Die hier entwickeltenreal-timePCR-Protokolle wurden nach Maßgabe der OIE Richtlinien zur Validierung und Qualit¨atskontrolle zur Diagnose infekti¨oser Erkrankungen eingesetz-ter PCR-Methoden etabliert und teilweise validiert. Die erste Stufe des Validierungssche-mas, die ¨Uberpr¨ufung der Umsetzbarkeit, wurde erfolgreich abgeschlossen und die PCRs daraufhin optimiert und standardisiert. W¨ahrend die Untersuchung der analytischen Sen-sitivit¨at und der Reproduzierbarkeit erfolgreich abgeschlossen werden konnten, waren die M¨oglichkeiten der Spezifit¨atspr¨ufung auf der Grundlage des limitierten Probenmateri-als nur teilweise m¨oglich. Die zweite Stufe der Validierung wurde somit in weiten Teilen abgeschlossen, bedarf jedoch einer Fortf¨uhrung unter Praxisbedingungen an klinischen Proben.
Die dritte Stufe der Validierung sieht die Bestimmung der diagnostischen Sensitivit¨at (D-SN) und Spezifit¨at (D-SP) sowie der Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit des Testsystems vor. Ein Vergleich mit etablierten
”Goldstandards“ sollte im Rahmen dieser Stufe ebenfalls erfolgen. Die Bestimmung der D-SN und D-SP sollte anhand einer großen Probenanzahl bekannten Hintergrunds vorgenommen werden, die i. d. R. nicht verf¨ugbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte diese Stufe der Testvalidierung daher nicht hin-reichend durchgef¨uhrt werden. Die OIE Richtlinien zur Validierung geben an, dass diese Stufe in vielen F¨allen im praktischen Einsatz parallel zum Goldstandard erfolgen kann. Es sollte daher eine weitere Testung und Validierung des PCR-Protokolls in der Routinedia-gnostik anhand des verf¨ugbaren klinischen Materials durchgef¨uhrt werden. Der parallele Einsatz des Goldstandards ist nicht f¨ur alle Erreger durchf¨uhrbar, k¨onnte jedoch in den meisten F¨allen erreicht werden. Der Vergleich mit dem Goldstandard, der Virusisolierung in Zellkultur, wurde f¨ur die meisten Protokolle bei der Pr¨ufung der analytischen Sensi-tivit¨at durchgef¨uhrt und zeigte eine den Goldstandard ¨ubertreffende bzw. in Einzelf¨allen gleichwertige Sensitivit¨at. Im Rahmen dieser Arbeit wurden soweit wie m¨oglich sowohl klinische Proben als auch unterschiedliche Isolate der entsprechenden Viren getestet, die die Detektionssicherheit der gew¨ahlten Genomfragmente trotz vorhandener Limitierungen absichern sollten. Die unter diesen Umst¨anden m¨oglichen Testschritte wurden erfolgreich durchgef¨uhrt und ergaben zufriedenstellende Ergebnisse. Um eine weitere Validierung entsprechend der OIE-Richtlinien zu gew¨ahrleisten, sollten weitere Untersuchungen mit
klinischem Material folgen.
Trotz der Notwendigkeit der weiteren Validierung kann der etablierte PCR-Ansatz bereits in der vorliegenden Form einen wichtigen Beitrag zur Differentialdiagnose der KSP leis-ten. Neben der hohen Sensitivit¨at des Testsystems und der schnellen Verf¨ugbarkeit einer verl¨asslichen Diagnose bietet dieser Ansatz auch den erheblichen Vorteil einer m¨oglichen Erweiterung um zus¨atzliche, z. B. bakterielle Erreger. Da alle PCR-Protokolle unter glei-chen Bedingungen durchgef¨uhrt werden, ist es m¨oglich, sie beliebig zu erweitern. Außer-dem besteht die M¨oglichkeit, diesen Ansatz auf Krankheitskomplexe anderer Tierspezies zu ¨ubertragen. Die vorliegende PCR ist aufgrund ihrer einfachen Handhabung und Um-setzbarkeit f¨ur die Routinediagnostik besser geeignet als Systeme, die auf der Detektion unter Zuhilfenahme unterschiedlichster Methoden beruhen. Ein Nachteil des vorliegenden Konzeptes ist die Tatsache, dass sich aufgrund des
”Panpesti“-Nachweises eine weitere Differenzierung im Falle einer positiven Reaktion anschließen muss. Da es die rechtlichen Grundlagen nicht gestatten (Council Directive 2001/89/EC), die Diagnose der an-zeigepflichtigen Seuchen auf einen einzelnen positiven Befund zu gr¨unden, ist jedoch eine weitere Abkl¨arung ohnehin notwendig. Die vorliegende Methode ist als ein Screeningtest anzusehen. Sollten sich Verdachtsmomente ergeben, die auf eine anzeigepflichtige Seuche, wie KSP, AK oder ASP hindeuten, m¨ussen weitere Tests eingeleitet werden, die den Ver-dacht best¨atigen oder entkr¨aften.
Andreas Gavrilenko
Entwicklung einer real-time multiplex multitube RT-PCR zur Differentialdia-gnostik der klassischen Schweinepest
Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine wirtschaftlich bedeutende, anzeigepflichti-ge Tierseuche, deren Ausbr¨uche weltweit enorme wirtschaftliche Verluste verursachen.
Die Erkrankung wird durch das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV), ein RNA-Virus, das zum GenusPestivirus der VirusfamilieFlaviviridae geh¨ort, verursacht. Da das klinische Bild einer KSPV-Infektion sehr variabel und h¨aufig unspezifisch ist, kommen viele andere Erkrankungen viraler, bakterieller und nicht-infekti¨oser Genese differenti-aldiagnostisch in Frage. Zu den viralen Differentialdiagnosen geh¨oren die Afrikanische Schweinepest (ASP), porzine Circovirusinfektionen (PCV-2), porzine Parvovirusinfektio-nen (PPV), porzine Influenza, InfektioParvovirusinfektio-nen mit dem porziParvovirusinfektio-nen respiratorischen und repro-duktiven Syndrom Virus (PRRSV) und die Aujeszkysche Krankheit (SHV-1 Infektionen).
Eine klinische Diagnose ist aufgrund der Vielzahl m¨oglicher Differentialdiagnosen unm¨oglich und rechtlich als alleiniges Entscheidungskriterium der Seuchenfeststellung nicht zul¨assig.
Sowohl f¨ur die routinem¨aßige ¨Uberwachung der Schweinepopulation als auch zur schnellen und verl¨asslichen Detektion und Kontrolle eines KSP-Ausbruchs ist daher eine moderne und effiziente Labordiagnostik von herausragender Bedeutung.
Zu den schnellsten und empfindlichsten Methoden des Virusgenomnachweises geh¨ort die Polymerasekettenreaktion (PCR), die es in so genannten multiplex Ans¨atzen zudem ge-stattet, verschiedene Erreger gleichzeitig, und bei Nutzung fluoreszierend markierter
Son-131
den, in Echtzeit (
”real-time“) zu detektieren.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer multiplex real-time PCR eine moderne und schnelle Nachweismethode differentialdiagnostisch relevanter viraler Erreger zu Pestivirusinfektionen entwickelt. Aufgrund der Anzahl der zu detektierenden Erregergenome erfolgte die Umsetzung in einem so genanntenmultitube Ansatz. Die Kom-bination der Erreger in den Ans¨atzen erfolgte unter Ber¨ucksichtigung der erregerspezifi-schen Eigenschaften und der Relevanz des Erregers.
F¨ur die PCR Ans¨atze wurden folgende Kombinationen gew¨ahlt: ASPV und SHV-1, PPV und PCV-2, porzine Influenza und Pestiviren sowie die beiden St¨amme des PRRSV. Als interne Kontrolle wurde das housekeeping gene beta-Aktin gew¨ahlt. Nach der Entwick-lung spezifischer Primerpaare und TaqMan-Sonden, wurden die entsprechendenreal-time PCRs zun¨achst einzeln und dann in den vorgesehenen Kombination getestet und opti-miert. Eine bereits publizierte real-time PCR zum Nachweis und zur Diskriminierung amerikanischer und europ¨aischer PRRSV-St¨ammen (Kleiboeker et al., 2005) wurde
¨ubernommen und in das Gesamtkonzept integriert. Alle PCR-Reaktionen wurden mit ei-nem einheitlichen Thermoprofil durchgef¨uhrt. Die Validierung der neu etablierten PCRs erfolgte nach OIE Kriterien.
Die analytische Sensitivit¨at der PCRs wurde in infekti¨osen Einheiten bzw. Genom¨aqui-valenten bestimmt und erwies sich im Vergleich zu dem Virusnachweis in Zellkultur als
¨uberlegen bzw. in Einzelf¨allen als gleichwertig. Die Spezifit¨at der Primer und TaqMan-Sonden wurde mittels einer umfangreichen BLAST-Suche sichergestellt. Klinische Proben, welche die genetische Variabilt¨at der Erreger und die epidemiologische Situation wider-spiegelten, wurden in die Testung der PCRs einbezogen.
Der entwickelte PCR-Ansatz bietet die M¨oglichkeit einer schnellen und sicheren labordia-gnostischen Differentialdiagnose der KSP. In der gew¨ahlten Konzeption k¨onnte er zudem ein wichtiges Bindeglied darstellen, wenn es um den Ausschluss der KSP ohne konkre-ten Seuchenverdacht geht. Das vorliegende Konzept unter Verwendung eines einheitlichen Thermoprofils bietet zudem den Vorteil, dass das Testsystem beliebig um weitere relevante Erreger erweitert werden kann, ohne die restlichen Ans¨atze zu beeinflussen.
Andreas Gavrilenko
Development of realtime multiplex multitube RT-PCR for differential diagno-sis of classical swine fever
Classical swine fever (CSF) is an economically important viral disease of domestic pigs worldwide. It is notifiable to the OIE. The causative agent, classical swine fever virus (CSFV), is an enveloped RNA-virus which belongs to the family Flaviviridae, genus Pes-tivirus.
The clinical picture is highly variable and often unspecific. For this reason, many other viral, bacterial and non-infectious diseases have to be considered as differential diagnoses.
The diseases caused by viruses are African swine fever (ASF), porcine circovirus (PCV-2) infections, porcine parvovirus (PPV) infections, porcine influenza, porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), and Aujeszky´s disease (caused by suid herpesvirus type one, SHV-1). Diagnosis based on clinical signs alone is neither possible nor legitima-te. As a consequence, a fast and reliable laboratory diagnosis is of utmost importance, both for surveillance and in case of an CSF outbreak. Polymerase chain reaction (PCR) is one of the fastest and most sensitive methods for the detection of viral genomes. The use of fluorescent labelled probes enables detection of multiple targets using multiplex real-time PCR.
In this project a rapid and reliable test based onreal-time multiplex reverse transcription (RT) PCR for differential diagnosis of CSFV was developed. Due to limitations of simul-taneously detectable fluorescent dyes, the assay was designed as multitube test. The com-bination of pathogens within the assay was designed under consideration of
pathogens’-133
specific characteristics and their relevance.
The following combinations were selected: ASFV and SHV-1, PPV and PCV-2, porcine Influenza and Pestiviruses, as well as PRRSV strains. Beta-actin housekeeping gene was chosen as internal control. After designing specific primers and TaqMan probes, the real-time RT-PCRs were tested individually and subsequently optimized in the determined combinations. An already published real-time PCR for the detection and discrimination of American and European PRRSV strains (Kleiboeker et al., 2005) was integrated in the assay. For all PCR reactions a uniform thermal profile was developed. The assay was validated according to OIE validation criteria. The analytical sensitivity of the PCRs was determined and expressed as infectious units and/or genome equivalents. It proved to be superior or at least equivalent (for single PCRs) in comparison to virus isolation in cell culture. Specificity of primers and probes was assured by means of an extensive BLAST search. Clinical samples reflecting the genetic variability of the pathogens and the epidemiological situation, were included in the evaluation of the PCRs.
The developed multiplex PCR provides a fast and reliable tool for differential diagnosis of CSF. The selected concept could be an important link in terms of exclusion of CSF without concrete epidemic suspicion. Furthermore, the uniform thermal profile offers the opportunity to include additional relevant PCR targets without affecting the other PCRs.
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