Design und Optimierung einer PCR

2.4.4.1 Auswahl der nachzuweisenden Genomregionen

Zum Nachweis von Viren mittels PCR werden spezifische Genomabschnitte ausgew¨ahlt.

Dabei sollten die Primerbindungsstellen m¨oglichst hoch konserviert sein, d.h. die Genom-sequenzen d¨urfen keine, bzw. nur wenige Unterschiede zwischen Vertretern einer Erreger-spezies aufweisen. Bei den viralen Erregern stellen nicht kodierende Genomregionen oder auch Gene f¨ur Nichtstrukturproteine – also Abschnitte, die geringerem Evolutionsdruck unterliegen, h¨aufig geeignete Bereiche dar (Bel´ak und Thoren, 2001).

2.4.4.2 Primer- und Sondendesign

Die optimale Produktl¨ange f¨ur diereal-timeRT-PCR liegt zwischen 80 und 100 bp (Bustin, 2000). Es ist auch m¨oglich eine TaqMan-PCR mit Produktl¨angen bis 400 bp durchzuf¨uhren (Bustin und McKay, 1999), doch k¨urzere Fragmente werden effektiver amplifiziert und sind toleranter in Bezug auf die Reaktionsbedingungen. Dies ist darauf zur¨uckzuf¨uhren, dass die k¨urzeren Fragmente leichter denaturieren, und so leichter von Primern und Son-den gebunSon-den werSon-den. Die Amplifikationsrate der Taq-Polymerase betr¨agt zwischen 30-70 Basen/sec (Jeffreys et al., 1988), und so sind 15 sec ausreichend f¨ur den Amplifika-tionsschritt (Bustin, 2000).

Beim Primerdesign m¨ussen vor allem folgende Kriterien ber¨ucksichtigt werden: die Schmelz-temperatur (Tm), die Amplifikatgr¨oße und die Lokalisation der TaqMan-Sonde. Die Schmelz-temperatur ist definiert als diejenige Temperatur, bei der die Helixstruktur (zwischen Primer und Zielstrang) zur H¨alfte verloren gegangen ist. Sie ist abh¨angig von der Basen-zusammensetzung und wird nach Baldino et al. (1989) wie folgt berechnet:

Tm = 81,5 + 16,6(log10[J⁺]) + 0,41( %G+C)−(675/n)

J = Konzentration monovalenter Kationen in mol/l

( % G + C) = Anteil der Basen Cytosin und Guanin in Prozent n = Anzahl der Nukleotide

Die optimale Primerl¨ange betr¨agt ca. 18-25 Basen (bis 30 b), der G/C-Gehalt sollte zwi-schen 20 % und 70 % liegen und die Schmelztemperatur eines Primerpaares nicht mehr als ein bis zwei ^◦C von der angestrebten Temperatur (60^◦C bei TaqMan-PCRs) abwei-chen (Bustin, 2000). ¨Ublicherweise werden die Primer in Konzentrationen von 50 nM bis 300 nM eingesetzt. Zu hohe Primerkonzentrationen beg¨unstigen die Bildung von Primer-Dimern und unspezifischen Produkten, zu niedrige Konzentrationen resultieren in herab-gesetzter Sensitivit¨at der PCR.

Das Sondendesign unterscheidet sich nicht wesentlich von dem der Primer. Wie Bustin (2000) beschreibt, sollte die Sonde ca. 30 Basen lang sein und eine um ca. 10^◦C h¨ohere Schmelztemperatur als die Primer besitzen.

Die Auswahl der Reporterfarbstoffe ist in erster Linie von den detektierbaren Lichtwel-lenl¨angen des real-time PCR-Ger¨ates abh¨angig. Im Falle einer multiplex real-time PCR m¨ussen die Emissions- und Anregungsspektren verschiedener Farbstoffe weit genug von-einander getrennt sein (s. Abbildung 2.13), damit keine Interferenzen bei der Fluores-zenzmessung entstehen (Bustin und Nolan, 2004a; Bente, 2003). Die verschiedenen Reporterfarbstoffe ben¨otigen ensprechende Quencher. In derreal-time multiplex PCR ha-ben sich nichtfluoreszierende Quencher⁸ bew¨ahrt. Die so genanntenBlack Hole Quencher (BHQ^TM-1, BHQ^TM-2 und BHQ^TM-3; Biosearch Technologies, Novato, USA) besitzen kei-ne Eigenfluoreszenz und geben das aufgenommmekei-ne Licht als W¨arme ab (Parkhurst und Parkhurst, 1995a,b). Die Aufnahmespektren betragen bei BHQ^TM-1 480-580 nm, BHQ^TM-2 550-650 nm und bei BHQ^TM-3 620-730 nm.

Informationen ¨uber weitere Parameter und Richtlinien, die beim Primer- und Sonden-design zu beachten sind, sind bei M¨ulhard (2002); Bustin und Nolan (2004d) und Bente (2003) zu finden.

2.4.4.3 Ermittlung von DNA-Sekund¨arstrukturen

F¨ur eine effiziente Amplifikation der Ziel-DNA spielen Sekund¨arstrukturen, die die DNA bei der Anlagerungstemperatur (Annealing) ausbildet, eine wichtige Rolle. Wichtig ist da-bei, dass das 3^′-Ende der Primer an einem m¨oglichst linear vorliegenden Teil der Matrize

8Eine ¨Ubersicht von Quenchern ist beiBustinundNolan(2004a) oder im WWW zu finden.

450 500 550 600 650 700 750

Cy2 JOE TAMRA Cy5

FAM HEX ROX Cy7

TET Cy3 Texas Red

Abbildung 2.13: Emissonsspektren verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe

bindet, um eine problemlose Anlagerung der Polymerase zu gew¨ahrleisten (Peterset al., 2004). Zuker (2003) entwickelte, basierend auf den Erkenntnissen von SantaLucia (1998) zu DNA-Sekund¨arstrukturen unter verschiedenen thermodynamischen Bedingun-gen ein Programm (mFold), welches die ¨Uberpr¨ufung der m¨oglichen Sekund¨arstrukturen der Matrizen-DNA bei einer gegebenen Temperatur und Reaktionsbedingungen gestattet.

Dieses Programm ist frei zug¨anglich unterhttp://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold.

2.4.4.4 Optimierungsschritte

Die Optimierungsschritte spielen bei der Entwicklung einer PCR, vor allem einer multi-plex PCR, eine wichtige Rolle (Nolan, 2004). Der Einsatz von optimierten Primer- und Sondenkonzentrationen erlaubt eine Reduktion der Konzentration im Ansatz, was wie-derum die Sensitivit¨at und Spezifit¨at erh¨oht. Nicht zuletzt spielt der finanzielle Faktor eine wichtige Rolle (Brissonet al., 2004). Die Optimierungsschritte erfordern den Einsatz geeigneter Ziel-DNA, meistens sind es gereinigte PCR-Produkte oder linearisierte Plasmi-de mit klonierten Zielsequenzen (s. 3.2.2.7). Nicht linearisierte zirkul¨are PlasmiPlasmi-de stellen kein geeignetes Ziel dar (Nolan, 2004). Nachdem die Identit¨at des Amplifikats gesichert ist (s. 2.4.1), werden die optimalen Primerkonzentrationen mit Hilfe von SYBR^TM-Green real-time PCRs ermittelt (s. 3.2.2.4.2). Dies hat zum Ziel die Primerkonzentrationen zu

ermitteln, bei denen die Template-DNA (bzw. cDNA) am effektivsten amplifiziert wird (Nolan, 2004). Anschließend werden die optimalen Konzentrationen f¨ur die Sonde ermit-telt; je niedriger der Ct-Wert und je h¨oher der ∆Rn-Wert, umso besser funktioniert die Sonde (Peters et al., 2004; Nolan, 2004). Doch die Fluoreszenz- und Ct-Werte alleine geben keine Auskunft ¨uber die Effizienz und die Kinetik der PCR. Die Erstellung einer Standardkurve kann weitere Informationen ¨uber Effizienz, Sensitivit¨at und Genauigkeit der PCR geben (Higuchi et al., 1993; Bustin, 2000). Zur Erstellung der Standardkur-ve werden die ermittelten C_t-Werte der Standardverd¨unnung gegen ihre logarithmische Konzentration (z. B. Kopienzahl) aufgetragen. Die Neigung der Standardkurve korelliert mit der Effizienz der PCR und wird nach folgender Formel berechnet:

Effizienz= [10^(−1/slope)]−1

slope = Neigung der Standardkurve

Wenn die Effizienz der PCR bei 100 % liegt, betr¨agt die Neigung der Standardkurve -3,32 (Bustin, 2000; Bustin und Nolan, 2004b). Das Bestimmheitsmaß - R² (Pearson Correlation Coefficient), ausgedr¨uckt als eine Zahl zwischen null und eins, gibt Auskunft, wie nah einzelne Komponenten in einem mehrfach Ansatz dem Mittelwert sind. Anhand dieser Kriterien werden die einzelnen PCRs beurteilt und ggf. optimiert.