4.3 Validierung
4.3.3 Klinische Proben
Zus¨atzlich zu den oben aufgef¨uhrten, im Rahmen der Spezifit¨atsstudien untersuchten Virusisolaten und Organmaterialien, wurden im Rahmen der weiteren PCR-Validierung experimentell gewonnene Proben aus dem EURL sowie klinische Proben aus der Routi-nediagnostik der Außenstelle f¨ur Epidemiologie der TiHo Hannover in Bakum getestet.
Alle Untersuchungen fanden mit der endg¨ultigen Version des multiplexmultitube Ansat-zes statt. Die Auswahl wurde aus dem vorhandenen Probenmaterial zuf¨allig getroffen.
Es wurden insgesamt 17 Proben untersucht, die von Schweinen stammten, die am EURL experimentell mit verschiedenen KSPV- bzw. BDV-St¨ammen infiziert und anschließend mit den Routinemethoden des EURL zum Virus- und Antik¨orpernachweis untersucht worden waren. Die Tiere dieser Versuchsvorhaben stammten aus dem Lehr- und For-schungsgut Ruthe und waren im Vorfeld der Versuche ausschließlich auf Pestivirenfreiheit untersucht worden. Ein Teil des Probenmaterials stammte von diesen Probennahmen vor der Infektion und war somit vorberichtlich KSPV, BDV und BVDV negativ. Eine Probe mit der Bezeichnung ZA4 stammte aus einem KSPV-Ausbruch in S¨udafrika im Jahr 2005.
In dieser Probe wurde vorberichtlich KSPV mittels PCR und Virusisolierung nachgewie-sen. In Tabelle 4.6 sind die Ergebnisse der Untersuchungen der oben aufgef¨uhrten Proben zusammenfasst. Alle vorberichtlich KSPV-positiven Tiere konnten in der multiplex PCR erkannt werden, wobei das Probenmaterial eines mit CSF0309 (Stamm Kanagawa) infi-zierten Schweins nicht eindeutig beurteilt werden konnte, da es sowohl schwach positive Ergebnisse mit hohen Ct-Werten als auch negative Resultate ergab. Alle Proben, die vor der Infektion entnommen worden waren, konnten korrekt als negativ best¨atigt werden.
Die Detektion des BDV-Stamms Gifhorn 10754 in der Probe eines vorberichtlich positiven Schweins gelang nicht. In Organmaterialien von drei Tieren konnte PCV-2 nachgewiesen werden. Die Tests f¨ur alle anderen Viren verliefen negativ.
Die 33 Proben aus der Außenstelle f¨ur Epidemiologie waren im Vorfeld auf verschiede-ne porziverschiede-ne Viren und andere Pathogeverschiede-ne untersucht worden. Erwartungsgem¨aß wurden hier weder ASPV, SHV-1 noch Pestiviren festgestellt (s. Tabelle 4.7). 21 von 33 Proben (64 %) wurden in der PCV-2-spezifischen PCR positiv getestet. Im Vergleich mit den Er-gebnissen der Untersuchungen der Außenstelle f¨ur Epidemiologie, die f¨ur 16 der Proben vorlagen, zeigte sich, dass es acht Abweichungen von den dort erhobenen Befunden gab.
Die Abweichungen betrafen v. a. dort als fraglich befundete Proben. F¨unf dieser fraglichen Proben wurden in der hier verwendeten PCR als positiv detektiert, zwei als negativ. Eine Probe wurde in Bakum negativ, mit der hier entwickelten PCR jedoch positiv getestet.
Die PPV-spezifische PCR detektierte zwei der 33 Proben als positiv (6 %), ein Vergleich mit Ergebnissen anderer Untersuchungsstellen war in diesem Fall nicht m¨oglich. Neun von 33 Proben (27 %) wurden mit der entwickelten Influenza-A-spezifischen PCR positiv getestet. Ein Vergleich mit den Ergebnissen der Außenstelle f¨ur Epidemiologie war f¨ur drei Proben m¨oglich. Es zeigte sich eine Abweichung insofern, dass eine dort als positiv getestete Probe im vorliegenden Ansatz negativ war. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendeten PRRSV-spezifischen PCRs ergaben drei (9 %) positive Ergebnisse f¨ur PRRSV-EU und vier positive Ergebnisse f¨ur PRRSV-NA (12 %). Der Vergleich mit Befunden aus Bakum war f¨ur zwei PRRSV-EU-Befunde und einen PRRSV-NA-Befund m¨oglich. F¨ur PRRSV-EU ergaben sich keine Abweichungen, die PRRSV-NA-Befunde wi-chen voneinander ab. W¨ahrend die Probe in Bakum als positiv befunden wurde, zeigte sie in der vorliegenden PCR ein negatives Ergebnis.
Die oben genannten Ergebnisse schließen Proben mit ein, deren Ergebnisse f¨ur mehr als ein Virus positiv ausfielen. Insgesamt wurden mit der hier entwickelten PCR 12 Proben (36 %) doppelt positiv und eine Probe (3 %) dreifach positiv getestet. Die dreifach positi-ve Proben gab positipositi-ve Ergebnisse f¨ur PCV-2, Influenza-A-Virus und PRRSV-NA. Diese Probe war auch in Bakum auf PCV-2 und Influenza-A-Virus positiv getestet worden, ein Ergebnis f¨ur PRRSV-NA lag f¨ur einen Vergleich nicht vor. Bei den doppelt positiven Proben ergaben vier Proben (12 %) positive Ergebnisse f¨ur PCV-2 und Influenza-A-Virus, zwei Proben (6 %) positive Ergebnisse f¨ur PCV-2 und PRRSV-NA, zwei Proben (6 %)
po-sitive Ergebnisse f¨ur PCV-2 und PPV, drei Proben (9 %) popo-sitive Ergebnisse f¨ur PCV-2 und PRRSV-EU und eine Probe die Ergebniskombination PRRSV-NA und Influenza-A-Virus.
Ein Vergleich mit den Ergebnissen aus Bakum war f¨ur die doppelt positiven Proben nur teilweise m¨oglich, da nicht alle Erreger, die mit der vorliegenden PCR detektiert wurden, auch dort in die Tests einbezogen wurden. Im Detail wurde eine vorberichtlich PCV-2 fragliche Probe in der multiplex-PCR PCV-PCV-2 und Influenza-A-Virus positiv getestet.
Eine andere, vorberichtlich PCV-2 und Influenza-A-Virus positive Probe wurde mit der vorliegenden PCR als PCV-2 und PRRSV-NA positiv, jedoch Influenza-A-Virus negativ detektiert. Eine weitere, vorberichtlich PCV-2 positive Probe wurde hier zus¨atzlich PPV positiv getestet. Das Ergebnis einer PCV-2 und Influenza-A-Virus positiven Probe konnte best¨atigt werden. F¨ur eine PCV-2 und Influenza-A-Virus positive Probe lag aus Bakum ausschließlich ein PRRSV-EU negatives Ergebnis vor, das mit der hier verwendeten PCR best¨atigt werden konnte. Eine vorberichtlich PCV-2 fragliche Probe wurden im vorliegen-den Ansatz PCV-2 und PRRSV-EU positiv detektiert. In einer weiteren PCV-2 positiven Probe konnte neben diesem Erreger auch PRRSV-NA gefunden werden.
alidierung101 Lehr- und Forschungsgut Ruthe, die im Rahmen verschiedener Tierversuche am EURL eingesetzt wurden. Die mit 0 dpi (Tagepost
infectionem) gekennzeichneten Proben sind als vorberichtlich pestivirennegativ anzusehen. UnterIsolat sind jeweils die eingesetzten Pestiviren-Isolate aufgef¨uhrt.
Probe Nr.: Isolat ASPV SHV-1 PCV-2 PPV Pestiviren Influenza-A PRRSV-EU PRRSV-NA
ZA4 CSF0849 − − + − + − − −
287 CSF0849 − − − − + − − −
284 CSF0849 − − + − + − − −
282 CSF0905 − − + − + − − −
272 CSF0634 − − − − + − − −
270 CSF0647 − − − − + − − −
266 CSF0309 − − − − − − − −
237 CSF0695 − − − − + − − −
217 CSF0634 − − − − + − − −
217 (0 dpi) negativ − − − − − − − −
216 (0 dpi) negativ − − − − − − − −
209 CSF0905 − − − − + − − −
208 CSF0905 − − − − + − − −
100 (0 dpi) negativ − − − − − − − −
99 (0 dpi) negativ − − − − − − − −
80 (0 dpi) negativ − − − − − − − −
219 BDV-Gifhorn − − − − − − − −
4.Ergebnisse f¨ur Epidemiologie, Bakum. Die mit der real-time multiplex multitube PCR erzielten Ergebnisse sind unter A, die Ergebnisse der
Voruntersuchungen unterB angegeben. Die nicht abgedeckten Erreger sind als N/D (nicht durchgef¨uhrt) gekennzeichnet. Ein
”?“
steht f¨ur ein vorberichtlich als
”fraglich“ bezeichnetes Ergebnis.
Probe Nr.: ASPV SHV-1 PCV-2 PPV Pestiviren Influenza-A PRRSV-EU PRRSV-NA
A B A B A B A B A B A B A B A B
1 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − − − − − −
2 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D + N/D − − − −
3 − N/D − N/D − ? − N/D − N/D − − − − − −
4 − N/D − N/D + + − N/D − N/D + + − − + −
5 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − + − − + −
6 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − − − − − −
7 − N/D − N/D − − − N/D − N/D − − − − − −
8 − N/D − N/D − − − N/D − N/D − − − − − −
9 − N/D − N/D − − − N/D − N/D − − − − − −
10 − N/D − N/D − ? − N/D − N/D − − − − − −
11 − N/D − N/D − − − N/D − N/D + − − − − +
12 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − − + − −
13 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − − − − −
14 − N/D − N/D + + − N/D − N/D − − − − − −
15 − N/D − N/D − ? − N/D − N/D + − − − − −
Fortsetzung auf der n¨achsten Seite
alidierung103 Probe Nr.: ASPV SHV-1 PCV-2 PPV Pestiviren Influenza-A PRRSV-EU PRRSV-NA
A B A B A B A B A B A B A B A B
16 − N/D − N/D + + + N/D − N/D − N/D − N/D − N/D
17 − N/D − N/D + + − N/D − N/D + + − − − −
18 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D − − − − − −
19 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − − − − −
20 − N/D − N/D + N/D + N/D − N/D − − − N/D − N/D
21 − N/D − N/D + N/D − N/D − N/D + − − N/D − N/D
22 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D
23 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D
24 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D + − − N/D + N/D
25 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D
26 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − − N/D − N/D
27 − N/D − N/D − + − N/D − N/D + − − − − −
28 − N/D − N/D + − − N/D − N/D + − − + − −
29 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D − − + − − −
30 − N/D − N/D + ? − N/D − N/D − − − − + −
31 − N/D − N/D − + − N/D − N/D − − − − − −
32 − N/D − N/D − N/D − N/D − N/D − − + N/D − N/D
33 − N/D − N/D + − − N/D − N/D − − + − − −