Bestimmung der Kopienzahl der Plasmide

Die Berechnung der Kopienanzahl des Plasmids proµl erfolgte anhand der DNA-Konzentration, die wiederum mittels Messung der optischen Dichte (OD) bestimmt wurde. Die Messung des OD-Wertes erfolgte zweimal bei 260 nm Wellenl¨ange. Die Berechnung der DNA-Konzentration erfolgte nach folgender Formel:

C_[µg/ml]=OD₂₆₀×V ×F

C = Konzentration der Ausgangsl¨osung

OD260 = Optische Dichte bei 260 nm Wellenl¨ange

Tabelle 3.12: Restriktionsenzymverdau der Plasmide mit klonierten PCR-Produkten

Plasmid DNA- Enzym Enzym- Puffer Puffer- H2O

Menge menge menge

ASPV 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

SHV-1 25µl EcoR V 5µl Reaction2 5µl + 5µl 15µl

Influenza-A 25µl Xmn I 2,5µl NEB2 + BSA 5µl + 2,5µl 15µl

KSPV 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

PCV-2 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

PPV 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

PRRSV-EU 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl PRRSV-NA 25µl Spe I 5µl Tango + BSA 5µl + 5µl 15µl

V = Verd¨unnungsfaktor

F = Multiplikationsfaktor (50 f¨ur dsDNA)

F¨ur die Berechnung der Kopienzahl wurde folgende Formel eingesetzt:

C[Kopien/µl]=NA× OD260×F ×V ×10⁻⁹ L×M W

C = Konzentration der L¨osung in Plasmidkopien/µl NA = 6,022×10²³×mol⁻¹ Avogadro-Konstante OD260 = Optische Dichte bei 260 nm Wellenl¨ange V = Verd¨unnungsfaktor

F = Multiplikationsfaktor (50 f¨ur dsDNA)

MW = Molekulargewicht je Basenpaar (660 g/mol) L = L¨ange des Plasmids in Basen

10⁻⁹ = Umrechnungsfaktor

Nach der Berechnung der Konzentration wurde die Plasmid-L¨osung aliquotiert und ent-weder in der real-time PCR eingesetzt oder bei −20^◦C bis zur Verwendung gelagert.

4.1 Ergebnisse der Literaturrecherche

Sowohl f¨ur den vorl¨aufigen Entwurf als auch kontinuierlich w¨ahrend der verschiedenen Entwicklungsphasen der PCR erfolgte eine Literaturrecherche in der DatenbankMedline¹. Zun¨achst wurden die Erkrankungen ermittelt, die als bedeutsame KSP Differentialdia-gnosen viraler Genese bekannt waren. Die in der Literatur erw¨ahnten, differentialdiagnos-tisch relevanten Erkrankungen waren ASPV-, PCV-2-, PPV-, porzine Influenza-A-Virus-, PRRSV- und SHV-1-Infektionen (van Oirschot, 1999b; Moennig et al., 2003). Die Detektion dieser Erreger wurde daher f¨ur den vorliegenden Ansatz angestrebt. In einem weiteren Schritt wurden TaqMan-Protokolle gesucht, die f¨ur die Detektion dieser Viren entwickelt wurden. Diese Protokolle wurden hinsichtlich der gew¨ahlten Genomabschnitte, der Fragmentgr¨oßen und der Thermoprofile ausgewertet. Die TaqMan-PCR-Protokolle, die ¨uber die Datenbank Medline gefunden werden konnten, sind in Tabelle 4.1 unter Angabe der Referenz dargestellt. Die Tabelle enth¨alt alle bis dato publizierten Protokol-le, obgleich f¨ur die unmittelbare Entwicklung des vorliegenden Ansatzes nur die bis 2004 ver¨offentlichten Arbeiten ber¨ucksichtigt wurden. Allein das vonKleiboekeret al. (2005) f¨ur die Detektion und Differenzierung des PRRSV publizierte Protokoll wurde im weiteren Verlauf der Entwicklung getestet und in den multiplex-Ansatz integriert. F¨ur die Detekti-on des ASPV kDetekti-onnten zwei eigenst¨andige TaqMan-PCR-Protokolle gefunden werden, die beide auf der Detektion eines Fragmentes des VP72-Gens beruhten. F¨ur das von King et al. (2003) entwickelte Protokoll war eine Produktl¨ange von 250 bp angegeben, diese Information war der Publikation von Zsak et al. (2005) f¨ur das dortige Protokoll nicht

1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

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zu entnehmen. Die Thermoprofile dieser Protokolle wichen in einigen Punkten deutlich voneinander ab. Das Protokoll von King et al. (2003) beinhaltete 35 Zyklen mit einem Denaturierungsschritt bei 94^◦C f¨ur 30 sec, einem Annealing-Schritt bei 58^◦C f¨ur 60 sec und einerElongation bei 72^◦C f¨ur 45 sec. F¨ur das Protokoll vonZsaket al. (2005) waren 45 Zyklen mit den Schritten 95^◦C f¨ur 2 sec und 60^◦C f¨ur 60 sec angegeben.

Die f¨ur die Detektion des SHV-1 entwickelten TaqMan-Protokolle amplifizierten haupts¨ach-lich ein Fragment des Genombereichs, der f¨ur das gB-Protein kodiert. Auch hier konnten zwei Protokolle gefunden werden. W¨ahrend das von van Rijn et al. (2004) publizierte Protokoll ausschließlich das gB-Fragment amplifizierte, war in der Publikation vonYoon et al. (2005) auch die Amplifikation eines Fragments des gE-Gens vorgesehen. Den Publi-kationen waren die Produktgr¨oßen nicht zu entnehmen. Die Thermoprofile unterschieden sich sowohl in der Dauer der einzelnen Schritte als auch der Zyklenzahl. W¨ahrend das

Pro-Tabelle 4.1: Ergebnisse der Literaturrecherche. Ber¨ucksichtigt wurden nur real-time TaqMan-PCRs.

Virus Referenz

ASPV (King et al., 2003;Zsak et al., 2005) SHV-1 (van Rijnet al., 2004; Yoon et al., 2005)

PCV-2 (Roviraet al., 2002; Brunborget al., 2004; Olvera et al., 2004; Chunget al., 2005)

PPV –

KSPV (Hofmann, 2003;Risattiet al., 2003;van Rijnet al., 2004; Gaede et al., 2005; Hoffmann et al., 2005;

Risatti et al., 2005; Ophuis et al., 2006)

Influenza-A (van Eldenet al., 2001;Watzingeret al., 2004; Hin-diyehet al., 2005; Krafftet al., 2005; Payungporn et al., 2006)

PRRSV (Egliet al., 2001;van Rijnet al., 2004;Wasilket al., 2004; Revilla-Fern´andez et al., 2005; Kleiboeker et al., 2005)

tokoll von van Rijn et al. (2004) 45 Zyklen mit einem Denaturierungsschritt bei 95^◦C f¨ur 5 sec, einem Annealing-Schritt bei 60^◦C f¨ur 5 sec und einer Elongation bei 72^◦C f¨ur 10 sec vorsah, enthielt das Protokoll vonYoon et al. (2005) 50 Zyklen mit den Schritten 94^◦C f¨ur 60 sec, 60^◦C f¨ur 30 sec und 72^◦C f¨ur 60 sec.

Die TaqMan-Protokolle, die f¨ur die Detektion des PCV-2 in der Literatur zu finden waren, amplifizierten ausnahmslos ein Fragment aus dem ORF2 des viralen Genoms. Es konnten vier Protokolle gefunden werden. Die Fragmentgr¨oßen lagen bei 84 bp (Brunborget al., 2004), 98 bp (Olvera et al., 2004), 100 bp (Rovira et al., 2002) und 269 bp (Chung et al., 2005). Die Thermoprofile sahen 45 (Rovira et al., 2002; Brunborg et al., 2004;

Chung et al., 2005) bzw. 40 (Olvera et al., 2004) Zyklen vor. Im Einzelnen waren die Profile wie folgt: Das Protokoll von Brunborg et al. (2004) sah f¨ur die 45 Zyklen einen Denaturierungsschritt bei 95^◦C f¨ur 10 sec vor, der von 30 sec bei 62^◦C gefolgt wurde.

Ahnliche Bedingungen wurden bei¨ Olveraet al. (2004) verwendet. Die 40 Zyklen wurden in diesem Fall mit 15 sec bei 95^◦C und 60 sec bei 60^◦C durchgef¨uhrt. Das Thermoprofil der von Rovira et al. (2002) entwickelten PCR beinhaltete 45 Zyklen mit den Schritten 20 sec bei 95^◦C, 20 sec bei 68^◦C und ebenfalls 20 sec bei 70^◦C. Das von Chung et al.

(2005) publizierte Protokoll weist ein Thermoprofil mit 45 Zyklen bei 95^◦C f¨ur 7 sec, 57^◦C f¨ur 10 sec und 72^◦C f¨ur 10 sec auf.

F¨ur das PPV konnten bis dato keine publizierten TaqMan-Protokolle gefunden werden.

Die f¨ur die Detektion des KSPV entwickelten und publizierten TaqMan-Protokolle basie-ren durchweg auf dem Nachweis eines Fragments aus der 5^′NTR des viralen Genoms. Es konnten der Datenbank f¨unf eigenst¨andige PCR-Protokolle und ein modifiziertes Proto-koll entnommen werden. F¨ur zwei der eigenst¨andigen ProtoProto-kolle war die Produktgr¨oße angegeben, die bei 82 bp (Risatti et al., 2003) bzw. 93 bp (Hoffmann et al., 2005) lag. Das von Ophuis et al. (2006) modifizierte Protokoll beruht auf den von Risatti et al. (2003) publizierten Primern und Sonden, daher besitzt dieses Fragment ebenfalls eine Gr¨oße von 82 bp. Die Produktgr¨oße der anderen Protokolle (Hofmann, 2003; van Rijn et al., 2004) konnte den Publikationen nicht entnommen werden. Die verwendeten Thermoprofile variierten in allen Parametern. F¨ur das von Hofmann(2003) entwickelte Protokoll wurde ein Thermoprofil mit 50 Zyklen gew¨ahlt, die aus einem Denaturierungs-schritt bei 95^◦C f¨ur 30 sec und einer nachfolgenden Amplifikation bei 60^◦C f¨ur 60 sec bestanden. Das vonRisatti et al. (2003) publizierte Protokoll sah 45 Zyklen mit zwei sec

bei 95^◦C und 30 sec bei 60^◦C vor. Der Publikation von van Rijn et al. (2004) konnte nur entnommen werden, dass 45 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95^◦C, einem An-nealing-Schritt mit unbekannten Parametern und einer Elongation bei 72^◦C angewendet wurden. Das vonGaedeet al. (2005) publizierte Protokoll nutzt f¨ur die speziesspezifische Differenzierung von Pestiviren verschiedene Primerpaare, die alle im Bereich der 5^′NTR binden. Das Primerpaar A11/A14 vonMcGoldrick et al. (1998) amplifiziert ein Frag-ment von 220 bp Gr¨oße. Das Pesti3/Pesti4 Primerpaar, das vonHyndman et al. (1998) publiziert wurde, grenzt ein Genomfragment mit 171 bp Gr¨oße ein. Die panpesti-Primer 324/326, die vonVilˇcek et al. (1994) publiziert wurden, amplifizieren ein 288 bp großes Genomfragment. Das thermische Profil bestand aus einem Schritt f¨ur die reverse Tran-skription bei 50^◦C f¨ur 30 min, anschließender Denaturierung und Polymerasenaktivierung bei 95^◦C f¨ur 15 min, gefolgt von 45 Zyklen Denaturierung bei 94^◦C f¨ur jeweils 20 sec und einemAnnealing-/Elongation-Schritt bei 60^◦C f¨ur 1 min. Das von Hoffmannet al.

(2005) beschriebene Protokoll sieht ein Thermoprofil mit 42 Zyklen vor. Diese bestehen aus einem Denaturierungsschritt f¨ur 15 sec bei 94^◦C, einem Annealing der Primer f¨ur 30 sec bei 57^◦C und einer Elongation-Phase f¨ur 30 sec bei 68^◦C. Ophuis et al. (2006) modifizierte das von Risatti et al. (2003) entwickelte Protokoll dahingehend, dass das Thermoprofil bei gleich bleibender Zyklenzahl eine auf 15 sec verl¨angerte Phase bei 95^◦C und eine auf 60 sec verl¨angerte Phase bei 60^◦C aufwies.

F¨ur die Detektion verschiedener Influenza-A-Viren wurde vornehmlich der f¨ur das M-Protein kodierende Genomabschnitt verwendet. Vier publizierte, neu entwickelte TaqMan-PCR-Protokolle sowie ein modifiziertes Protokoll wurden hinsichtlich ihrer Parameter vergli-chen. Mit der Ausnahme eines von Payungporn et al. (2006) entwickelten Protokolls zur Detektion von Influenza-A-Viren des Subtyps H5N1, das neben dem Genomfragment des M-Proteins zus¨atzlich die f¨ur H5 und N1 kodierenden Genomabschnitte detektierte, basierten die Protokolle ausschließlich auf der Detektion des M-Protein-Genomfragments.

Das von van Elden et al. (2001) entwickelte Protokoll, das auch dem von Hindiyeh et al. (2005) modifizierten Protokoll zugrunde liegt, beinhaltet zwei Forwardprimer, was zu unterschiedlichen Amplifikatl¨angen f¨uhrt. Die Fragmentl¨ange betrug anhand der Lo-kalisation der Primer 188 bp bzw. 128 bp. Das Protokoll nach Watzinger et al. (2004) f¨uhrt zu einem 132 bp langen PCR-Produkt. Ein 92 bp langes Fragment wird mittels der von Krafft et al. (2005) entwickelten PCR amplifiziert, das von Payungporn et al.

(2006) publizierte PCR-Protokoll detektiert ein 191 bp langes Fragment (M-Protein). Die von Hindiyehet al. (2005) und Watzinger et al. (2004) entwickelten bzw. modifizier-ten Protokolle besaßen ein identisches Thermoprofil mit 50 Zyklen, die aus 15 sec bei 95^◦C und 60 sec bei 60^◦C bestanden. Das Protokoll nach van Elden et al. (2001) wich nur hinsichtlich der Zyklenzahl ab, da es nur 45 Zyklen vorsah. Ein Thermoprofil mit 50 Zyklen sah das Protokoll von Krafft et al. (2005) vor mit 15 sec bei 95^◦C und 60 sec bei 55^◦C. Die vonPayungporn et al. (2006) entwickelte PCR sah ein Thermoprofil mit 40 Zyklen vor, die aus einer Denaturierungsphase bei 94^◦C f¨ur 15 sec, einem Annealing der Primer f¨ur 30 sec bei 55^◦C und einerElongation-Phase f¨ur 40 sec bei 72^◦C bestanden.

Zur Detektion des PRRSV wurden bis dato f¨unf publizierte TaqMan-Protokolle gefunden.

Sie basieren haupts¨achlich auf der Detektion des ORF7 bzw. ORF6, teilweise in Kombi-nation mit Fragmenten aus der 3^′NTR. Das von Egli et al. (2001) publizierte Protokoll zur Detektion von PRRSV-EU und PRRSV-NA f¨uhrte zur Amplifikation eines Fragments aus dem ORF7. Die L¨ange des Amplifikats betrug 105 bp f¨ur PRRSV-NA und 96 bp f¨ur PRRSV-EU. Das Thermoprofil sah 40 Zyklen vor, die aus einem Denaturierungsschritt bei 95^◦C f¨ur 15 sec und einem Amplifikationsschritt bei 60^◦C f¨ur 60 sec bestanden. Das vonvan Rijnet al. (2004) publizierte Protokoll amplifizierte ein Fragment aus ORF6 und ORF7. Die Angaben zum Thermoprofil waren unvollst¨andig und entsprachen denen f¨ur KSPV. Die von Wasilk et al. (2004) entwickelte PCR beruhte auf einem kommerziellen System (Tetracore Inc., Gaithersburg) und amplifizierte neben nicht weiter charakterisier-ten Genomfragmencharakterisier-ten ein Fragment aus der 3^′NTR. Dieses Protokoll sah f¨ur PRRSV-NA ein Thermoprofil mit 40 Zyklen vor, die aus 30 sec bei 94^◦C, 60 sec bei 61^◦C und 60 sec bei 72^◦C bestanden. Das Profil f¨ur PRRSV-EU bestand aus 45 Zyklen. Diese sahen 3 sec bei 95^◦C und 30 sec bei 60^◦C vor. Das vonRevilla-Fern´andezet al. (2005) publizierte Protokoll sah die Amplifikation eines Fragmentes aus dem ORF6 vor. Das Thermoprofil bestand aus 45 Zyklen, die mit 15 sec bei 95^◦C und 60 sec bei 60^◦C durchgef¨uhrt wurden.

Die PCR, die von Kleiboeker et al. (2005) entwickelt wurde, beruhte f¨ur PRRSV-EU auf der Amplifikation eines 77 bp Fragments aus dem ORF7, f¨ur PRRSV-NA auf der Am-plifikation eines 114 bp Fragments aus dem ORF7 und der 3^′NTR. Das thermische Profil sah einen initialen Schritt f¨ur die reverse Transkription bei 50^◦C f¨ur 30 min, gefolgt von 40 PCR Zyklen vor. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungsschritt bei 94^◦C f¨ur 15 sec und einem Schritt f¨ur Annealing und Elongation bei 60^◦C f¨ur 15 sec.

Das anhand der Literatur gew¨ahlte und modifizierte Profil ist in Tabelle 4.2 dargestellt.

Nach Anpassung der Zyklenzahl und -dauer wurde es in der weiteren Arbeit eingesetzt.

Die Aktivierung der Polymerase erfolgte, wie vom Hersteller empfohlen, f¨ur 15 Minuten bei 95^◦C. Der Denaturierungschritt wurde auf eine Dauer von 15 sec festgelegt. Die Schrit-teAnnealing und Elongation wurden zusammengef¨uhrt, und erfolgten bei 60^◦C f¨ur eine Minute. In der Literatur werden meistens Zyklenzahlen zwischen 40 und 50 verwendet. In dieser Arbeit wurde ein Wert von 40 ausgew¨ahlt.

Tabelle 4.2: TaqMan-PCR. Thermisches Profil.

Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen Schritt

95^◦C 15 min 1 Aktivierung der Polymerase

95^◦C 15 sec ⌉ Denaturierung

40

60^◦C 1 min ⌋ Annealung und Elongation