Entwicklung einer PCR zum Nachweis von Rhodococcus equi auf

Die in der Literatur beschriebenen PCR-Methoden zum Nachweis von Rhodococcus equi basieren meist nur auf der Basis der 16S-rRNA (BELL et al. 1996, SELLON et al. 1996) oder auf der Basis des virulenzassoziierten Plasmids (HAITES et al. 1997, TAKAI et al. 1995a). In der Veröffentlichung von NAVAS et al. (2001) wurde eine PCR auf der Grundlage des Enzyms Cholesteroloxidase (ChoE) beschrieben. Mittels Datenbankanalyse konnte jedoch gezeigt werden, dass das ChoE-Gen große Homologien mit Brevibacterium sterolicum und Streptomyces coelicolor aufwies und die von NAVAS et al. (2001) beschriebenen Primersequenzen (COX-F/R) in der NCBI-Datenbankanalyse eine vollständige Übereinstimmung mit Brevibacterium sterolicum erbrachten. Im Rahmen dieser

Untersuchungen konnten weder nach beschriebenem noch nach modifiziertem PCR-Protokoll in der ChoE-PCR die gewünschte Amplifikatgröße produziert werden. Auch der Einsatz von modifizierten Primern änderte das Bild von Banden in anderen Größenordnungen und letztendlich auch von einer positiven PCR-Negativkontrolle nicht.

Aufgrund der oben beschriebenen Probleme in der Durchführung der PCR und der genannten Sequenzhomologien zu den oben genannten Erregern erwies sich das ChoE-Gen als Target für eine PCR für den routinediagnostischen Einsatz als ungeeignet. Im Rahmen der Arbeiten gelang es nicht eine PCR auf der Basis des ChoE-Genes zu etablieren; Kontaminationen und Produkte in anderen Größenordnungen zeigten sich nämlich bei allen durchgeführten Untersuchungen.

Primer der von BELL et al. (1996) und SELLON et al. (1996) beschriebenen 16S-rRNA PCR ergaben in der Sequenzdatenbankanalyse eine 100 %ige Übereinstimmung auf Nukleotidbasis gegenüber verschiedenen Nocardia spp. Wie den Ergebnissen (s. Kapitel 4.4.1.2) zu entnehmen ist, eignete sich diese PCR lediglich zur Speziesidentifizierung von Isolaten: 119 der 123 Isolate erzielten ein positives Amplifikat. Bei der Untersuchung der aus dem Jahre 2003 stammenden Proben ließ sich für die PCR gegenüber der Klinik nur eine Sensitivität von 14 % bzw. gegenüber der Kultur von 19 % ermitteln. Mit den im Jahr 2004 entnommenen TBS- und Nasentupfern konnte in keinem Fall ein positives PCR-Ergebnis erzielt werden, obwohl 19 bzw. 20 der Proben von klinisch kranken Tieren stammten. Die 16S-PCR zeigte mit allen Tupfer- und TBS-Proben nur Amplifikate, die nicht die spezifische Größe von 441 bp erzielten. Auch Veränderungen des PCR-Ansatzes bzw. der PCR-Bedingungen erbrachten keine Verbesserung der Resultate.

Die Ergebnisse insbesondere die äußerst niedrige Sensitivität zeigten, dass sich die 16S-PCR nicht für den routinediagnostischen Einsatz von diagnostischem Material, sondern lediglich zur Speziesidentifizierung von Isolaten eignet.

TAKAI et al. (1995a) entwickelte eine PCR auf der Basis des virulenzassoziierten Plasmids (VapA) mit einer Amplifikatgröße von 564 bp.

Wie später von einigen Autoren (BYRNE et al. 2000 und HAITES et al. 1997) beschrieben, ist die Gegenwart des VapA-Plasmids essentiell für die Virulenz und für das intrazelluläre Überleben des Erregers. Demzufolge sind Rhodococcus equi-Stämme, die kein Plasmid tragen, avirulent. Bei hohen Temperaturen und niedrigem pH-Wert wird das VapA-Gen aufreguliert. Subkultivierungen der Plasmid tragenden Stämme bei 37°C führen zum Verlust

des Plasmids. Der mögliche Verlust des Plasmids stellt somit auch einen gewissen Nachteil für die Nutzung als Target für eine routinediagnostische PCR dar, wenn gleich allerdings mit dieser PCR neben dem Nachweis von Rhodococcus equi im Untersuchungsmaterial zugleich auch das Virulenzpotenzial bestimmt werden kann.

In der vorliegenden Untersuchung zeigte sich, dass durch Einfrier- und Auftauprozesse des Untersuchungsmaterials und auch des Eluates ein Verlust des Plasmids zu erkennen war. Von den erstmals in der VapA-PCR positiven Proben zeigten einige Proben in den Wiederholungsuntersuchungen kein Plasmid-spezifisches Amplifikat mehr. Insgesamt konnte in 101 der untersuchten 123 Isolate ein Plasmid nachgewiesen werden.

Bezugnehmend auf den klinischen Untersuchungsbefund ließ sich anhand der aus dem Jahr 2003 entnommenen Proben für die VapA-PCR eine Sensitivität von 43 % berechnen.

Gegenüber der kulturellen Untersuchung wies die VapA-PCR eine Sensitivität von 59 % auf.

Die Proben aus dem Jahr 2004 ergaben in der VapA-PCR deutlich weniger positive Ergebnisse gegenüber dem klinischen als auch gegenüber dem kulturellen Nachweis von Rhodococcus equi. Nasentupfer, insbesondere trockene Nasentupfer ergaben die meisten negativen Ergebnisse, woraus die schlechten Nachweisergebnissse für diese PCR resultierten.

Die VapA-PCR eignet sich zum Nachweis von virulenten Rhodococcus equi-Stämmen.

Gleichwohl werden Stämme ohne Plasmid oder Stämme, die aufgrund physikalischer Faktoren das Plasmid verloren haben, mit der VapA-PCR nicht detektiert. Aufgrund dessen ergab sich die Überlegung chromosomale Targets für den Einsatz in der Rhodococcus equi-spezifischen PCR einzusetzen, die möglicherweise mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind. Bis zum jetzigen Zeitpunkt liegen jedoch noch keine gesicherten Erkenntnisse über die Virulenzfaktoren von Rhodococcus equi und deren Einsatz in der routinediagnostischen PCR vor.

Das IupA-Gen gehört zu der Gruppe der ABC-Transportsysteme und besitzt eine hohe Affinität gegenüber Eisen. Da der Eisenhaushalt essentiell für die Lebensfunktion der Organismen ist und es sich bei den ABC-Transportern um konservierte Bereiche handelt, die spezifisch für Rhodococcus equi sind, kann das IupA-Gen als ein möglicher Virulenzfaktor in Betracht gezogen und als mögliches Target für eine routinediagnostische PCR angesehen werden (Accession no. AY426738).

Die IupA-PCR zeigte anhand der aus dem Jahr 2003 stammenden TBS-Proben eine Sensitivität von 52 % gegenüber der klinischen Untersuchung und lieferte mit den Proben des folgenden Jahres deutlich schlechtere, d.h. weniger positive Ergebnisse. Von den

mediumhaltigen Nasentupfern konnten 6 von 20 Proben und nur 3 von 20 trockenen Nasentupfern, die von klinisch kranken Fohlen stammten mittels PCR als Rhodococcus equi identifiziert werden. Die TBS-Proben des Jahres 2003 ergaben gegenüber der kulturellen Untersuchung für die IupA-PCR eine Sensitivität von 69 %. Die TBS-Tupfer des folgenden Jahres ergaben in 4 von 6 Fällen ein positives PCR-Ergebnis. Die Nasentupfer zeigten ähnlich wie in den anderen PCRs in der IupA-PCR kein positives Ergebnis. Die IupA-PCR erwies sich in den Untersuchungen als unempfindlich gegenüber Kontaminationen und zeigte insbesondere gegenüber der kulturellen Untersuchung unabhängig vom Zeitpunkt der entnommenen Proben vergleichbare Ergebnisse. Da es sich bei dem IupA-Gen um ein chromosomales Target und desweiteren bei dem ABC-Transporter um einen konservierten Bereich handelt, der möglicherweise aufgrund der Eisenaffinität Einfluß auf die Virulenz nimmt, kommt das IupA-Gen als Target für eine routinediagnostische PCR in Betracht.

Ein weiteres Target das Einfluß auf den Eisenhaushalt des Organismus nimmt, ist das IdeR-Gen. Die eisenabhängige VapA-Expression wird durch das IdeR-Gen kontrolliert (REN und PRESCOTT 2003). Somit erschien das IdeR-Gen für den Einsatz als Target in einer routinediagnostischen PCR vielversprechend. Die Ergebnisse der IdeR396- und der IdeR500-PCR variierten recht stark, insbesondere hinsichtlich der Sensitivität, die in der IdeR396 deutlich geringer war (s. Kapitel 4.5). Dagegen lag die Spezifität der IdeR396-PCR, d.h. die Wahrscheinlichkeit mit der ein gesundes Tier als gesund erkannt wurde, gegenüber der klinischen und der kulturellen Untersuchung fast immer bei 100 %. Bei der IdeR500-PCR lag die Spezifität immer bei 91 %. Die Primer dieser beiden PCRs unterscheiden sich in der Lokalisation ihrer Bindungstelle innerhalb des IdeR-Genes und in der Produktgröße.

Aufgrund der so geringen Sensitivität ist die IdeR396-PCR für den routinediagnostischen Einsatz jedoch nicht von Interesse. Von allen durchgeführten PCRs auf chromosomaler Ebene ergaben sich die schlechtesten Ergebnisse bei der Überprüfung der Isolate in der IdeR396-PCR. Somit zeigte sich, dass in diesem Fall nicht nur das Untersuchungsmaterial, sondern auch die Auswahl der Primer innerhalb eines Genes Einfluß auf das PCR-Ergebnis nehmen.

Die Sensitivität gegenüber der klinischen Untersuchung lag bei den Proben aus dem Jahr 2003 mit 57 % bei der IdeR500-PCR ungefähr doppelt so hoch wie bei der IdeR396-PCR. Ähnlich verhielt es sich auch gegenüber den Ergebnissen der kulturellen Untersuchung an den Proben des Jahres 2003: die IdeR500-PCR wies mit einer Sensitivität von 75 % ungefähr doppelt so hohe Ergebnisse wie die IdeR396 auf. Die Ergebnisse im Jahr 2004 sind wie bei allen anderen PCRs deutlich schlechter, insbesondere im Vergleich zu den klinischen

Untersuchungsergebnissen. Die IdeR500-PCR lieferte deutlich bessere Ergebnisse als die IdeR396-PCR, wobei sich Tracheobronchialsekret in beiden PCRs als das geeignetere Material darstellte (s. Kapitel 4.5). Das IdeR-Gen, das für ein eisenabhängiges Regulatorprotein codiert, reguliert den Eisenmetabolismus in Bakterien und kontrolliert die VapA-Expression. Somit ist das IdeR-Gen, das möglicherweise Einfluss auf die Virulenz hat, für die Entwicklung einer PCR auf chromosomaler Ebene von großer Bedeutung. Beide PCRs auf der Basis des IdeR-Genes stellten sich als sehr unempfindlich gegenüber möglichen Kontaminationen dar. Da die IdeR396-PCR deutlich schlechtere Ergebnisse hinsichtlich der Sensitivität zeigte als die IdeR500-PCR, ist ein Einsatz der IdeR500-PCR in der Routinediagnostik nach weiterer Optimierung wie beispielsweise der DNA-Extraktion möglich.

Die SugE-PCR auf der Basis des SugE-Gens, das als Suppressor-Gen von GroEL-Mutationen bei Escherichia coli und als Mitglied der „mulitdrug-resistance-family“ beschrieben wurde (CHUNG et al. 2002), wies in den durchgeführten Untersuchungen häufig Kontaminationsprobleme auf. Ständig zeigte sich das Bild einer positiven Negativkontrolle.

Die Nutzung neuer Reagentien zeigte nach Durchführung mehrere PCRs, insbesondere bei einem großen Probenpanel, erneut ein Amplifikat in der PCR-Negativkontrolle. Die Ergebnisse der PCR anhand der Proben des Jahres 2003 lagen gegenüber der klinischen Untersuchung bei ca. 64 % und gegenüber der kulturellen Untersuchung bei 72 %. Die PCR-Ergebnisse des Jahres 2004 zeigten gegenüber der klinischen Untersuchung deutlich schlechtere Ergebnisse, wobei der Rhodococcus equi-Nachweis mittels PCR aus TBS die besten Ergebnisse lieferte (s. Kapitel 4.5).

Obwohl die Ergebnisse der Sensitivität sehr gut erschienen, brachte diese PCR doch einige Probleme hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit mit sich. Aufgrund der vielen in der SugE-PCR als positiv befundeten Proben, stellt sich die Frage, ob man im Hinblick auf die häufigen Kontaminationen diesen Ergebnissen Glauben schenken kann oder ob es sich in der Mehrzahl um falsch positive Ergebnisse handelt.

Die Isocitratlyase ist das erste Enzym des Glyoxylatzyklus, welches für die Assimilation von Fettsäuren und Acetat erforderlich und somit essentiell für den Erreger ist.

Rhodococcus equi weist eine hohe Aktivität der Isocitratlyase hinsichtlich des Wachstums auf Acetat und Laktat auf (KELLY et al. 2002, REINSCHEID et al. 1994).

In den durchgeführten Untersuchungen zeigte die AceA500-PCR anhand der Proben des Jahres 2003 eine Sensitivität gegenüber der klinischen Untersuchung von 71 % und gegenüber der kulturellen Untersuchung eine Sensitivität von 81 %. Die Ergebnisse der Proben aus dem Jahr 2004 lagen deutlich unter den Werten des Vorjahres: Hinsichtlich der klinischen Untersuchung erbrachte die PCR anhand von mediumhaltigen Nasentupfern die meisten positiven Ergebnisse. 5 von 20 Proben die von klinisch kranken Tieren stammten wurden mittels PCR als Rhodococcus equi positiv beurteilt (s. Kapitel 4.5).

Gegenüber möglichen Kontaminationen zeigte sich die AceA500-PCR sehr unempfindlich.

Aufgrund der relativ hohen Ergebnisse hinsichtlich der Sensitivität zählt auch die AceA500 zu den in der PCR einsetzbaren Targets.

An den in Kapitel 4.5 dargestellten Ergebnissen zeigte sich, dass die IdeR500-PCR und die IupA-PCR die besten Ergebnisse hinsichtlich der Sensitivität und der Spezifität gegenüber den anderen Untersuchungsparametern lieferten. Die AceA500-PCR zeigte gegenüber der klinischen als auch gegenüber der kulturellen Untersuchungen am meisten positive Ergebnisse, doch war die Wahrscheinlichkeit mit der ein gesundes Tier als gesund erkannt wird (Spezifität) in der AceA500-PCR im Vergleich zur IdeR500 und der IupA-PCR geringer.

Somit deutet sich eine Kombination aus der IupA-PCR mit der AceA500-PCR oder der IdeR500-PCR in Form einer Duplex-PCR an, um sowohl eine hohe Sensitivität wie auch eine hohe Spezifität der PCR zu erreichen. Die Amplifikatgrößen dieser Kombinationen sind auch gut von einander zu differenzieren. Die Kombination der AceA500-und der IdeR500-PCR ist aufgrund der gleichen Amplifikatgröße in einer Duplex-PCR nicht einsetzbar, jedoch könnten diese PCRs in einem parallelen Ansatz in der Diagnostik eingesetzt werden.

Die durchgeführten Untersuchungen ergaben, dass die Auswahl des Untersuchungsmaterials großen Einfluß auf die Ergebnisse der einzelnen PCRs nahm (s. Kapitel 4.5 und Kapitel 5.3).

5.3 Vergleich der PCR mit dem kulturellen und klinischen Nachweis von Rhodococcus