Nukleins¨aureisolierung

F¨ur die Nukleins¨aureisolierung aus den unterschiedlichen Untersuchungsmaterialien wur-den verschiewur-dene kommerziell erh¨altliche Systeme nach Herstellerangaben eingesetzt.

3.2.2.1.1 RNA Isolierung aus Zellkultur und Serum

F¨ur die RNA Extraktion aus dem Zellkultur¨uberstand wurde der High Pure Viral RNA Kit der Fa. Roche, Mannheim (s. Anhang A.2) verwendet. Der Kit funktioniert nach fol-gendem Prinzip. Nach der Lyse des eingesetzten Materials mit einem Detergenz wird die virale RNA freigesetzt. Danach bindet die virale RNA in Anwesenheit chaotroper Sal-ze selektiv an Glasfasern im MikroSal-zentrifugen-R¨ohrchen. Die RNA bleibt w¨ahrend der folgenden Waschschritten an die Membran gebunden. Schließlich wird die RNA mittels Elutionspuffer von der Membran gel¨ost.

Im Einzelnen wurden folgende Schritte durchgef¨uhrt. Die Arbeitsl¨osung wurde herge-stellt, indem aliquotiertepoly(A) carrier RNAmit 2,5 ml Bindepuffer versetzt wurde. An-schließend wurden 200µl Zellkultur¨uberstand mit 400µl Arbeitsl¨osung gemischt, 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und danach auf das Mikrozentrifugen-R¨ohrchen mit Glasfasern gegeben. Im Folgenden wurde 15 sec bei 13000×g zentrifugiert, 500 µl Inhi-bitor Removal Puffer auf die S¨aule gegeben und erneut eine min bei 8000×g zentrifu-giert. Danach wurde die S¨aule zwei Mal mit 450 µl Waschpuffer gewaschen und eine min bei 8000×g zentrifugiert; schließlich noch Mal 10 sec bei 13000×g zentrifugiert. Der Durchlauf und das Auffanggef¨aß wurden verworfen, die S¨aule in ein 1,5 ml Reaktionsgef¨aß uberf¨uhrt. Die RNA wurde mit 50¨ µl Elutionspuffer eluiert und das Gef¨aß eine min bei 13000×g zentrifugiert. Die RNA wurde sofort in ein Eisbad gestellt und in der reversen Transkription eingesetzt oder bei −80^◦C eingefroren.

3.2.2.1.2 RNA-Isolierung aus Organmaterial und Blut

Die RNA-Isolierung aus Organ- und zellhaltigem Material erfolgte mit Hilfe desRNeasy^R Lipid Tissue Kits.

Der Kit basiert auf der Phenol-Chloroform Extraktion mit anschließender

Gesamt-RNA-Isolierung ¨uber Silica-Gel-Membran. Dabei lysiert dasQIAzol-Reagenz (ein Phenol-Guanidin-Isothiocyanat-Gemisch) das Probenmaterial. Nach Zugabe von Chloroform und darauf folgender Zentrifugation trennt sich die L¨osung in w¨assrige und organische Phasen. Die die RNA befindet sich in der oberen w¨assrigen Phase, die DNA in der mittleren und Proteine in der unteren, organischen, oder in der mittleren Phase. Aus der oberen Phase wird anschließend die RNA ¨uber die Silica-Gel-S¨aule isoliert, und dabei durch mehrfaches Waschen von Verunreinigungen befreit. Die Isolierung erfolgte geringgradig modifiziert nach dem Protokoll des Herstellers, das folgende Schritte vorsah:

Ein etwa erbsengroßes Gewebest¨uck wurde steril entnommen, zerkleinert und in ein 1,5 ml Reaktionsgef¨aß ¨uberf¨uhrt. Unter Zugabe von 750 µl QIAzol-Reagenz wurde das Gewe-best¨uck mit einem Mikropistill homogenisiert. Nach 5 min Inkubation bei Raumtempe-ratur wurden 200 µl Chloroform zugegeben und 15 sec gesch¨uttelt. Es folgten drei min Inkubation bei Raumtemperatur und anschließend 15 min Zentrifugation bei 12000×g und 4^◦C. Durch die Zentrifugation trennte sich die Probe in drei Phasen, eine obere farblose, w¨assrige, eine mittlere weiße und eine untere rote, organische Phase. Die RNA befand sich in der oberen Phase.

Die obere Phase (max. 600 µl) wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgef¨aß ¨uberf¨uhrt, ein Volu-men¨aquivalent (600µl) 70 %iges Ethanol zugegeben und beides vermischt. Darauf folgend wurden bis zu 700µl des Gemisches auf die RNeasy S¨aule gegeben und 15 sec bei 8000×g zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen. Der Schritt wurde nochmal ein Mal wie-derholt. Danach wurden 700 µl Puffer RW1 auf die RNeasy-S¨aule gegeben und 15 sec bei 8000×g zentrifugiert. Es schloss sich ein zweimaliger Waschschritt mit 500 µl RPE-Puffer und eine Zentrifugation f¨ur 15 sec bei 8000×g an. Der Durchlauf wurde jeweils verworfen. Danach wurde die S¨aule auf ein neues 1,5 ml Reaktionsgef¨aß gesetzt und 30µl RNase-freies Wasser auf die Membran der S¨aule geben, f¨ur eine min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend eine min bei 8000×g zentrifugiert. Die eluierte RNA wurde sofort in ein Eisbad gestellt und entweder direkt in der reversen Transkription eingesetzt oder bei −80^◦C eingefroren.

3.2.2.1.3 DNA-Isolierung aus Zellkultur und Serum

Die DNA-Isolierung aus Zellkulturlysat und Serum erfolgte mit Hilfe desQIAamp^R DNA Mini Kits (A.2). Die Extraktion erfolgte nach Protokoll des Herstellers, das folgende

Schritte vorsah:

Die Probe wurde zun¨achst auf Raumtemperatur gebracht. Danach wurden und 200 µl der Probe in ein 1,5 ml Reaktionsgef¨aß mit 20 µl Proteinase K verbracht. Anschließend wurden 200 µl Puffer AL dazugegeben, gemischt und bei 57^◦C f¨ur 10 min inkubiert. Die Probe wurde kurz anzentrifugiert, bevor 200µl 96 %iges Ethanol dazugegeben und mit der Probe vermischt wurden. Das Gemisch wurde anschließend auf die QIAamp S¨aule in einem Reaktionsgef¨aß gegeben und bei 6000×g f¨ur eine min zentrifugiert (der Durchlauf und das Reaktionsgef¨aß wurden nach jedem folgenden Waschschritt verworfen und die S¨aule in ein neues Reaktionsgef¨aß gesetzt). Danach wurden 500 µl des Puffers AW1 auf die S¨aule gegeben und bei 6000×g f¨ur eine min zentrifugiert. Anschließend folgte 500µl des Puffers AW2, der wiederum auf die S¨aule gegeben und bei 13000×g f¨ur 3 min zentrifugiert wurde. Die S¨aule wurde auf ein 1,5 ml Reaktionsgef¨aß gesetzt, 200 µl des Puffers AE daraufgegeben und f¨ur eine min inkubiert. Anschließend folgte Zentrifugation bei 6000×g f¨ur eine min. Die eluierte DNA wurde direkt in der PCR eingesetzt oder bei −20^◦C eingefroren.

3.2.2.1.4 DNA Isolierung aus Organmaterial und Blut

F¨ur die DNA-Isolierung wurde der DNeasy^R Tissue Kit verwendet. Daf¨ur wurden ca.

25 µg Gewebe mit einer Skalpellklinge in kleine St¨ucke geschnitten, in ein 1,5 ml Reak-tionsgef¨aß verbracht und mit 180 µl Puffer ATL und 20 µl Proteinase K gemischt. Die Probe wurde nun bei 55^◦C bis zu kompletten Lyse des Materials (1-3 h) inkubiert. Nach kurzem Durchmischen wurden 200µl Puffer AL zu der Probe dazugegeben, gr¨undlich ge-mischt und bei 70^◦C f¨ur 10 min inkubiert; anschließend wurden 200 µl 96 %iges Ethanol dazupipettiert und nochmals gr¨undlich gemischt. Das Gemisch wurde auf eine DNeasy mini S¨aule gegeben und bei bei 6000×g f¨ur eine min zentrifugiert. Der Durchlauf und das Reaktionsgef¨aß wurden nach jedem Waschschritt verworfen und die S¨aule in ein neues Reaktionsgef¨aß gesetzt. Danach wurden 500µl des Puffers AW1 auf die S¨aule gegeben und bei 6000×g f¨ur eine min zentrifugiert. Anschließend wurden 500µl des Puffers AW2 auf die S¨aule gegeben und bei 13000×g f¨ur 3 min zentrifugiert. Die S¨aule wurde in ein neues 1,5 ml Reaktionsgef¨aß gesetzt, 200 µl des Puffers AE daraufgegeben und f¨ur eine min ste-hen gelassen. Anschließend wurde sie bei 6000×g f¨ur eine min zentrifugiert. Die eluierte DNA wurde direkt in der PCR eingesetzt oder bei −20^◦C eingefroren.