-Green real-time PCR . . . 61

3.2.2.4.3 TaqMan real-time PCR . . . 63

3.2.2.4.4 Positive und negative Kontrollen . . . 64

3.2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese . . . 64

3.2.2.6 Reinigung der PCR-Fragmente . . . 65

(14)

3.2.2.8 Kolonie-PCR . . . 67

3.2.2.9 Plasmidpr¨aparation . . . 68

3.2.2.10 Restriktionsenzymverdau . . . 69

3.2.2.11 Dephosphorylierung . . . 69

3.2.2.12 Sequenzierung . . . 70

3.2.2.13 Bestimmung der Kopienzahl der Plasmide . . . 70

4 Ergebnisse 73 4.1 Ergebnisse der Literaturrecherche . . . 73

4.2 Entwicklung der multiplex real-time TaqMan PCRs . . . 78

4.2.1 Ergebnisse der Sequenz-, Primer- und Sondensuche . . . 78

4.2.2 Entwicklung der TaqMan PCRs . . . 84

4.2.2.1 Gelbasierte PCRs . . . 84

4.2.2.2 Sequenzierung der PCR Produkte . . . 84

4.2.2.3 Optimierung . . . 84

4.2.2.3.1 Primertitration . . . 84

4.2.2.3.2 Sondentitration . . . 90

4.2.2.4 Entwicklung interner Kontrollen . . . 90

4.2.2.5 Multiplex real-time PCRs . . . 92

4.3 Validierung . . . 94

4.3.1 Sensitivit¨at . . . 94

4.3.2 Spezifit¨at . . . 95

4.3.3 Klinische Proben . . . 98

(15)

5.1 Gesamtkonzept . . . 105

5.2 Auswahl der Nachweismethode . . . 106

5.3 Literaturrecherche und Auswahl der Erreger . . . 108

5.3.1 Auswahl der Genomregionen . . . 109

5.4 Aufteilung des multitube PCR-Ansatzes . . . 112

5.5 Nukleins¨aureisolierung . . . 113

5.6 Optimierung der PCRs . . . 114

5.6.1 Optimierung der Reaktionsbedingungen . . . 114

5.6.2 Optimierung der Primerkonzentrationen . . . 115

5.6.3 Optimierung der Sondenkonzentrationen . . . 115

5.6.4 Real-time PCR Effizienzen . . . 115

5.7 Auswahl der internen Kontrollen . . . 116

5.8 Auswahl der Isolate und Organproben . . . 117

5.9 Validierung . . . 119

5.9.1 Sensitivit¨at . . . 120

5.9.2 Spezifit¨at . . . 122

5.9.3 Klinische Proben . . . 125

5.10 Schlussfolgerung und Ausblick . . . 128

6 Zusammenfassung 131

7 Summary 133

Literaturverzeichnis 135

(16)

A.1 Verwendete Virusisolate, Organ- und Blutproben, Antik¨orper . . . 177

A.2 Enzyme und kommerzielle Kits . . . 178

A.3 Medien, Puffer, L¨osungen, Antibiotika . . . 180

A.3.1 Zellkulturmedien . . . 180

A.3.2 Puffer und L¨osungen . . . 183

A.4 Sonstige Reagenzien . . . 184

A.5 Primer- und Sondensequenzen . . . 184

A.6 Ger¨ate und Verbrauchsmittel . . . 184

A.6.1 Ger¨ate . . . 184

A.6.2 Verbrauchsmittel . . . 186

A.7 Software . . . 186

A.8 Tabellen und Abbildungen . . . 187

Abbildungsverzeichnis 203

Tabellenverzeichnis 205

(17)

A. bidest. Aqua bidestillata

AK Aujeszkysche Krankheit

AP Alkalische Phosphatase

AS Aminos¨aure

ASP Afrikanische Schweinepest

ASPV Virus der Afrikanischen Schweinepest

ATP Adenosintriphosphat

ATV adjusted versen-trypsin

BD Border Disease

BDV Border Disease-Virus BHV-1 Bovines Herpesvirus Typ 1

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

BVD Bovine Virusdiarrhoe

C Reaktionszyklus (in der real-time PCR)

cDNA komplement¨are DNA

Ct Schwellenwert(cycle threshold) DEPC Diethylpyrocarbonat

DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium DNA Desoxyribonukleins¨aure

dNTPs Desoxynukleosid-Triphosphate dpi Tagepost infectionem

dRn (∆Rn) baseline-korrigierte, normalisierte Fluoreszenz dsDNA doppelstr¨angige DNA

(18)

DTT Dithiothreitol

EAV Virus der infekti¨osen equinen Arteritis E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigs¨aure ELISA

”enzyme-linked immuno sorbent assay“

EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium

EURL EU Referenzlabor (EU Reference Laboratory) FAT fluorescent antibody test

FKS fetales K¨alberserum

G/C Guanin/Cytosin

HA H¨amagglutination

HAE h¨amagglutinierende Einheiten

IK interne Kontrolle

IPTG Isopropyl-thio-galaktosid KID50 kulturinfekti¨ose Dosis50

kb Kilobasen

KSP Klassische Schweinepest

KSPV Virus der Klassischen Schweinepest LDV lactate-dehydrogenase elevating-Virus mAk monoklonaler Antik¨orper

MES 2(N-Morpholino)ethansulfons¨aure

min Minute

M-Protein Membran-Protein

mRNA ”messenger RNA“

N/D nicht durchgef¨uhrt N-Protein Nukleokapsid-Protein NTR nichttranslatierte Region

OD optische Dichte

OIE Office International des ´Epizooties ORF offener Leserahmen (open reading frame)

(19)

PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium

PCR Polymerasekettenreaktion(polymerase chain reaction) PCV-1 Porcines Circovirus Typ 1

PCV-2 Porcines Circovirus Typ 2

PDNS porzines Dermatitis und Nephropathie Syndrom PFU Plaque-bildende Einheiten(plaque forming units) p.i. post infectionem, nach Infektion

PK porcine kidney

PMWS postweaning multisystemic wasting syndrome PPV Porzines Parvovirus

PRDC porcine respiratory disease complex

PRRS Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom PRRSV Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom Virus PRRSV-EU PRRSV europ¨aische St¨amme

PRRSV-NA PRRSV nordamerikanische St¨amme

R native Fluoreszenz

R² Bestimmheitsmaß, Pearson Correlation Coefficient Rn Fluoreszenz abgeglichen mit einem Referenzfarbstoff RNA Ribonukleins¨aure

RT Reverse Transkriptase, reverse Transkription

sec Sekunde

SHV-1 Suides Herpesvirus Typ 1

SMEDI stillbirth, mummification, embryonic death, infertility SPF spezifisch pathogenfrei

TCID zellkulturinfekti¨ose Dosis(tissue culture infectious dose)

TBE Tris-Borat-EDTA

TiHo Tier¨arztliche Hochschule

Tm Schmelztemperatur

TRIS Tris-Hydroxymethylaminomethan

U Einheit (unit)

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WWW World Wide Web (Internet)

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Die Klassische Schweinepest (KSP) wird durch ein behülltes RNA-Virus aus dem Genus Pestivirus der FamilieFlaviviridae verursacht und gehört weltweit zu den wichtigsten viralen Erkrankungen der Schweine. Die KSP ist eine anzeigepflichtige Seuche. Ausbrüche der KSP haben in den letzten Jahrzehnten enorme wirtschaftliche Verluste in Europa verursacht.

Das klinische Bild einer KSPV-Infektion ist sehr variabel und häufig unspezifisch. Daher kommen viele andere Erkrankungen viraler, bakterieller und nicht-infektiöser Genese differentialdiagnostisch in Frage. Zu den viralen Differentialdiagnosen gehören Afrikanische Schweinepest (ASP), porzine Circovirusinfektionen, porzine Parvovirose, porzine Influ- enza, Infektionen mit dem porzinen respiratorischen und reproduktiven Syndrom Virus (PRRSV) und Aujeszkysche Krankheit.

Die Vielzahl möglicher Differentialdiagnosen macht die Diagnose aufgrund des klinischen Bildes nahezu unmöglich. Daher ist sowohl für die Überwachung der Schweinepopulation als auch zur Detektion eines KSP-Ausbruchs eine moderne und effiziente Labordiagno- stik von herausragender Bedeutung. Zu den schnellsten und empfindlichsten Methoden des Virusgenomnachweises gehört die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die technischen Entwicklungen der letzten Jahre machten es möglich, verschiedene Erreger in einer so genannten

”multiplex“ PCR nachzuweisen und durch die Nutzung fluoreszierender Sonden

”real-time“ schnell und effizient sichtbar zu machen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es eine moderne und schnelle Nachweismethode differentialdiagnostisch relevanter viraler Erreger auf der Grundlage dieser Technik zu entwickeln.

1

(22)

(23)

2.1 Klassische Schweinepest

Die KSP ist eine der wichtigsten Tierseuchen weltweit und ist in die Liste der Erkrankun- gen eingruppiert, die bei der OIE und der EU anzeigepflichtig sind (Anonym, 2005a).

Auf nationaler Ebene besteht in Deutschland ebenfalls Anzeigepflicht. Das Virus der Klas- sischen Schweinepest (KSPV) ist weltweit verbreitet, konnte jedoch in einigen Ländern erfolgreich getilgt werden. So sind z. B. Australien, Neuseeland und die USA KSPV frei (van Oirschot, 1999a; Edwards, 2000). Aktuelle Informationen zum Seuchenstatus und -geschehen können dem OIE Handistatus II¹ entnommen werden. Die erste offizielle Feststellung der KSP wurde wahrscheinlich in Ohio, USA, im Jahre 1833 gemacht, wie aus einem Bericht des Bureau of Animal Industry (United States Department of Agri- culture) aus dem Jahre 1887 hervorgeht (Liess, 1981). Der genaue Ursprung der Seuche ist unbekannt (van Oirschot, 1999b). Die Erregercharakterisierung als filtrierbares Vi- rus erfolgte durch de Schweinitz und Dorset (1904). Natürliche Wirte des KSPV sind ausschließlich Haus- und Wildschweine (Liess, 1981;Laddomada, 2000), es wurde allerdings auch von subklinischen Infektionen bei anderen Tieren wie Kälbern, Ziegen, Schafen, Hirschen und Pekaris berichtet (Loan und Storm, 1968).

1http://www.oie.int/hs2/report.asp

3

(24)

2.1.1 Das Virus der Klassischen Schweinepest

2.1.1.1 Taxonomie

Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) gehört zum GenusPestivirus(Horzinek, 1973; Westaway et al., 1985) in der Familie Flaviviridae (Wengler, 1991; Pringle, 1999). Zu diesem Genus gehören darüber hinaus die eng antigenverwandten Viren der Bo- vinen Virusdiarrhoe (BVDV) und der Border Disease (BDV) der Schafe (Darbyshire, 1960; Horzinek et al., 1967; Enzmann und Rehberg, 1977; Ridpath und Bolin, 1997). Die Familie Flaviviridae umfasst neben dem Genus Pestivirus die Genera Flavi- virus und Hepacivirus (Rice et al., 1985). Letzterem gehört ausschließlich das humane Hepatitis-C-Virus an (Bartenschlager und Lohmann, 2000). Angehörige des Genus Flavivirus sind u. a. das Gelbfiebervirus und das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus des Menschen, das Louping-Ill-Virus, das Wesselsbron-Disease-Virus der Schafe sowie das Meningoenzephalitis-Virus der Pute (Wengler et al., 1995).

2.1.1.2 Morphologie

Das Virus der KSP ist ein behülltes RNA-Virus von sphärischer Gestalt und misst im Durchmesser zwischen 40 und 60 nm. Drei strukturelle Glykoproteine erscheinen als un- regelmäßig gestaltete Projektionen an der Oberfläche (s. Abbildung 2.1) (Horzineket al., 1967;Moormannund Hulst, 1988;Meyerset al., 1989; MoennigundPlagemann, 1992).

2.1.1.3 Genomorganisation und virale Proteine

Das Genom der Pestiviren, dessen Länge ca. 12,5 Kilobasen beträgt, liegt als ein ein- zelsträngiges, lineares RNA-Molekül in der Plusstrangorientierung vor (Moormann und Hulst, 1988). Dabei kodiert ein einzelner offener Leserahmen (ORF -open reading frame) für ein Polyprotein mit einer Länge von etwa 3900 Aminosäuren (Collett et al., 1988;

Meyerset al., 1989; R¨umenapf et al., 1993). Das Polyprotein wird co- und posttrans- lationell in vier Struktur- und sieben Nichtstrukturproteine prozessiert (Elbers et al., 1996; Meyers und Thiel, 1996). Das Genom wird am 3^′- und 5^′-Ende von nichttrans-

(25)

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Virus der Klassischen Schweinepest.

latierten Regionen (NTR) flankiert (Moormann und Hulst, 1988; Rümenapf et al., 1989; Moormann et al., 1990; Deng und Brock, 1992) (s. Abbildung 2.2). Die Länge der 5^′NTR beträgt bei Pestiviren 372 bis 385 Basen (Becheret al., 1998), die der 3^′NTR etwa 200 Basen. Die beiden NTRs sind unter den Pestiviren hoch konserviert (Meyers et al., 1989; Moormann et al., 1990; Hofmann et al., 1994; Becher et al., 1995;

Vilˇcek et al., 1997). So betr¨agt die Identit¨at im 5^′NTR-Bereich zwischen BDV-Isolaten und KSPV-Isolaten bis zu 80 %, zwischen BDV-Isolaten und BVDV-1-Isolaten bis 65 % (Vilˇcek et al., 1997).

Durch Sequenzvergleiche bestimmter Genomabschnitte l¨asst sich das Virus der klassischen Schweinepest unter Einbeziehung geographischer und epidemiologischer Daten in

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des Pestivirusgenoms. Modifiziert nach Meyers undThiel (1996)

(26)

verschiedene genetische Gruppen einteilen (s. Abbildung 2.3) (Lowings et al., 1996;

Greiser-Wilke et al., 1998; Paton et al., 2000b). Basierend auf der Einteilung von Lowings et al. (1996), wurden drei Gruppen mit jeweils drei bzw. vier Untergruppen gebildet (Patonet al., 2000b). Die Gruppe 1 mit den Untergruppen 1.1 bis 1.3 beinhaltet Isolate aus den 40–60er Jahren, Isolate aus der Ukraine, Kroatien, Mexiko, Thailand und China aus den 90er Jahren des vergangenen Jahrhunderts, sowie ein Isolat aus dem Jahr 2004 aus Kolumbien. Die Gruppe 2 mit den Untergruppen 2.1 bis 2.3 beinhaltet westeurop¨aische Isolate aus den 1980er und 1990er Jahren, sowie asiatische Isolate aus den Jahren 1980–2004. Die Gruppe 3 mit den Untergruppen 3.1 bis 3.4 enth¨alt ein Iso- lat aus Großbritannien, sowie Isolate aus Thailand, Japan, Korea und Taiwan aus den 1970–1990er Jahre (Lowings et al., 1996;Paton et al., 2000b; Greiser-Wilke et al., 2005).

(27)

lassischeSchweinepest7

Abbildung 2.3: Genetische Diversit¨at der KSPV-Isolate. Die Einteilung basiert auf den Sequenzen des E2-gp Gens.Patonet al.

(2000a), vervollst¨andigt vonGreiser-Wilke et al.

(28)

2.1.2 Klinik und Pathologie

Die Erscheinungsformen der KSP sind sehr unterschiedlich, wobei das Alter der Tiere, die Virusdosis und die Virulenz des Virusstammes sowie Wirtsfaktoren eine Rolle spie- len (Dahleund Liess, 1995; van Oirschot, 1999b). Es können akute, chronische und pränatale Verlaufsformen unterschieden werden (van Oirschot et al., 1988; Depner et al., 1997a;Moennig et al., 2003). Junge Tiere zeigen häufig die akute Form der KSP, die mit hohem Fieber, Anorexie, Konjunktivitis, vergrößerten Lymphknoten, Diarrhoe und Verstopfung einhergeht. In der Finalphase der Erkrankung kommt es zu petechia- len und ekchymatösen Blutungen der Haut im Bereich der Ohren, des Schwanzes, am Bauch und an den Extremitäten (Depner et al., 1997a; Moennig et al., 1993, 2003).

Die Tiere verenden nach acht bis zwanzig Tagen. Die Mortalität liegt zwischen 20 und 80 %. Die korrespondierenden pathologisch-anatomischen Befunde umfassen stark ver- größerte Lymphknoten im gesamten Organismus, petechiale und ekchymatöse Blutungen v. a. in den Nieren, der äußeren Haut, der Magen-, Blasen- und Gallenblasenwand sowie Milzrandinfarkte (Trautwein, 1988). Des Weiteren treten durch Sekundärinfektionen hervorgerufene Veränderungen des Respirationstraktes und eine nichteitrige Enzephalitis auf (Gruber et al., 1995).

Die chronische Form der KSP endet immer tödlich. Die anfänglichen Symptome sind denen der akuten Form ähnlich. Im weiteren Verlauf werden die Anzeichen immer un- spezifischer. Die betroffenen Tiere zeigen intermittierendes Fieber, chronische Enteritiden und Kümmern (Moennig et al., 2003). Im pathologisch-anatomischen Bild zeigen chronisch erkrankte Schweine weniger ausgeprägte Befunde. Hämorrhagien und Infarkte fehlen häufig. Zu den typischen Befunden gehören eine Depletion der lymphatischen Organe sowie nekrotische und ulzerative Veränderungen der Darmwand, so genannte

”Boutons“

(van Oirschot, 1999b). Außerdem ist eine Hyperplasie der Nebennierenrinde charakteristisch (Cheville und Mengeling, 1969; van der Molen und van Oirschot, 1981). Bei tragenden Sauen, die häufig selbst keine Krankheitszeichen zeigen, ruft die KSPV-Infektion eine Reihe fetaler Veränderungen hervor. Aborte, Totgeburten oder Miß- bildungen können auftreten (Meyer et al., 1980). Persistent infizierte neugeborene Fer- kel zeigen häufig keine Symptome, scheiden jedoch ihr Leben lang das Virus aus (van Oirschot und Terpstra, 1977) und sterben letztendlich nach bis zu elf Monaten an

(29)

der so genannten

”late-onset“ Form der KSP (Meyeret al., 1981). Das Auftreten und die Auspr¨agung der klinischen Symptome, vor allem bei der akuten Verlaufsform, sind ¨außerst variabel, so dass man keines der Krankheitssymptome als pathognomonisch bezeichnen kann.

2.2 Diagnostik der Klassischen Schweinepest

Die klinische Diagnostik ist v. a. bei älteren Tieren und in Zusammenhang mit moderat oder schwach virulenten KSPV-Stämmen schwierig, daher ist eine rasche und zuverlässige labordiagnostische Bestätigung außerordentlich wichtig (Paton und Greiser-Wilke, 2003). Für die labordiagnostische Untersuchung stehen sowohl Methoden zum Virus- und Antigennachweis als auch serologische Nachweismethoden zur Verfügung. Die Methoden sind auf Ebene der EU in der Richtlinie 2002/106/EC² und dem angehängten technischen Teil weitestgehend verbindlich festgelegt. Auf weltweiter Ebene beinhaltet das Manual of Diagnostic Tests und Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees) (im Weiteren Manual of Diagnostic Tests) des OIE in Kapitel 2.1.13 eine Auflistung und genaue Erläuterung der Methoden³.

2.2.1 Virus- und Antigennachweis

Der Goldstandard des Virusnachweises ist nach wie vor die Virusisolierung aus Leukozyten oder Organsuspensionen auf KSPV-permissiven Zellen (Moennig, 2000). Da das Virus keinen zytopathischen Effekt induziert, erfolgt der Nachweis mit spezifischen Antikörpern (Moennig, 2000), wobei die Abgrenzung zu anderen Pestiviren mit monoklonalen An- tikörpern vorgenommen werden kann (Cay et al., 1989; Edwards et al., 1991). Ein schneller Test ist der Nachweis viralen Antigens in Organschnitten mittels fluoreszierender Antikörper (fluorescent antibody test, FAT) (Solorzanoet al., 1966;Turneret al., 1968;Boumaet al., 2001;Anonym, 2004a;Teifkeet al., 2005). Der FAT ist weniger sensitiv und bedarf geschulten und erfahrenen Personals (Moennig, 2000). In ähnlicher Wei- se kann der Nachweis auch mittels Immunperoxidasefärung erfolgen (Anonym, 2004a).

2http://europa.eu.int/eur-lex/pri/en/oj/dat/2002/l_039/l_03920020209en00710088.pdf

3http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00036.htm

(30)

Für Screeningtests großer Probenzahlen wird häufig ein Antigen-ELISA verwendet, der jedoch im Vergleich zur Virusisolierung weniger sensitiv ist und in der Inkubationszeit, bei chronisch erkrankten Tieren und bei niedrigen Virustitern zu falsch negativen Ergebnissen führen kann (Kaden et al., 1999). Der Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR ist eine schnelle und sensitive Nachweismöglichkeit, die in den letzten Jahren an Bedeutung ge- wonnen hat (Patonet al., 2000a;Moennig, 2000; Patonund Greiser-Wilke, 2003).

In den vergangenen Jahren wurden viele verschiedene PCR-Ansätze entwickelt und teil- weise für die Diagnostik validiert (Sandvik et al., 1997;de A. Diaz et al., 1998;Thür undHofmann, 1998; McGoldricket al., 1998, 1999;Patonet al., 2000a;Hofmann, 2003; Risatti et al., 2003; Handel et al., 2004; van Rijn et al., 2004; Gaede et al., 2005;Hoffmann et al., 2005;Risatti et al., 2005;Ophuis et al., 2006).

2.2.2 Antik¨ orpernachweis

Der Virusneutralisationstest (VNT) gilt als sensitivster und spezifischster Test zur Detek- tion von Antikörpern gegen das KSPV. Da kreuzreagierende Antikörper gegen ruminante Pestiviren Probleme in der Diagnostik bereiten können, werden i. d. R. differentialdiag- nostische VNTs parallel durchgeführt (Moennig, 2000). Eine schnelle, jedoch weniger sensitive Methode ist der Antikörper-ELISA, der für ”screening“-Tests eingesetzt werden kann (Moennig, 2000).

2.3 Differentialdiagnostik der KSP

Aufgrund des vielfältigen und unspezifischen klinischen und pathologischen Bildes kommen mehrere Erkrankungen viraler, bakterieller und nichtinfektiöser Genese als Differen- tialdiagnosen der KSP in Betracht und müssen im Verdachtsfall labordiagnostisch ausge- schlossen werden.

Zu den Differentialdiagnosen geh¨ort die akute Form der ASP (Kleiboeker, 2002), die anhand der klinischen und pathologischen Erscheinungen nicht von der KSP zu unterscheiden ist. Außerdem kommen Rotlauf, PRRSV-Infektionen, Cumarin-Vergiftungen,Purpura haemorrhagica, das

”Postweaning Multisystemic Wasting“ Syndrom (PMWS), das por-

(31)

zine Dermatitis und Nephropathie Syndrom (PDNS), Infektionen mit Salmonellen oder Pasteurellen sowie jede fieberhafte Erkrankung des Respirations- oder Gastrointestinal- traktes, die nicht auf Antibiotika reagiert, differentialdiagnostisch in Frage (Anonym, 2004a;Moenniget al., 2003). So können beispielsweise SHV-1-, porzine Parvovirus- sowie Influenza-A Infektionen ähnliche Symptome wie KSP hervorrufen. Desweiteren können auch Salmonellen, Leptospiren, andere Erreger viraler Meningoenzephalitiden und Stre- potkokken einen ähnlichen Symptomkomplex auslösen (Anonym, 2004a).

Natürlich vorkommende Infektionen von Schweinen mit ruminanten Pestiviren (BVDV, BDV) zeigen eine weltweite Verbreitung (Liess und Moennig, 1990). In Deutschland traten u. a. BDV-Infektionen bei Schweinen aus gemischten Beständen auf, die zu schwer- wiegenden Problemen in der serologischen Diagnostik führten (Oguzoglu et al., 2001).

Bei Schweinen stellen Infektionen mit ruminanten Pestiviren generell weniger ein Krank- heitsproblem, als ein diagnostisches Problem bei der serologischen Abrenzung zu Infek- tionen mit dem KSPV dar (PatonundDone, 1994). In Einzelfällen können Infektionen mit BVDV und BDV auch bei Schweinen zu Fruchtbarkeitsstörungen (Snowdon und French, 1968) und klinischen Erkrankungen führen, die der chronischen bzw.

”late- onset“ Form der KSP ¨ahneln (Terpstra und Wensvoort, 1988; Patonet al., 1994).

Ein Virusnachweis ist selten m¨oglich (Patonet al., 1994).

(32)

2.3.1 Afrikanische Schweinepest

Die ASP wurde erstmals 1921 in Ost-Afrika beschrieben (Montgomery, 1921). Das Vi- rus der ASP (ASPV) ist das einzige bisher bekannte DNAArbovirus (Arthropod-borne) (Brownet al., 1986;Dixonet al., 1995). Das Virus infiziert Vertreter der FamilieSuidae, zu der unter anderem das Hausschwein, das Wildschwein sowie Warzen- und Buschschwei- ne gehören. Zusätzlich kann sich das Virus in seinem Vektor, den Zecken des GenusOrni- thodoros vermehren (Plowright et al., 1974). Die ASP wurde in den meisten Ländern südlich der Sahara sowie West- und Nordafrikanischen Staaten beobachtet. In Europa ist die Krankheit nach Seuchenausbrüchen in den 60er bis 80er Jahren des vergangenen Jahr- hunderts getilgt (mit Ausnahme von Sardinien) (Commission Decision2005/363/EC)⁴. Die ASP gehört ebenfalls zu den Erkrankungen, die sowohl national als auch international anzeigepflichtig sind (Anonym, 2005a).

2.3.1.1 Das Virus der Afrikanischen Schweinepest

2.3.1.1.1 Taxonomie, Morphologie und physikalische Eigenschaften

Das ASPV ist der einzige Vertreter des Genus Asfivirus in der Familie Asfarviridae (Dixon et al., 2000). Die Viruspartikel des ASPV sind ca. 200 nm groß, behüllt und haben einen ikosaedrischen Aufbau (s. Abbildung 2.4) (Modrow et al., 2003). Anhand der Restriktionsenzymanalyse der Virus-DNA können fünf ASPV-Gruppen unterschieden werden, wobei nur die afrikanischen Stämme eine ausgeprägte Diversität zeigen (Murphy et al., 1999).

2.3.1.1.2 Genomorganisation und virale Proteine

Das ASP-Virus enthält eine doppelsträngige DNA mit einer Länge von ca. 170–190 kBp.

Die DNA besitzt kovalent geschlossene Enden mit inversen terminalen Wiederholungen und Haarnadelschleifen (Murphyet al., 1999). Das Genom kodiert für über 200 Proteine, die noch unzureichend charakterisiert sind (Kleiboeker et al., 1998; Modrow et al., 2003). Das Hauptkapsidprotein VP72 des ASPV liegt mit einer Übereinstimmung der

4http://europa.eu.int/eur-lex/lex/LexUriServ/site/en/oj/2005/l_118/l_11820050505en00370038.pdf

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Abbildung 2.4: Schematische Darstellung des ASP-Virus. (Nach Modrowet al. (2003)

Aminosäurensequenzen zwischen ASPV-Stämmen aus allen Teilen der Welt von 97,8 % bis 100 % hochkonserviert vor und ist antigenetisch stabil. Es eignet sich daher als molekulare Basis für serologische und molekularbiologische Testmethoden (Yu et al., 1996).

2.3.1.2 Klinik und Pathologie

Die Virus¨ubertragung erfolgt durch infizierte Zecken bzw. zwischen Hausschweinen sowohl vertikal als auch horizontal (Mebus, 1988; Kleiboeker et al., 1998; Moennig et al., 2003). Der Krankheitsverlauf kann je nach Virulenz des Erregers von perakut bis subklinisch variieren, wobei es einen Zusammenhang zwischen klinischer Auspr¨agung der Symptome und der Adaptation des Virusstammes an das Hausschwein gibt (Moennig et al., 2003). Die akute Form ist durch hohes Fieber (40,5–42^◦C), Leukopenie, Thrombo-

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zytopenie, Hyperämie und petechiale Blutungen im Bereich der Ohren, des Schwanzes, an den Extremitäten sowie am Bauch gekennzeichnet. Gastrointestinale Störungen, Aborte und respiratorische Symptome treten auf (Mebus, 1988; Anonym, 2005c). Der Tod tritt nach 4–8 Tagen ein, die Mortalität erreicht dabei fast 100 %. Bei der Sektion fallen ver- größerte, hämorrhagische Lymphknoten, Splenomegalie und petechiale Blutungen in den Nieren, der Harnblase und dem Larynx auf. Die subakute Form ist durch weniger dramati- sche Symptome charakterisiert. Die Mortalität beträgt 30–70 %. Die chronische Form wird von Gewichtsverlusten, undulierendem Fieber, respiratorischen Symptomen, Arthritiden sowie Veränderungen der Haut begleitet. Die Mortalität ist dabei gering (Mebus, 1988;

Anonym, 2005c).

2.3.1.3 Diagnostik

Da ASP klinisch und pathologisch nicht von der KSP zu unterscheiden ist, kommen für beide Erkrankungen gleiche Differentialdiagnosen in Frage (s. Kapitel 2.3). Zur Abgren- zung und Bestätigung ist daher eine Labordiagnose notwendig. Es existieren Methoden zum Nachweis des infektiösen Virus, viralen Antigens, viraler DNA und spezifischer An- tikörper. Die empfohlenen Methoden sind im Manual of Diagnostic Tests und Vaccines for Terrestrial Animals der OIE in Kapitel 2.1.12⁵ festgehalten. Die zellkulturelle Isolie- rung kann auf primären porzinen Monozytenkulturen oder Knochenmarkszellen erfolgen, wobei die Isolierung durch einen Hämadsorptionstest erweitert wird (Malmquist und HAY, 1960; Moennig et al., 2003). Eine immer größere Rolle spielt in der Diagnostik der Nachweis der viralen Nukleinsäure mittels PCR (Steiger et al., 1992; Gonzague et al., 2002;Agüeroet al., 2003; Kinget al., 2003;Bastos et al., 2003;Agüeroet al., 2004; Basto et al., 2005; Hjertner et al., 2005; Zsak et al., 2005). Ein Antigennach- weis ist sowohl mittels FAT als auch in Antigen-ELISAs möglich (Moenniget al., 2003;

Pastoret al., 1990). Der serologische Nachweis kann im Antik¨orper-ELISA (Wardley et al., 1979) oder mittels eines indirekten Immunfluoreszenztests (Moennig et al., 2003) erfolgen.

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2.3.2 Aujeszkysche Krankheit

Die Aujeszkysche Krankheit (AK) wurde erstmals 1902 von dem ungarischen Tierarzt Aujeszky beschrieben (Aujeszky, 1902). Die Erkrankung kann fast alle Säugetiere be- treffen, verläuft jedoch bei den verschiedenen Spezies unterschiedlich. Das Schwein gilt als Primärwirt und Reservoir des Virus (Murphy et al., 1999; Teuffert et al., 2005).

Die AK ist weltweit verbreitet und gehört zu den wirtschaftlich bedeutsamsten Virus- infektionen. Sie spielt noch immer eine wichtige Rolle in den osteuropäischen Ländern, Deutschland dagegen gilt seit 2003 als AK frei. Der letzte Ausbruch wurde in Deutschland im Jahre 2000 verzeichnet (Teuffert et al., 2005). Wie KSP und ASP befindet sich die AK auf der Liste der Erkrankungen, die bei der OIE anzeigepflichtig sind. Dem Handi- status der OIE⁶ zufolge (Stand am 13.01.2006) trat die AK im Jahr 2004 in mehreren Ländern der EU auf.

2.3.2.1 Suides Herpesvirus Typ 1

2.3.2.1.1 Taxonomie und Morphologie

Der Erreger der AK, das Suide Herpesvirus Typ 1 (SHV-1), gehört dem GenusVaricellovi- rus der Subfamilieα-Herpesvirinae in der FamilieHerpesviridaean (Kluppet al., 2004b), zu dem auch das Bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV-1) und die Equinen Herpesviren Typ 1 und 4 gehören. Die Virionengröße des SHV-1 beträgt 150–170 nm. Im zentralen Kern, wel- cher von einem ikosaedrischen Kapsid umgeben wird, befindet sich ein ca. 150 kbp langes, doppelsträngiges DNA (dsDNA) Molekül. Zwischen dem Kapsid und der glykoprotein- haltigen Lipidmembran befindet sich das aus mindestens 15 Proteinen zusammengesetzte Tegument (Klupp et al., 2004b).

Das lineare dsDNA-Genom des SHV-1 kann in ein langes und ein kurzes Segment ge- gliedert werden, wobei jedes dieser Segmente eine als

”Unique Long“- (UL) bzw.

”Unique Short“(US)- Region bezeichnete, Sequenzfolge besitzt. Diese Regionen werden, wie die des

6http://www.oie.int/hs2/sit_mald_cont.asp?c_mald=21&c_cont=6&annee=2004

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Abbildung 2.5:Schematische Darstellung eines Herpesvirus. NachModrowet al. (2003)

Herpes-Simplex-Virus des Menschen, von invertierten Einheiten wiederholter Sequenzen flankiert (Ben-Poratet al., 1983; DavisonundWilkie, 1983;Klupp et al., 2004a,b).

Es beinhaltet eine Vielzahl von open reading frames (ORF, offener Leserahmen) und kodiert f¨ur eine große, bisher noch nicht genau bestimmte Anzahl an Proteinen (Klupp et al., 2004b). F¨ur das SHV-1 wurden bisher 12 Glykoproteine identifiziert, die mit gB bis gN bezeichnet sind (Modrow et al., 2003). Der hohe C/G-Gehalt erschwert eine Sequenzierung des SHV-1-Genoms, dennoch liegt eine komplette Sequenz des SHV-1 vor (Klupp et al., 2004a).

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Das SHV-1 hat ein breites Wirtsspektrum, das Schweine, Rinder, kleine Wiederkäuer, Fleischfresser, Kaninchen und Nager umfasst. Der Krankheitsverlauf ist beim Schwein altersabhängig. Die Virusübertragung findet aerogen statt. Die Saugferkel erkranken akut bis perakut. Sie zeigen typische zentralnervöse Störungen mit Opisthotonus, Ataxien und Krämpfen. Die Mortalität ist mit bis zu 100 % sehr hoch. Mit fortschreitendem Alter der Tiere mildert sich der Krankheitsverlauf. Es kommt jedoch auch hier zu zentralnervösen Störungen und Fieber. Sekundäre Infektionen können das Krankheitsbild zusätzlich er- schweren. Ältere Schweine zeigen meistens einen subklinischen Krankheitsverlauf. Es kommen Fieber und respiratorische Symptome vor. Bei tragenden Sauen ruft die Infektion mit SHV-1 Aborte, Mumifikationen oder Resorption der Früchte hervor (Shope, 1931a;

Fraserund Ramachandran, 1969; McCrackenet al., 1973; Schmidt et al., 1987).

In pathologisch-anatomischen Untersuchungen treten häufig leicht gestaute Lymphknoten mit kleinen Blutungen auf. Petechien in den Nieren werden ebenfalls beobachtet (Frey, 2003). Zu den regelmäßig auftretenden Befunden gehören auch entzündliche Verände- rungen des oberen Respirationstraktes und ein Lungenödem. Eine Panenzephalitis ist vor allem mikroskopisch nachweisbar. Insgesamt auffällig ist, dass die makroskopischen Veränderungen auch bei jungen Tieren nicht sehr ausgeprägt sind (Gustafson, 1970;

Murphy et al., 1999).

2.3.2.3 Diagnostik

Zur Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit stehen sowohl direkte, als auch indirekte Nachweismethoden zur Verfügung. Auch für die AK gibt es von der OIE empfohlene Me- thoden, die imManual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Kapitel 2.2.2⁷, schriftlich niedergelegt sind. Die klassische Methode des Virusnachweises stellt die Virusisolierung dar. Das SHV-1 lässt sich in einer Vielzahl von Zellkulturen unter Aus- bildung eines deutlichen zytopathischen Effektes anzüchten (Gustafson, 1970). Das Vi- rusantigen lässt sich außerdem mittels Immunfluoreszenztechniken (Gustafson, 1970), Immunperoxidasetechniken oder PCR nachweisen (Echeverria et al., 2000; Krumb-

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holzet al., 2003; van Rijnet al., 2004; Cao et al., 2005b; Huang et al., 2005; Yoon et al., 2005). Als indirekte Methode bieten sich ELISA und Virusneutralisationstests an (Frey, 2003). Besonders bei der serologischen Unterscheidung zwischen geimpften und infizierten Tieren wird ein ELISA eingesetzt (van Oirschot et al., 1988;Lange et al., 2003).

2.3.3 Porzines reproduktives und respiratorisches Syndrom

Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom (PRRS) ist eine der zur Zeit weltweit bedeutendsten Schweinekrankheiten. Es verursacht in Zucht- und Mastbetrieben hohe wirtschaftliche Sch¨aden (Terpstra et al., 1991; Prieto und Castro, 2005). Der Erreger des PRRS, das PRRS Virus (PRRSV), wurde erstmals 1990 in den Niederlanden und kurz danach in den USA entdeckt (Wensvoortet al., 1991; Collins et al., 1992).

2.3.3.1 Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus

Das PRRSV wird zusammen mit dem Virus der infektiösen equinen Arteritis (EAV), demlactate-dehydrogenase elevating-Virus (LDV) der Mäuse und demsimian hemorrha- gic fever-Virus (SHFV) in die Familie Arteriviridae, Ordnung Nidovirales eingruppiert (Meulenberg et al., 1993b; Cavanagh, 1997). Das PRRSV ist behüllt, besitzt einen Durchmesser von 50-65 nm und enthält ein 25-35 nm großes Nukleokapsid (Benfield et al., 1992;Wensvoort et al., 1992;Dea et al., 1995).

Das PRRSV-Genom besteht aus einem ca. 15,1 kB langen, linearen, einzelsträngigen, po- lyadenylierten RNA-Molekül. Die RNA kodiert für acht ORFs. Von den ORFs la und lb werden Replikations- und Transkriptionsproteine kodiert. Die ORFs zwei bis sieben kodieren für die Strukturproteine (Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a;

Murtaugh et al., 1995). Man unterscheidet zwischen europ¨aischen (PRRSV-EU) und nordamerikanischen PRRSV-Isolaten (PRRSV-NA). Diese rufen im Allgemeinen ¨ahnliche

(39)

Abbildung 2.6:Schematische Darstellung des PRRS-Virus. NachModrowet al. (2003)

Symptome hervor, unterscheiden sich jedoch sowohl in antigenetischen und genetischen Eigenschaften als auch in der Virulenz (Prietound Castro, 2005). Die Sequenzanalyse des ORFs fünf, der für das Strukturglykoprotein GP5 kodiert, ergab eine ca. 55 %ige Se- quenzhomologie zwischen europäischen und amerikanischen Stämmen (Murtaughet al., 1995). Dies führte zu Unterteilung des PRRSV in zwei verschiedene Genotypen – eu- ropäische und amerikanische. Die Genomhomologie innerhalb europäischer Stämme liegt nach unterschiedlichen Angaben zwischen 2–90 % (Murtaugh et al., 1995; Stadejek et al., 2002), innerhalb amerikanischer bei ca. 90 % (Andreyev et al., 1997; Meng, 2000; Dee et al., 2001;Forsberg et al., 2002).

Die klinischen Erscheinungen des PRRS sind sehr variabel und abhängig von dem Al- ter und der Nutzungsrichtung der Tiere. Typischerweise sind es bei Absatzferkeln und Läufern Fieber, Dyspnoe, Lethargie, Anorexie und Konjunktivitis. In einigen Fällen tre-

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ten Zyanosen an den Ohren und Extremit¨aten auf. Mastschweine zeigen ebenfalls Fieber und Pneumonie, mit fortschreitendem Alter der Tiere treten ¨ofter subklinische Infektio- nen mit dem PRRSV auf (Benfield et al., 1999; Done et al., 1996; Rossow, 1998;

Anonym, 2004a). Bei tragenden Sauen, die milde Allgemeinsymptome zeigen können, kann das PRRSV die Plazenta überwinden und zu einer intrauterinen Infektion der Ferkel führen. Frühgeburten, lebensschwache Ferkel und hohe Ferkelverluste sind kennzeichnend für diesen Verlauf der Erkrankung (Yoonet al., 1993;Rossowet al., 1994;Mengeling et al., 1995, 1996a; Willset al., 1997; Prietound Castro, 2005).

2.3.3.3 Diagnostik

Der Nachweis des PRRSV mittels Virusisolierung in permissiven Zellkulturen ist zwischen dem ersten und zehnten Tag nach der Infektion (p.i. - post infectionem) m¨oglich, sp¨ater sinkt die Erfolgsquote rapide (Christopher-Hennings et al., 1995, 1998, 2001;

Mengeling et al., 1996b; Prieto et al., 2003). Die Anzucht in Zellkultur ist allerdings problematisch, da viele PRRSV-Stämme nicht in permanenten Zelllinien, sondern nur in porzinen alveolaren Makrophagen (PAM) wachsen (Zhang et al., 1999). Oft ist der Antikörpernachweis eine Alternative, jedoch kommt es zu einem schnellen Titerabfall (Lageret al., 1997). Außerdem können die Antikörper gegen das Impfvirus das Ergebnis bei vakzinierten Tieren beeinflussen (Egliet al., 2001). Des Weiteren besteht die Möglich- keit, die Nukleinsäure des PRRSV nachzuweisen. Es existieren mehrere konventionelle undreal-time PCR-Protokolle, die den Virusnachweis auch bis zum Tag 31 p.i. erlauben.

Einige gestatten zusätzlich eine Differenzierung zwischen europäischen und amerikanischen Stämmen (Meulenberg et al., 1993a; Mardassi et al., 1994; Christopher- Hennings et al., 1995, 1998, 2001; Kono et al., 1996; Larochelle und Magar, 1997; Oleksiewicz et al., 1998; Spagnuolo-Weaver et al., 2000; Egli et al., 2001;

Stadejeket al., 2002;van Rijnet al., 2004;Wasilket al., 2004;Revilla-Fern´andez et al., 2005;Chung et al., 2005;Kleiboeker et al., 2005).

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2.3.4 Porzine Influenza

Die porzine Influenza ist eine akute, fieberhafte, respiratorische Erkrankung. Influenza- viren wurden in Schweinen erstmals 1918 in den USA beobachtet (Easterday und Hinshaw, 1992). 1930 gelang esShope(1931b), das Virus zum ersten Mal aus erkrankten Tieren zu isolieren. Den porzinen Influenzaviren kommt m¨oglicherweise auch eine Rolle bei der Entstehung neuer humanpathogener Influenzast¨amme zu (Truyen, 2003).

2.3.4.1 Das Influenza-A-Virus

Das Virus der Spezies porzines Influenzavirus (im Weiteren Influenza-A Virus) gehört zur Familie Orthomyxoviridae, Genus Influenzavirus-A. Influenza-A-Viren sind behüllt und besitzen ein helikalsymmetrisches Nukleokapsid. Die Virionen sind pleomorph, so variiert ihre Größe von ca. 70-90 nm bis hin zu 3000 nm (Modrow et al., 2003).

Das Genom der Influenza-A-Viren besteht aus acht unabhängigen einzelsträngigen RNA- Segmenten, die in negativer Polarität vorliegen. Sie kodieren für zehn Hauptstrukturpro- teine. Die systematische Bezeichnung der Influenzaviren bezieht neben dem Typ auch die Antigenstruktur der wesentlichen Strukturproteine des Virus, des Hämagglutinins (H) und der Neuraminidase (N), sowie das Jahr und den Ort der Isolierung mit ein. Daraus ergeben sich verschiedene H- und N-Typen. Beim Schwein wurden bisher hauptsächlich H1N1 und H3N2 Influenzaviren gefunden (Olsenet al., 1993;Bikour et al., 1994;Truyen, 2003), wobei letztere vermutlich auf Infektionen mit humanen Influenzaviren zurückzuführen sind (Truyen, 2003). In den letzten Jahren hat sich die epidemiologische Situation in Europa dramatisch verändert. H1N1, H3N2 und H1N2 Subtypen kozirkulieren in der eu- ropäischen Schweinepopulation (Reethet al., 2004). Klassische H1N1 Subtypen wurden in den letzten Jahren durch avian-like H1N1 Stämme verdrängt (Pensaertet al., 1981;

Brown et al., 1993).

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Abbildung 2.7: Influenza-A Virus. Schematische Darstellung viraler Proteine. Nach Modrowet al. (2003).

Die Influenza-A-Virus-Infektion tritt beim Schwein in zwei klinischen Formen auf. Die am weitesten verbreitete ist die respiratorische Form. Nach einer kurzen Inkubations- zeit von ein bis vier Tagen treten die ersten Symptome auf. Charakteristisch sind dabei hohes Fieber, trockener Husten, Dyspnoe, Hyperämie der Haut, Lymphknotenschwellun- gen, interstitielle Pneumonie und seröser Nasen- und Augenausfluss (Zimmermann und Plonait, 2001; Truyen, 2003). Die Krankheitssymptome können drei bis sieben Tage anhalten. Außerdem ist das Influenza-A-Virus zusammen mit dem PRRSV (s. 2.3.3.1), PCV-2 (s. 2.3.6.1),Mycoplasma hyopneumoniae und anderen bakteriellen Erregern am so genanntenporcine respiratory disease complex (PRDC, s. 2.3.6.2) beteiligt.

(43)

2.3.4.3 Diagnostik

Die endgültige Diagnose wird durch einen Virusnachweis geführt. Das Virus kann auf verschiedenen Zelllinien angezüchtet werden, die Virusisolierung erfolgt jedoch meist im embryonierten Hühnerei. Die Überprüfung und Spezifizierung ist über den Hämagglutina- tionshemmtest mit spezifischen Antiseren möglich (Truyen, 2003). In Lungenschnitten lässt sich das Antigen mittels Immunfluoreszenz-, bzw. Immunperoxidasetechnik nachweisen (Zimmermann und Plonait, 2001). Für die serologische Untersuchung von Se- rumpaaren steht der Hämagglutinationshemmtest zur Verfügung (Long et al., 2004). In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl an PCR-Protokolle zum Nachweis der Nu- kleinsäuren des Influenza-A Virus entwickelt (Fouchier et al., 2000; van Eldenet al., 2001; Choiund Chae, 2002; Matsuzaki, 2003; Richtet al., 2004; Stoneet al., 2004;

Watzingeret al., 2004;Chen et al., 2005;Hindiyehet al., 2005;Krafftet al., 2005;

Landolt et al., 2005; Zhang et al., 2005; Payungporn et al., 2006).

2.3.5 Porzine Parvovirus - Infektionen

Intrauterine Infektionen mit dem porzinen Parvovirus (PPV) gelten heute als wichtigs- te Ursache für das so genannte SMEDI-Syndrom (stillbirth, mummification, embryonic death, infertility). Betroffen sind vor allem Bestände mit hohem Jungsauenanteil (Plonait, 2001). Der Erreger wurde 1967 erstmals in England isoliert und ist weltweit verbreitet. Die Seroprävalenz beträgt in deutschen Schweinehaltungen ca. 70 bis 80 % (Truyen, 2003).

2.3.5.1 Das Porzine Parvovirus

2.3.5.1.1 Taxonomie und Morphologie Das PPV geh¨ort zur Familie Parvoviri- dae, Subfamilie Parvovirinae. Die Familie enth¨alt eine weitere Subfamilie -Densovirinae mit den Genera Brevidensovirus,Densovirus und Iteravirus; die SubfamilieParvovirinae umfasst die Genera Dependovirus, Erythrovirus und Parvovirus (Murphy et al., 1995).

Die Parvoviren sind kleine, unbeh¨ullte, DNA Viren mit einem Virionendurchmesser von ca. 20 nm (Mayr et al., 1968; Molitoret al., 1983).

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2.3.5.1.2 Genomorganisation und virale Proteine Das Genom des PPVs besteht aus einer linearen, einzelsträngigen DNA mit negativer Polarität und ist ca. 5000 Basen lang (Molitor et al., 1984; Bergeron et al., 1993). Es besitzt zwei große und einen kleinen ORF. Alle drei ORFs liegen auf dem komplementären (positiven) Strang und

¨uberlappen sich gegenseitig (s. Abbildung 2.8). ORF1 kodiert f¨ur Nichtstrukturprotei-

Abbildung 2.8: Schematische Darstellung des Genoms des Porzinen Parvovirus.

ne und für die ersten zehn Aminosäuren des Strukturproteins VP1. ORF2 kodiert für die Strukturproteine VP1 und VP2 (Bergeron et al., 1993). Das Genom der Parvovi- ren ist von einem Kapsid umgeben, das sich aus den Strukturproteinen VP1 und VP2 zusammensetzt. VP2 ist das Hauptstrukturprotein. Das PPV besitzt außerdem die Nicht- strukturproteine NS1, NS2 und NS3 (s. Abbildung 2.8), deren Funktionen jedoch noch nicht genau geklärt sind (Berns, 1990; Wilson et al., 1991). Die Aminosäuresequenz des VP2 ist vollständig in der des VP1 enthalten. Beide Kapsidproteine werden über die gleiche

”messenger“-RNA (mRNA) transkribiert. Wird die mRNA vom ersten Startcodon aus translatiert, entsteht das VP1-Kapsidprotein; VP2 wird gebildet, wenn vom zweiten

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Startcodon die mRNA translatiert wird. VPl und VP2 sind antigenetisch eng verwandt (Molitoret al., 1983). Die Proteine werden durch alternatives Spleißen prozessiert, d. h., der gleiche Genomabschnitt wird in verschiedenen Leserastern abgelesen. Dabei dienen sowohl gespleißte als auch ungespleißte Transkripte als mRNA. Dieser Mechanismus macht es den Parvoviren m¨oglich, ihre gesamte Erbinformation innerhalb des kleinen Genoms zu plazieren (Berns, 1990).

Infektionen mit dem PPV führen zu Fruchtbarkeitsstörungen, die durch Umrauschen, Ab- orte, Totgeburten, Mumifikation, neonatalen Tod und reduzierte neonatale Lebensfähig- keit gekennzeichnet sind (Cartwright und Huck, 1967; Johnson und Collings, 1969; Morimoto et al., 1972; Narita et al., 1975; Forman et al., 1977). PPV wird als häufigste Ursache für Fruchtbarkeitsstörungen beim Schwein angesehen. In der Klinik gilt es als Hauptursache des

”SMEDI“ Syndroms. Die akute Infektion neonataler und adul- ter Schweine mit dem PPV verl¨auft in der Regel subklinisch (Mengeling und Cutlip, 1976; Jooet al., 1977). Pathologische Ver¨anderungen nach einer PPV-Infektion sind nur bei Embryonen und Feten festzustellen.

Der Grad der klinischen Ver¨anderungen h¨angt von der Virulenz des PPV-Stammes ab.

Avirulente Stämme können die Plazentarschranke nicht übertreten (Mengeling und Cutlip, 1976). Virulente Stämme sind nur pathogen für noch nicht immunkompetente Feten (Mengeling und Cutlip, 1976), nach Erreichen der Immunkompetenz werden neutralisierende Antikörper gebildet (Bachmann et al., 1975). Hochvirulente Stämme verursachen Läsionen bzw. führen auch nach Erreichen der Immunkompetenz zum Tod (Kresse et al., 1985). Je nach Immunstatus und Alter der betroffenen Tiere kommt es zu unterschiedlichen Ausprägungen der klinischen Symptome. Die Palette reicht von Fruchtresorbtion und Umrauschen, über Aborte mumifizierter Früchte bis hin zur Ge- burt lebensschwacher Ferkel (Rodeffer et al., 1975;Cropper et al., 1976;Wrathall und Mengeling, 1979; Mengeling et al., 1980; Kuiper, 1985). Der häufigste Krank- heitsbefund ist die Mumifikation (Mengeling, 1975; Mengeling und Cutlip, 1976;

Donaldson-Wood et al., 1977; Cutler et al., 1983). Das PPV wird mit dem PMWS (s. 2.3.6.2) in Zusammenhang gebracht, dabei zeigte sich, dass eine Koinfektion von neo-

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natalen Ferkeln mit PPV und PCV-2 (s. Kapitel 2.3.6.1) das Krankheitsbild von PMWS verst¨arkt. PPV bewirkt dabei eine Immundysfunktion, die den Viruseintritt von PCV-2 in Zellen erleichtert (Ellis et al., 1999;Allan et al., 1999; Kennedy et al., 2000).

2.3.5.3 Diagnostik

Für die PPV-Diagnostik stehen sowohl direkte als auch indirekte Nachweismethoden zur Verfügung. Die Methode der Wahl für den Nachweis von PPV ist die PCR, da mit ihr auch der Nachweis viraler Nukleinsäuren in mumifizierten Feten möglich ist, wenn kein in- fektiöses Virus mehr nachweisbar ist (Truyen, 2003). Es sind bisher mehrere gel-basierte und real-time PCR-Protokolle publiziert worden (Molitor et al., 1991; Gradil et al., 1994;Bergeronet al., 1996; Belák et al., 1998; Arnauld et al., 1998; Soareset al., 1999; Choi und Chae, 2000; Ellis et al., 2000; Kim und Chae, 2001; Lyoo et al., 2001;Kim und Chae, 2003; Kimet al., 2003b; Prikhod’ko et al., 2003;Huang et al., 2004; Kim und Chae, 2004; Cao et al., 2005b). Alternativ besteht die Möglichkeit das PPV in der Zellkultur zu isolieren.Mengeling (1975, 1978) stellte jedoch fest, dass die Infektiösität progressiv nach den Tod des Fetus abnimmt und die Isolierung in Zellkul- tur daher häufig erfolglos verläuft. Wegen der hohen Tenazität ist bei diesen Verfahren auch das Kontaminationsrisiko sehr hoch (Cartwright et al., 1969). Generell können mit zunehmender Reife der Feten Antikörper auftreten, die den Virusnachweis stören (Truyen, 2003). Relativ unspezifisch und weniger sensitiv ist der Hämagglutinationstest bzw. der spezifische Hämagglutinationshemmtest (Jenkins, 1992; Mengeling et al., 1993; Truyen, 2003). Die Immunfluoreszenztechnik erlaubt den Nachweis von PPV in Geweben (Joo und Johnson, 1977;Mengeling, 1978), wobei sich v. a. Lungen eignen (Truyen, 2003). Oraveerakulet al. (1990) haben ein

”slot-blot hybridization“ - Pro- tokoll mit nichtradioaktiven Sonden zum Antigennachweis in Gewebe und in Zellkultur entwickelt. Zum indirekten Erregernachweis stehen kommerzielle ELISA-Kits zum semi- quantitativen Nachweis von PPV-Antikörpern zur Verfügung. Da viele Schweine durch Impfung, subklinische Infektionen oder maternale Antikörper seropositiv sind, ist eine einmalige serologische Untersuchung nicht aussagekräftig. Daher wird die Untersuchung von Serumpaaren durchgeführt (Truyen, 2003).

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2.3.6 Porzine Circovirus-Infektionen

Das porzine Circovirus (PCV) wurde 1974 von Tischer et al. (1974) als Kontaminan- te der stabilen porzinen Nierenzelllinie (PK-15) entdeckt. Es existieren zwei Typen des PCVs. Während das PCV Typ 1 als apathogen beschrieben wird, ist das PCV Typ 2 für klinisch manifeste Infektionen verantwortlich. Das porzine Circovirus Typ 2 wurde erstmals 1991 in Kanada als Auslöser klinischer Erkrankungen beschrieben. Seither fand man ähnliche Bilder nahezu weltweit. Der Erreger ist beteiligt am PMWS, PDNS und PRDC (Haas, 2003).

2.3.6.1 Das Porzine Circovirus

Die porzinen Circovirus Typen 1 und 2 (PCV-1 bzw. PCV-2) geh¨oren zusammen mit den Circoviren der Taube (Pigeon circovirus), der Gans (Goose circovirus), des Kanarienvogels (Canary circovirus), der Ente (Duck circovirus) und dem Psittacine Beak and Feather Disease Virus dem Genus Circovirus an (Mankertz et al., 2000;Todd et al., 2001a,b;

Ritchie et al., 1989). Das Chicken Anaemia Virus (Todd et al., 1990) ist der alleinige Vertreter des Genus Gyrovirus (Pringle, 1999). Die beiden Genera sind in der 1993 etablierten Familie Circoviridae untergebracht (Studdert, 1993; Lukert et al., 1995).

Das PCV ist ein unbeh¨ulltes Virus mit einem Durchmesser der Viruspartikel von lediglich 17 nm (Tischeret al., 1982). Es ist damit das kleinste bekannte Virus. Das Nukleokapsid hat ein Molekulargewicht von 36 kDa und besitzt eine ikosaedrische Symmetrie (Tischer et al., 1982).

Die Nukleinsäure der porzinen Circoviren liegt in Form einer zirkulär geschlossenen, ein- zelsträngigen DNA mit positiver Strangorientierung vor (Buhk et al., 1985; Tischer et al., 1987; Meehan et al., 1997). Die Genomlänge beträgt beim PCV-1 1759 Basen und beim PCV-2 1768 Basen (Hamel et al., 1998;Morozov et al., 1998). Beide Typen sind phylogenetisch eng miteinander verwandt, die Nukleotidsequenzhomologie zwischen ihnen beträgt nach unterschiedlichen Aussagen ca. 68 % bis 80 % (Morozov et al., 1998;

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Hamel et al., 1998; Meehan et al., 1998). Die Nukleotidsequenzhomologien von Feld- isolaten des PCV-2 liegen bei 96 % (Morozov et al., 1998). Porzine Circoviren besitzen insgesamt elf ORFs innerhalb ihres Genoms (Hamel et al., 1998).

Im Bereich des ORF1 beträgt die Homologie zwischen PCV-1 und PCV-2 85 % (Morozov et al., 1998; Meehan et al., 1998). In den ORFs 5, 6, 9, 10 und 11 besitzen die beiden PCV Typen keinerlei Homologie. In den anderen ORFs ist sie unterschiedlich hoch ausgeprägt (Hamel et al., 1998). Der ORF2 besitzt zwischen PCV-1 und PCV-2 eine höhere Sequenzvariabilität. Sie liegt in disem Teil des Genoms bei ca. 66 % (Morozov et al., 1998; Hamel et al., 1998). Wie Ilyina und Koonin (1992) zeigten, kodiert der ORF1 für ein replikationsassoziiertes Protein, die ORF2 kodiert für Hauptkapsidproteine (Nawagitgul et al., 2000; Meehan et al., 2001).

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Abbildung 2.9: Schematische Darstellung eines PCV-2. Nach Modrowet al. (2003).

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Trotz der weltweiten Verbreitung des PCV-1 (Allan et al., 1998), wird das Virus als apathogen angesehen (Tischeret al., 1986;Allanet al., 1995;Krakowkaet al., 2000).

Weder in PCV-1-positiven Betrieben, noch bei experimentell infizierten Tieren konnten Krankheitssymptome festgestellt werden (Allan et al., 1995). Die pathogene Rolle des PCV-2 beim Schwein wird dagegen oft diskutiert (Allan et al., 1998; Meehan et al., 1998; Kimund Chae, 2001, 2002; Pallareset al., 2002; Chae, 2004). Zur Ausbildung eines Krankheitskomplexes sind aber weitere Koinfektionen oder Kofaktoren erforderlich (Allan et al., 2000; Choi und Chae, 2000; Krakowka et al., 2001; Kim und Chae, 2003).

Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)

Das PCV-2 wurde erstmals von Ellis et al. (1998) mit dem PMWS in Zusammenhang gebracht. Obgleich nachgewiesen wurde, dass das PCV-2 die Hauptursache des PMWS ist, sind f¨ur eine Ausbildung des Krankheitskomplexes weitere Kofaktoren erforderlich (Ellis et al., 2004). Betroffen sind sechs bis 15 Wochen alte Schweine, typischerweise sind es jedoch junge Tiere nach dem Absetzen (post-weaner) (Harding et al., 1998;

Harding, 2004). Die Diagnose PMWS kann nur gestellt werden, wenn die drei folgenden Kriterien erfüllt werden: typische klinische Symptome, Vorhandensein charakteristischer mikroskopischer Läsionen und Anwesenheit des PCV-2 in den Läsionen (Segalés et al., 2004; Chae, 2004). Die sechs Hauptsymptome des PMWS sind Kümmern, Dyspnoe, vergrößerte Lymphknoten, Diarrhoe, Blässe und Ikterus (Harding, 2004). Bei der Sektion fallen die nicht kollabierten, braun-marmorierten Lungen und vergrößerte Lymphknoten auf (Rosell et al., 1999). Die Leber kann sowohl vergrößert, als auch verkleinert sein und an den Nieren sind multiple helle Punkte verschiedener Größe feststellbar (Rosell et al., 2000; Segalés et al., 2004).

Porzines Dermatitis und Nephropathie Syndrom (PDNS)

PDNS wurde erstmals von Smith et al. (1993) in Großbritannien beschrieben. Mittler- weile kommt die Krankheit weltweit vor (Segal´es et al., 2004). Das Leitsymptom ist die

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Ausbildung von runden oder unregelmäßig geformten, rot bis violettgefärbten Hautarea- len. Meistens sind sie an den Extremitäten, am Unterbauch, an den Flanken oder auch an den Ohren lokalisiert (Harding, 2004). In schweren Fällen kommt es zu Abmagerung, Anorexie und Fieber. Selten treten Todesfälle auf. Es kommt zu einer nekrotisierenden Vaskulitis im Bereich der Haut und in den Nieren. Letztere sind dabei vergrößert, blass und weisen petechiale Blutungen auf (Harding, 2004).

Porcine respiratory disease complex (PRDC)

Der PRDC ist durch Kümmern, Husten und Pneumonie charakterisiert (Thacker et al., 2000). Betroffen sind meistens Schweine im Alter von 16 bis 20 Wochen. Neben PCV-2 sind auch das PRRSV (s. Kapitel 2.3.3), das porzine Influenza Virus (s. Kapitel 2.3.4.1) und Mycoplasma hyopneumoniae am Geschehen beteiligt (Thacker et al., 2000). Die klinischen Erscheinungen sind von der Anzahl der beteiligten Erreger abhängig. In den meisten Fällen ist es schwierig, PRDC von PMWS oder PRRS zu unterscheiden. Die pathologischen Veränderungen in den Lungen sind mit denen von PRRS, oder bakteriellen Infektionen (wie Salmonellose) identisch (Harms et al., 2001).

2.3.6.3 Diagnostik

Zum Nachweis des PCV-2 stehen sowohl direkte, als auch indirekte Nachweismethoden zur Verfügung. Immunhistochemie undin situHybridisierung geben neben dem Erregernach- weis auch eine Auskunft über das pathologisch-histologische Geschehen im betroffenen Gewebe (ChoiundChae, 1999, 2000;Kimund Chae, 2001;Kimet al., 2003a;Kimund Chae, 2004).Elliset al. (1998) und Choiet al. (2000) gelang der Nachweis von PCV-2 in verschiedenen Organen mittels Immunhistochemie unter Verwendung von mono- und polyklonalen Antikörpern.In situ Hybridisierung erlaubt sowohl den Nachweis, als auch Differenzierung zwischen PCV-1 und PCV-2 (Kim und Chae, 2001, 2002). Die PCR bleibt im Vergleich zu in situ Hybridisierung die sensitivere Methode (Calsamiglia et al., 2002). Es sind mehrere gel-basierte PCR-Protokolle publiziert (Ouardani et al., 1999;Kim et al., 2001; Kim und Chae, 2004).

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2.4 Polymerasekettenreaktion

2.4.1 Prinzip

Die Polymerasekettenreaktion (PCR - Polymerase chain reaction), die zum ersten Mal von Mullis und Faloona (1987) vorgestellt wurde, stellt eine in vitro Technik dar.

Dabei wird ein von zwei spezifischen Oligonukleotiden, denPrimern, eingerahmtes DNA- Fragment in einer enzymatischen, zyklischen Reaktion mehrfach vervielfältigt. Im ersten Schritt, der Denaturierung bei 92-95^◦C, entsteht aus einer doppelsträngigen DNA (dsDNA) einzelsträngige Matrizen-DNA (ssDNA). Danach wird der Reaktionsansatz auf eine bestimmte Temperatur herunter gekühlt, die von der Schmelztemperatur der jewei- ligen Primer abhängig ist. Dabei kommt es zur Anlagerung (Annealing) der Primer an die komplementären Sequenzen der Matrizen-DNA. Im nächsten Schritt werden die Pri- mer von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid- Triphosphate (dNTPs) und Magnesium-Ionen verlängert (Elongation). Die im ersten Zy- klus entstandenen Reaktionsprodukte (Amplifikate) dienen in nachfolgenden Zyklen selbst als Matrize. Die Polymerase verlängert den DNA-Strang solange sie sich nicht von ihm löst, oder die Reaktion durch eine Temperaturerhöhung unterbrochen wird. Damit wird ein neuer Zyklus eingeleitet. Üblicherweise wird die Reaktion 20-40 mal wiederholt. In der Theorie verdoppelt sich die Anzahl neu entstandener DNA-Kopien von Zyklus zu Zyklus.

Anders als in der Theorie, liegt in der Praxis der durchschnittliche Multiplikationsfaktor in der Gesamtreaktion bei ca. 1,6 bis 1,7 je Zyklus (Kainz, 2000). Das spielt in der quantitativen PCR (s. 2.4.3.5), bei der die genaue Zahl der Ausgangskopien bestimmt werden kann, eine entscheidende Rolle.

Die entstandenen DNA-Fragmente lassen sich anschließend durch Auftrennung anhand der Fragmentgröße in einem Agarose-Gel (3.2.2.5) und anschließender Färbung mit einem fluoreszierenden Farbstoff, wie z. B. Ethidiumbromid (Kemp et al., 1989) unter UV- Licht bei 254 nm sichtbar machen (Sambrook et al., 1989). Durch einen parallel aufge- tragenen Größenmarker lässt sich die Größe des DNA-Amplifikats bestimmen (Mullis und Faloona, 1987). Eine weitere Verifizierung der amplifizierten DNA läßt sich durch Restriktionsenzymschnittmusteranalyse (Sambrook et al., 1989), Bestimmung der Nu- kleotidabfolge durch Sequenzierung (Innis et al., 1988) oder Hybridisierung mit einer