und dem
Zentrum für Infektionsmedizin Institut für Mikrobiologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Rhodococcus equi und
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus aus Nasentupfern und Tracheobronchialsekret
von lungenkranken Fohlen
INAUGURAL DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Maria Barbara Meyer-Hamme aus Hamburg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Erich Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Erich Klug
2. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Mai 2004
Meinen Eltern und Geschwistern
1. Einleitung... 13
2. Schrifttum ... 15
2.1. Rhodococcus equi: Geschichtlicher Überblick und taxonomische Einordnung ...15
2.2. Vorkommen und Bedeutung von Rhodococcus equi...17
2.2.1. Rhodococcus equi im Boden ...17
2.2.2. Rhodococcus equi im Kot ...19
2.2.3. Vorkommen von Rhodococcus equi beim Pferd...20
2.2.3.1. Erkrankungen durch Rhodococcus equi beim erwachsenen Pferd ...20
2.2.3.2. Erkrankungen durch Rhodococcus equi beim Fohlen ...21
2.2.3.3. Vorkommen beim Menschen ...25
2.3. Pathogenese von Rhodococcus equi-Infektionen beim Pferd ...25
2.4. Bedeutung und Vorkommen von Virulenzproteinen ...26
2.5. Wechselwirkungen von Rhodococcus equi mit den humoralen und zellulären Komponenten der körpereigenen Abwehr...28
2.6. Diagnose von Rhodococcus equi-Infektionen...31
2.6.1. Hämatologische Parameter ...31
2.6.2. Zytologische und mikrobiologische Nachweisverfahren ...31
2.6.3. Serologische Diagnostikverfahren ...33
2.6.4. Bildgebende Diagnostikverfahren...34
2.7. Kultureller Nachweis von Rhodococcus equi...35
2.8. Morphologische Eigenschaften von Rhodococcus equi...37
2.8.1. Kolonienmorphologie und Pigmentierung...37
2.8.2. Mikroskopisches Aussehen und Anfärbbarkeit ...39
2.9. Hämolytische Aktivität ...41
2.10. Equi-Faktor ...41
2.11. Biochemische Eigenschaften...43
2.12. Antimikrobielle Empfindlichkeit ...45
2.13. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus: Taxonomische Einordnung ...46
2.13.1. Vorkommen von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus beim Pferd...48
2.13.1.1. Erkrankungen beim erwachsenen Pferd...48
2.13.1.2. Erkrankungen beim Fohlen...49
3. Eigene Untersuchungen... 52
3.1. Material...52
3.1.1. Fohlen...52
3.1.2. Haltungsbedingungen der Pferde ...52
3.1.3. Protokoll der klinischen Untersuchung / klinischer Score ...53
3.1.4. Messung der Leukozytenzahl im Fohlenblut...53
3.1.5. Sonographische Untersuchung der Lunge ...53
3.1.6. Untersuchungsmaterial...54
3.1.7. Bodenproben ...55
3.2. Methodik ...56
3.2.1. Nährmedien für den kulturellen Nachweis von Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus...56
3.2.2. NANAT-Medium ...57
3.2.3. Isolierung von Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus aus Nasentupfern ...57
3.2.4. Isolierung aus dem Tracheobronchialsekret ...58
3.2.5. Isolierung von Rhodococcus equi aus Bodenproben...58
3.2.5.1. Voruntersuchung von Bodenproben ...58
3.2.5.2. Verarbeitung der Bodenproben ...59
3.2.6. Nachweis und Differenzierung von Rhodococcus equi...59
3.2.6.1. Mikroskopischer Nachweis von Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus im Grampräparat...59
3.2.7. Identifizierung von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus...63
3.2.8. Nachweis der Antibiotika-Empfindlichkeit ...63
3.2.9. Bestimmung der minimalen Hemmstoffkonzentrationen mittels Etest®...65
3.2.10. Statistische Auswertung der Ergebnisse ...66
4. Ergebnisse... 67
4.1. Identifizierung von Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus...67
4.1.1. Wachstumseigenschaften von Rhodococcus equi...67
4.1.2. Isolierung von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus...69
4.1.2.1. Mikroskopischer Nachweis von Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus im Grampräparat...69
4.2. Biochemische Eigenschaften von Rhodococcus equi...69
4.3. Nachweis von Rhodococcus equi in Nasentupfern...71
4.4. Nachweis von Rhodococcus equi im Tracheobronchialsekret...71
4.5. Nachweis von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus in Nasentupfern ...72
4.6. Nachweis von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus im Tracheobronchialsekret ...72
4.7. Klassifizierung von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus...72
4.8. Klinischer Score...73
4.9. Erkrankungsalter der Fohlen ...73
4.10. Nachweis von Rhodococcus equi in Nasentupfern in Abhängigkeit vom Erkrankungsalter...74
4.11. Nachweis von Rhodococcus equi im Tracheobronchialsekret in Abhängigkeit vom Erkrankungsalter ...75
4.12. Sonographischer Nachweis von Lungenabszessen und Pneumonien ...76
4.13. Gegenüberstellung der Nachweishäufigkeit von Rhodococcus equi
im Nasentupfer und Tracheobronchialsekret ...76
4.14. Gegenüberstellung der Nachweishäufigkeit von Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus im Tracheobronchialsekret ...76
4.15. Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem klinischen Score ...77
4.16. Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit der Leukozytenzahl im Blut ...79
4.17. Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi im Nasentupfer mit dem sonographischen Nachweis von Lungenabszessen ...80
4.18. Vergleich des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi im Nasentupfer mit dem sonographischen Nachweis von Pneumonien...81
4.19. Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi im Tracheobronchialsekret mit dem sonographischen Nachweis von Lungenabszessen ...82
4.20. Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi im Tracheobronchialsekret mit dem sonographischen Nachweis von Pneumonien ...83
4.21. Antibiotikaempfindlichkeit im Agar-Diffusionstest ...84
4.22. Bestimmung der minimalen Hemmstoffkonzentration mittels Etest®...85
4.23. MHK-Werte des Referenzstammes Streptococcus pneumoniae...86
4.24. Entwicklung der MHK-Werte über den Untersuchungszeitraum...86
4.25. Vergleich des Nachweises von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus im Nasentupfer und Tracheobronchialsekret ...91
4.26. Vergleich zwischen dem Erkrankungsalter und dem Nachweis von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus im Nasentupfer...92
4.27. Vergleich zwischen dem Erkrankungsalter und dem Nachweis von Streptococcus equi subsp. zooepidemicus im Tracheobronchialsekret ...92
4.28. Nachweis von Rhodococcus equi in Bodenproben...93
5.1. Eigene Untersuchungen ...95
5.1.1. Probandengut ...95
5.1.2. Probenentnahme ...96
5.1.3. Isolierung von Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus aus Atemwegen lungenkranker Fohlen ...97
5.1.4. Antimikrobielle Empfindlichkeit ...99
5.2. Ergebnisse...100
5.2.1. Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi im Nasentupfer und im Tracheobronchialsekret mit den klinischen Befunden ...100
5.2.2. Kultureller Nachweis von Rhodococcus equi im Nasentupfer und Tracheobronchialsekret bei Fohlen mit sonographischen Lungenbefunden...102
5.2.3. Infektion der Fohlen mit Rhodococcus equi und Streptococcus equi subsp. zooepidemicus...103
5.3. Beziehungen zwischen dem Erkrankungsalter der Fohlen und dem Nachweis von Rhodococcus equi bzw. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus in deren Atemwegen...105
5.4. Nachweis von Rhodococcus equi in Bodenproben...106
5.5. Tierärztliche Aspekte und Schlussfolgerung...107
6. Zusammenfassung ... 109
7. Summary... 112
8. Literaturverzeichnis... 115
9. Anhang... 158
9.1. Nährmedien ...158
9.1.1. Rezeptur für das NANAT-Medium: ...158
9.1.2. Staphylokokken-Streptokokken-Selektivagar: ...158
9.1.3. Kochblut-Agar...158
9.1.4. Nährbouillon (1 Liter) ...159
9.1.5. NANAT-Selektivbouillon (1 Liter) ...159
9.1.6. Sorbit- und Trehalose-Lösung (Basismedium) ...159
9.2. Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrads der klinischen Symptome (nach Ohnesorge 1998)...160
9.3. Rhodococcus equi (Rh. equi) im Nasentupfer (NT) und im Tracheobronchialsekret (TBS) aus Fohlen mit abszedierender Pneumonie ...161
9.4. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (Sc. equi subsp. zooep.) im Nasentupfer (NT) und Tracheobronchialsekret (TBS) aus Fohlen mit abszedierender Pneumonie ...168
9.5. Klinischer Score, Zahl der Blutleukozyten, Abszess- und Pneumonie-Befunde und Fohlenalter ...176
9.6. Befunddaten für die Untersuchungswoche, die minimale Hemmstoffkonzentration (MHK-Werte) von Erythromycin, Rifampicin, Trimethroprim / Sulfadiazin und Azithromycin und den Agardiffusionstest ...183
9.7. Abbildungen...187
9.8. Tabellen...188
Abb.: Abbildung cm Zentimeter
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylen-diamin-tetra-Essigsäure EHV 1 / 4 Equines Herpesvirus 1 / 4
g Gramm ggr. geringgradig h Stunde hgr. hochgradig i.v. intravenös
IgG Immunglobulin G
kg Kilogramm Kgh Keimgehalt KW Kalenderwoche m Meter
mg/dl Milligramm / Deziliter
mg/kg Milligramm / Kilogramm
mg/ml Mikrogramm /Milliliter
mgr. mittelgradig
MHK: Minimale Hemmstoffkonzentration
min. Minute ml Milliliter mm Millimeter NT: Nasentupfer PCR Polymerase Chain Reaction Rh. equi Rhodococcus equi
RNA Ribonukleinsäure s. siehe
s.u. siehe unten
Sc. equi subsp. zooep. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus sek. Sekunde
spp. Spezies subsp. Subspezies Std. Stunde Tab.: Tabelle
TBS: Tracheobronchialsekret UV Ultraviolett
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm µg/ml: Mikrogramm / Milliliter
µl Mikroliter
Mittelwert
Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt.
1. Einleitung
1. Einleitung
Rhodococcus equi (ehemals Corynebacterium equi) ist ein Infektionserreger, der beim Pferd und besonders bei Fohlen eine bedeutende Rolle spielt. Er führt beim Fohlen zu chronisch, eitrigen Bronchopneumonien (KNIGHT, 1969, HILLIDGE, 1986) mit Abszessbildung, unter Beteiligung der regionären Lymphknoten und, wenn auch seltener, des Verdauungstraktes (CIMPRICH und ROONEY, 1977, YAGER, 1987).
Die Erkrankung kann sowohl sporadisch als auch auf einigen Gestüten endemisch auftreten (TAKAI, 1997). In betroffenen Aufzucht-Betrieben liegt die Morbidität bis zu 80 % (ELLISADE et al., 1980). Die Mortalität wird dabei zwischen 5 – 17 % angegeben (ELLISADE et al., 1980, TAKAI et al., 1985a). Dieser hohe Verlust liegt daran, dass Fohlen trotz zahlreicher Lungenabszesse erst sehr spät für den Besitzer erkennbare Krankheitssymptome zeigen. Oft bleibt in diesem Stadium der Lungenveränderungen auch eine intensive antibiotische Therapie erfolglos (BEECH and SWEENEY, 1991). Infolgedessen können erhebliche wirtschaftliche Verluste in Pferdezuchtbetrieben entstehen.
Die Therapie einer Rhodococcus equi-Infektion gestaltet sich sehr zeitaufwendig und kostenintensiv. So muss mit einer Therapiedauer von mindestens vier bis neun Wochen gerechnet werden (HILLIDGE, 1987), wobei auch von bis zu fünf Monaten berichtet wird (PRESCOTT und SWEENEY, 1985). Je früher im Verlauf der Erkrankung mit dieser speziellen Therapie begonnen wird, desto besser wird die Prognose und umso kürzer die Behandlungsdauer. Aus diesem Grunde schlagen COHEN et al. (2000, 2002) auf Gestüten, auf denen Rhodococcus equi endemisch vorkommt, ein Screeningsystem zur Früherkennung der Rhodococcus equi- Pneumonie vor. Ein zu frühes Ende der Therapie kann zu Rezidiven führen (GIGUERE u. PRESCOTT, 1997).
Rhodococcus equi zeigt eine weite Verbreitung in der Umwelt und eine ausgesprochene Widerstandsfähigkeit bei ungünstigen klimatischen Bedingungen wie UV-Strahlung und Trockenheit (TAKAI et al., 1991). Dies erklärt sein Verbleiben
Einleitung
auf Zuchtbetrieben und sein endemisches Vorkommen. In diesem Zusammenhang wird Rhodococcus equi auch aus Boden- und Kotproben von Pferden nachgewiesen (BARTON und HUGHES, 1981). In der Kontamination der Umgebung von Fohlen wird die Ursache der Infektion vermutet. Dabei wird vor allem der aerogenen Aufnahme der Erreger aus staubhaltiger Atemluft besondere Bedeutung beigemessen (BARTON und HUGHES, 1980).
Rhodococcus equi wird von infizierten Tieren periodisch ausgeschieden und weist möglicherweise eine intrazelluläre Überlebensstrategie auf (MARTENS et al., 1982).
Dadurch kann die klinische Verdachtsdiagnose einer Lungenentzündung durch Rhodococcus equi nicht in allen Fällen durch den kulturellen Nachweis bestätigt werden.
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung ist es, einen Überblick über die Verbreitung von Rhodococcus equi und die Morbidität der Fohlen auf dem Gestüt, auf dem die Untersuchung vorgenommen wurde, zu erlangen. In diesem Rahmen soll herausgestellt werden, inwieweit die sonographische Lungenuntersuchung (ALTHAUS, 2004) klinisch auffälliger Fohlen und die damit einhergehende kulturelle Untersuchung von Nasentupfer- und Tracheobronchialsekret-Proben auf Rhodococcus equi zur verbesserten Diagnostik der Erkrankung beiträgt. Um schließlich die epidemiologischen Zusammenhänge auf dem Gestüt, auf dem die Untersuchung erfolgt, zu erfassen und um diese Möglichkeit der Infektion zu berücksichtigen, werden außerdem Bodenproben auf Rhodococcus equi untersucht.
Dabei sollen prophylaktische Maßnahmen zur Minderung des Keimgehaltes im Boden berücksichtig werden.
Da bei Lungenabszessen des Pferdes Rhodococcus equi häufig in Verbindung mit β-hämolysierenden Streptokokken zu isolieren ist (BAIN, 1963a), soll in der vorliegenden Untersuchung auch Streptococcus equi subsp. zooepidemicus als Erreger von Atemwegserkrankungen mit Nasenausfluss und Vergrößerung der submaxillären Lymphknoten berücksichtig werden. Dabei ist die Frage, ob eine Interaktion zwischen den beiden Erregern besteht, bisher noch unbeantwortet. Sie soll hier aber untersucht werden.
2. Schrifttum
2.1. Rhodococcus equi: Geschichtlicher Überblick und taxonomische Einordnung
Rhodococcus equi (ehemals: Corynebacterium equi) wurde innerhalb eines Zeitraums von wenigen Jahren in verschiedenen Ländern erstmals beschrieben. So erwähnte MAGNUSSON 1923 in Schweden Corynebacterium equi als Erreger spezifischer eitriger Pneumonien beim Fohlen. Aufgrund der grampositiven Anfärbbarkeit, der Unbeweglichkeit, des Fehlens von Sporenbildung, der Gelatineverflüssigung sowie der Indolbildung und nicht zuletzt der Pleomorphie, ordnete er den Erreger der Gattung Corynebacterium zu. Auch MIESSNER und WETZEL (1923) beschrieben im selben Jahr den Erreger als Corynebacterium pyogenes equi. Ebenfalls im selben Jahr schlägt LÜTJE (1923) vor, den Organismus in Corynebacterium pyogenes equi roseum umzubenennen. Bereits ein Jahr später folgen Beschreibungen von Corynebacterium equi durch BULL (1924) in Australien, und später von DIMOCK und EDWARDS (1931) in den USA, RAJAGOPALAN (1936) in Indien und CRAIG und DAVIES (1940) in England.
Die taxonomische Einordnung des Bakteriums bereitete zunächst Schwierigkeiten und wurde kontrovers diskutiert. Durch verbesserte Untersuchungsmethoden konnten diese Differenzen in den letzten Jahren aber beseitigt werden. Aufgrund seiner Ähnlichkeit zu Mykobakterien, schlugen JENSEN (1934) und später KRASIL`NIKOV (1966) vor, den Erreger Mycobacterium equi zu nennen. Nachdem es HOLTH und AMUNDSEN (1936) aber gelungen war, Corynebacterium equi in tuberkulös veränderten Lymphknoten des Schweines als „spezifisches, säurefestes kokko-bazilläres Bakterium“ nachzuweisen, schlug PLUM (1940) vor, das Bakterium Corynebacterium Magnusson-Holth zu benennen. Die Überlegung, das Bakterium als neue Spezies Mycobacterium rhodochrous einzuordnen hegte erstmals GORDON (1966). Diese Spezies sollte Platz zwischen Nocardia spp. und Mykobakterien Platz finden. Nach eingehenden Untersuchungen stellten UCHIDA und KO (1977) fest, dass das Bakterium N-glykolierte Muraminsäurereste enthält. Diese Reste werden auch bei sowohl Nokardien, als auch bei Mykobakterien und Rhodokokken nachgewiesen. Aufgrund dieser Erkenntisse schlugen
Schrifttum
BOUSFIELD und GOODFELLOW (1976), mit Unterstützung von GOODFELLOW und ALDERSON (1977) die Schaffung des neuen Genus Rhodococcus vor. Neben neun anderen Spezies soll diesem Genus auch Rhodococcus equi angehören. Das Genus „Rhodococcus“ wird phylogenetisch zu den nocardioformen Actinomyceten gezählt. In dieser Gruppe zeichnet sich
„Rhodococcus“ besonders durch den Aufbau der Zellwand aus, deren Peptidoglycangerüst aus D-Glutaminsäure, N-Acetylglucosamin, N- Glycosylmuraminsäure und D- und L-Alanin besteht. Ebenfalls spezifisch für Rhodococcus sind die in der Zellwand vorkommenden Phospholipide. Diese bestehen aus Phosphatidylinositolmannosid, Cardiolipin, Phosphatidylinositol und Phospatidylethanolamin (FINNERTY 1992). Der Kohlenhydratanteil der Zellwand setzt sich vor allem aus Galactose und Arabinose zusammen. Wie GOODFELLOW und MINNIKIN (1978), COLLINS et al. (1982) und BARTON et al. (1989) herausstellten, stellen eine Vielzahl von geradkettigen, ungesättigten Fettsäuren, 10-Methyloctadecan-Fettsäuren und das Vorhandensein von Mycolsäuren, die aus 34 bis 64 Kohlenstoffatomen mit bis zu vier ungesättigten Bindungen bestehen (GOODFELLOW 1986, PRESCOTT 1991), einen weiteren wichtigen Bestandteil der Zellwand des Genus „Rhodococcus“ dar. Anhand der Anzahl der C-Atome dieser Mycolsäuren kann eine Unterteilung des Genus
„Rhodococcus“ in zwei Gruppen vorgenommen werden. Zu der ersten Gruppe werden Rhodococcus rubropectinus, Rhodococcus terrae und Rhodococcus bronchiales gezählt, die mit ihren 48 bis 66 spezifischen C-Atomverbindungen und außerdem zahlreicher dihydrogenierter Menachinone mit neun Isopreneinheiten von der zweiten Gruppe abgrenzbar sind. STACKEBRAND et al. (1988) ordnete diese Gruppe anhand dieser Eigenschaften dem Genus Gordona zu. Diese These wurde von MODARSKI et al. (1976, 1977, 1980a) anhand von DNA-Studien widerlegt.
Dabei wurde die Zugehörigkeit zum Genus Rhodococcus etabliert. Die zweite Gruppe zeichnet sich durch Mycolsäuren aus, die 34 bis 52 C-Atomverbindungen mit bis zu zwei Doppelbindungen und dihydrogenierten Menachinonen mit acht Isopreneinheiten in der Zellwand enthalten. Zu dieser zweiten Gruppe gehört, zusammen mit weiteren 11 Rhodococcus-Spezies, auch Rhodococcus equi (GOODFELLOW 1986). Durch Vergleich der Antibiotikaempfindlichkeit war es
GOODFELLOW und ORCHARD (1974) möglich, das weitaus sensitivere
„Rhodococcus“-Taxon von den resistenteren Spezies des Genus Nocardia abzugrenzen. Außerdem machten chromatographische Untersuchungen der Mycolsäuren erstmals eine Differenzierung von Bakterien der Gattungen Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus und Mycobacterium (BUTLER et al., 1986, DE BRIEL et al., 1992) möglich. Zur Differenzierung von Corynebacterium und Rhodococcus equi wurden schließlich weiterführende molekularbiologische Methoden, wie die Restriktionsfragmentanalyse ribosomaler RNA mit anschließender Elektrophorese eingesetzt (VANEECHOUTTE et al., 1995).
Die Ergebnisse der DNA- und RNA-Untersuchungen (YAMADA und KOMAGATA, 1970, MODARSKI et al., 1980a und b, SUZUKI et al., 1981) führten letztendlich zur endgültigen Umbenennung des Keims von Corynebacterium equi zu Rhodococcus equi, wobei der Name „Rhodococcus“ auf den morphologischen Wachstumsveränderungen von bazillär bis coccoid (rod to coccus) beruht (PRESCOTT 1991).
2.2. Vorkommen und Bedeutung von Rhodococcus equi 2.2.1. Rhodococcus equi im Boden
Rhodococcus equi zeigt eine weite Verbreitung in der Umwelt und wird unabhängig von Krankheitsausbrüchen auf vielen Pferdefarmen nachgewiesen. Obwohl in den USA fast alle Pferdebestände mit Rhodococcus equi infiziert zu sein scheinen (GIGUÈRE und PRESCOTT, 1997), treten klinisch manifeste Infektionen mit Rhodococcus equi nur in einigen Beständen endemisch auf. In anderen Beständen hingegen kommt es zu keinen klinischen Symptomen (ROONEY, 1966). Dies ist auf unterschiedliche Bedingungen in der Umgebung, wie Temperatur, Staub oder pH-Wert des Bodens, außerdem aber auf das Management eines Bestandes sowie auf Virulenzunterschiede der Isolate zurückzuführen (TAKAI et al., 1991). Der Erreger kann aus verschiedenen Proben nachgewiesen werden, wobei die Frage des primären Habitats bislang ungeklärt blieb. Vor allem aus Boden- und Kotproben verschiedener Tierarten (WOOLCOCK et al., 1979, 1980, WOOLCOCK und MUTIMER, 1981, BARTON und HUGHES, 1981, 1984, PRESCOTT et al., 1984b,
Schrifttum
TAKAI und TSUBAKI, 1985), sowie aus tuberkulös veränderten Lymphknoten des Schweins kann Rhodococcus equi isoliert werden (TAKAI und TSUBAKI, 1985).
Auch in Gegenden, in denen keine Tiere gehalten werden, kann Rhodococcus equi aus Bodenproben isoliert werden (JENSEN, 1934). Diese Tatsache lässt vermuten, dass der Erreger ein ubiquitär vorhandener Bodensaprophyt ist (SMITH 1966). Die Keimdichte im Boden korreliert mit der Inzidenz von Rhodococcus equi-Pneumonien in der entsprechenden Umgebung (ROBINSON, 1982, PRESCOTT et al., 1984b, PRESCOTT, 1991). Diese Aussage wird aber durch TAKAI et. al. (1991a, 1994b) und RAHL et al. (1999) korrigiert. Die Autoren konnten belegen, dass die Krankheitshäufigkeit nicht mit dem Keimdruck, sondern mit dem Vorhandensein von Virulenzprotein-A (Virulenz-associated-protein A; VapA) exprimierenden Rhodococcus equi-Stämmen korreliert. Dass das Bakterium längere Zeit im Boden überlebt, stellte MAGNUSSON (1938) fest und ging der Frage nach, ob er sich auch dort vermehrt. Noch zwölf Monate nach Inkubation eines Rasens kann Rhodococcus equi aus den genommenen Bodenproben nachgewiesen werden (WILSON, 1955).
Des Weiteren ist das Bakterium in trockenem Humusboden, wie auch in feuchtem Lehmboden, Gärten und Parkanlagen nachweisbar (BARTON und HUGHES, 1980, PRESCOTT, 1991, TAKAI, 1997). Auch auf Koppeln, die gerade beweidet oder seit Monaten nicht von Pferden besiedelt wurden, kann Rhodococcus equi nachgewiesen werden. All diese Untersuchungen geben Hinweise auf die weite Verbreitung und hohe Tenazität von Rhodococcus equi in der Umgebung von Pferden.
In weiteren Untersuchungen wurde geprüft, ob ein Zusammenhang zwischen Kontamination von Boden- und Kotproben besteht. Eine Untersuchung von BARTON und HUGHES (1981) ergab, dass sich Rhodococcus equi nur aus Kot von Tieren mit Weidegang isolieren lässt. Außerdem konnten die Autoren eine sehr viel höhere Isolierungsrate aus Dung als aus rektal entnommenem Kot nachweisen. Wie PRESCOTT et al. (1984b) nach Untersuchung von Bodenproben und Dung feststellte, ist die Anzahl der Keime in Bodenproben sehr viel höher als im Dung. Die Überlegung liegt daher nahe, ob Rhodococcus equi sich in mit Dung verunreinigtem Boden vermehren kann. TAKAI et al. (1986b) ging dieser Fragestellung nach, indem er monatlich über einen Zeitraum von zehn Monaten Bodenproben entnahm und
stellte in diesen eine zunehmende Zahl des Erregers fest. Die Keime hatten die höchste Inzidenz im April und Mai und nahmen dann allmählich an Häufigkeit wieder ab. In kothaltiger Erde konnte Rhodococcus equi länger als 12 Monate nachgewiesen werden (WILSON, 1992). HUGHES und SULAIMAN (1987) konnten eine Vermehrung von Rhodococcus equi bestätigen, allerdings erst, nachdem sie den Boden mit Dung oder Azetat angereichert hatten.
Diese Erkenntnisse lassen auf eine saprophytäre Lebensweise von Rhodococcus equi im Boden schließen, wobei zu vermuten ist, dass Rhodococcus equi in einem Zyklus zwischen Haustieren und den diese umgebenden Boden lebt (TAKAI und TSUBAKI, 1985).
2.2.2. Rhodococcus equi im Kot
Die Isolierung von Rhodococcus equi aus Kot gelingt vor allem beim Pferd, aber auch bei anderen domestizierten Haustieren. Lediglich bei Katzen und Opossums konnte keine Kotprobe als positiv gewertet werden. Bei Tauben und anderen Vögeln liegt die Isolierungsrate bei 64 % - 100 %, wohingegen bei Nutzgeflügel nur aus 4 % der Kotproben Rhodococcus equi nachgewiesen werden konnte (CARMAN und HODGES, 1987). WOOLCOCK et al. (1980) stellte die Überlegung an, ob es sich bei Rhodococcus equi um einen natürlichen Darmbewohner des Pferdes handelt. Die Autoren führten Untersuchungen mit einem Selektivmedium durch, das Cycloheximid, Nalidixinsäure, Kaliumtellurit und Novobiocin enthielt. Mit Hilfe dieses Selektivmediums gelang es dem Autor, aus 90 von 127 untersuchten Kotproben von Pferden Rhodococcus equi nachzuweisen. Auf 12 Gestüten gelang es mit diesem Medium dann, Rhodococcus equi bei Pferden unterschiedlichsten Alters nachzuweisen, obwohl nur in zwei der Gestüte Rhodococcus-Pneumonien ein bzw.
drei Jahre vorher vorgekommen waren. Auch aus Kotproben von Rindern, die zusammen mit Pferden gehalten wurden, ist Rhodococcus equi zu isolieren.
Rhodococcus equi vermehrt sich im Kot von Pferden, Rindern, Schafen, Ziegen, Hunden, Katzen und Hühnern innerhalb von ein bis zwei Wochen ca. 10.000-fach (BARTON und HUGHES, 1984).
Schrifttum
Bemerkenswert ist die Feststellung von TAKAI (1997) und FUKUNAGA et al. (1999), nach der sich virulente Stämme von Rhodococcus equi nur aus Pferden und deren Umgebung nachweisen lassen.
2.2.3. Vorkommen von Rhodococcus equi beim Pferd
2.2.3.1. Erkrankungen durch Rhodococcus equi beim erwachsenen Pferd Der Nachweis von Rhodococcus equi ist bei erwachsenen Pferden möglich, jedoch selten und wird bisher nur von wenigen Autoren beschrieben. Krankhafte Veränderungen betreffen die gleichen Organsysteme wie bei Fohlen (PRESCOTT, 1991). ROBERTS et al. (1980) beschrieben ein 18 Jahre altes Pferd, das an einer Erkrankung mit Rhodococcus equi litt und Apathie, ein schlechtes Allgemeinbefinden sowie bilateralen, mukopurulenten Nasenausfluss, eine erhöhte Respirationsrate, dennoch aber keinen Husten zeigte. Der Erreger ist auch aus dem Eiter subkutaner Abszesse an den Gliedmaßen erwachsener Pferde nachzuweisen (SIMPSON, 1964) In diesem Falle gingen die Abszesse mit Lahmheiten einher, außerdem kam es zu Konditionsverlust und Husten. Zudem traten Lungenabszesse und Abszesse der Mediastinallymphknoten in Erscheinung. Aus dem Eiter dieser Lungenabszesse konnte ebenfalls Rhodococcus equi isoliert werden. Einzelne Berichte vom Nachweis von Rhodococcus equi im Uterus infertiler Stuten sowie in abortierten Früchten liegen von BRUNER et al. (1939), SIPPEL et al. (1968) und ZINK et al. (1986) vor. Der Erreger konnte außerdem aus dem Herzen und dem Mageninhalt abortierter Foeten isoliert werden (RAMACHANDRA et al., 1981).
Rhodococcus equi-Infektionen bei erwachsenen Pferden beschrieb auch MAGNUSSON (1938), wobei er von Infektionen „älterer Fohlen“ sprach. Bei Lungenabszessen des Pferdes ist Rhodococcus equi häufig in Verbindung mit β-hämolysierenden Streptokokken zu isolieren (BAIN, 1963a). Der Autor untersuchte 238 Stuten, die an einer Uterusinfektion erkrankt waren und konnte bei acht dieser Stuten (3 %) Rhodococcus equi nachweisen. Im Falle einer Cervicitis gelangt der Erreger aszendierend in den Cervicalkanal und infiziert die Frucht, so dass es zwischen dem 110.-120. Tag, oder am Ende der Trächtigkeit zu einem Abort kommt (RAMACHANDRA et al., 1981). Zwischen der Infektion mit Rhodococcus equi und einem Abort sieht FAULKNER (1968) einen Zusammenhang. Der Autor zählt zu den
auslösenden Erregern bei 5-7 % der Aborte bei Stuten jedoch neben Rhodococcus equi auch Streptokokken und Klebsiellen. Weitere Erkenntnisse über Rhodococcus equi bei erwachsenen Pferden konnten FREESTONE et al. (1987) erlangen. Sie wiesen den Erreger im Blut verschiedener Tiere nach und erkannten außerdem, dass vor allem immunsupprimierte Pferde an Rhodococcus equi-Infektionen erkranken.
Die Autoren beschreiben einen sieben Jahre alten Appaloosa-Wallach, der eine plötzlich auftretende Immunsuppression, Anorexie, Lethargie, Fieber und Bronchopneumonie zeigte. Bei diesem Pferd waren die IgG- und IgA- Konzentrationen deutlich erniedrigt und IgM nicht nachweisbar. Durch einen Lymphozytenstimulationstest wurde eine gestörte T-Lymphozytenfunktion nachgewiesen. In einem Rhodococcus equi spezifischen Antikörpertest (ELISA) wurde daraufhin eine Antikörperkonzentration festgestellt, die 10fach höher war, als bei gesunden erwachsenen Pferden.
2.2.3.2. Erkrankungen durch Rhodococcus equi beim Fohlen
Bei Fohlen manifestiert sich die Infektion durch Rhodococcus equi am häufigsten in Form einer subakuten bis chronischen, eitrigen Bronchopneumonie mit Abszessbildung und einer begleitenden eitrigen Lymphadenitis (YAGER, 1987, WEISS und RUDOLPH, 1988). Es handelt sich um eine weltweit verbreitete Erkrankung mit einer wachsenden Bedeutung. Sie ist verbunden mit einer hohen Morbiditätsrate bis 80 % (ELLISADE et al., 1980, TAKAI et al., 1985a, SØLAND und OLSEN 1995). Nach PRESCOTT et al. (1980) sind 1-3 % aller Todesfälle bei Fohlen auf Infektionen mit Rhodococcus equi zurückzuführen. Alle Pferderassen scheinen empfänglich für Rhodococcus equi-Infektionen zu sein, wobei keine Geschlechtsprädisposition auszumachen ist (ZINK et al., 1986). Eine Infektion mit Rhodococcus equi kann auf oralem, aerogenem, omphalogenem oder auf intrauterinem Wege geschehen (BARTON und HUGHES, 1980). Des Weiteren sind auch Infektionen durch wandernde Parasitenlarven (BARTON und HUGHES, 1980) und durch offene Wunden beschrieben worden (KNIGHT, 1969, SMITH und JANG, 1980). Von einer Verbreitung von Rhodococcus equi durch nasales Exsudat erkrankter Fohlen berichtete zudem BURROWS (1968). Auch eine Ausbreitung der Erkrankung von der Lunge in andere Regionen des Organismus ist nicht
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ungewöhnlich (HONDALUS, 1997). Vor allem in den Sommermonaten treten vermehrt Lungenentzündungen mit Rhodococcus equi auf (ZINK et al., 1986), weswegen die Erkrankung auch „Sommerpneumonie“ genannt wird (ROSSDALE, 1981). Eine Erklärung für dieses Phänomen liegt in der Überlegung, dass die Tiere während dieser Jahreszeit vermehrt Rhodococcus equi haltigen Staub einatmen (PRESCOTT et al., 1984b). Außerdem befinden sich die meisten Fohlen zu dieser Zeit in einem Alter (bis sechs Monate), in dem die Konzentration der maternalen Antikörper langsam abfällt, so dass die Tiere über keinen ausreichenden humoralen Schutz vor einer Infektion mehr verfügen (HIETALA et al., 1985, PRESCOTT, 1991).
Die Ursache dafür, dass vor allem Fohlen an Rhodococcus equi-Infektionen erkranken, könnte das noch unreife Immunsystem der Fohlen und die besseren Lebensbedingungen für Rhodococcus equi als Aerobier im Fohlendarm als im Darm erwachsener Tiere sein (YAGER, 1987). Infektionsbegünstigend wirkt möglicherweise zusätzlich die Koprophagie der Fohlen (KNOTTENBELT, 1993).
TAKAI et al. (1986a) und HUGHES und SULAIMAN (1987) gelang es, eine intraintestinale Vermehrung von Rhodococcus equi bis zur achten Lebenswoche beim Fohlen nachzuweisen. Vor allem in den Monaten Mai bis August, und ganz besonders im Juli, treten in Nordamerika vermehrt Erkrankungen mit Rhodococcus equi auf (ZINK et al., 1986) und zwar überall dort, wo Fohlen aufgezogen werden (ROONEY, 1966). Andere Autoren beschreiben hingegen, dass in den meisten Fällen Rhodococcus equi-Infektionen nur sporadisch oder enzootisch auftreten.
(PRESCOTT, 1991, TAKAI et al., 1991). Eine Erkrankung mit Rhodococcus equi tritt vermehrt im Saugfohlenalter mit 2 – 3 Monaten auf (GIGUÈRE und PRESCOTT, 1997), wobei auch Erkrankungen bei Fohlen bereits im Alter von 2 – 3 Wochen beschrieben sind (EK und NORDSTOGA, 1967, SIPPEL et al., 1968). AINSWORTH (1999) vermutet hingegen, dass die Infektion mit Rhodococcus equi bei Fohlen im Alter zwischen 1 – 6 Monaten erfolgt. Virale Infektionen (ROONEY, 1966), Unterernährung (KNIGHT, 1969), Verletzungen (KNIGHT, 1969), aber auch Massentierhaltung (ARDANS et al., 1986) und ein defektes Immunsystem (YAGER, 1987, FREESTONE et al., 1989, PRESCOTT und HOFFMANN, 1993) können als prädisponierende Faktoren für eine Rhodococcus equi-Erkrankung angesehen werden.
Bei der Rhodococcus equi-Erkrankung wird unterschieden zwischen einer pulmonalen Form (subakute bis chronische, eitrige Bronchopneumonie) und einer abdominalen Form (ulzerative Enteritis). Außerdem werden Arthritiden und subkutane Abszesse beschrieben (FIRTH et al., 1980, SMITH und JANG, 1980, TAKAI et al., 1985a, GORHAM und HAALAND, 1986, ZINK et al., 1986). Cellulitiden, die durch Rhodococcus equi verursacht werden, wurden bei Fohlen nur selten beobachtet und befinden sich dann in der Mamma- und Inguinalregion (PERDRIZET und SCOTT, 1987). Wie YAGER (1987) und PRESCOTT (1991) nachweisen konnten, zeigen 50 % der Fohlen mit intestinaler Erkrankungsform der Rhodococcose eine nekrotisierende Enterocolitis.
Anzeichen einer akuten Pneumonie, verursacht durch Rhodococcus equi beim Fohlen, zeigen sich durch Fieber mit Temperaturen bis 41°C, außerdem einer plötzlich erhöhten Atemfrequenz und Husten (BAIN, 1963b). Die durch diese Erkrankung entstehenden, bis zu hühnereigroßen Lungenabszesse sind meist mit zäh eingedicktem Eiter gefüllt (PRESCOTT, 1991). Nach massiver aerogener Aufnahme von Rhodococcus equi können auch akut verlaufende Infektionen bei Fohlen beobachtet werden. Die Tiere zeigen eine plötzlich einsetzende, hochgradige Atemnot und versterben bereits 24 bis 48 Stunden nach Auftreten der klinischen Symptome (ROONEY, 1966).
Das Lungenparenchym kann von miliaren, von einer dünnen Wand umgebenen und bis zu 7 cm großen Abszessen durchsetzt sein (MAGNUSSON, 1923, LINTON und GALLAHER, 1969). Das typische Sektionsbild zeigt bei Infektionen mit Rhodococcus equi feuchte, schwere, dunkle und nicht kollabierte Lungen (SMITH und ROBINSON, 1981). Im histologischen Bild können Makrophagenansammlungen in den Wänden der Lungenalveolen nachgewiesen werden, die massenhaft phagozytierte, kokkobazilläre Bakterien enthalten (RAJAGOPALAN, 1936, PRESCOTT, 1991). MARTENS et al. (1982) stellten fest, dass eine experimentell induzierte Rhodococcus equi-Infektion bei Fohlen eine chronisch eitrige Bronchopneumonie verursacht, die vor dem Auftreten klinischer Symptome pathologisch nachgewiesen werden konnte.
Bei chronisch erkrankten Fohlen kann gelegentlich Durchfall beobachtet werden.
Dieser kommt vermutlich dadurch zustande, dass der Erreger mit ausgehustetem
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Lungensekret abgeschluckt wird und so in den Darmtrakt gelangt (ROONEY, 1966, CIMPRICH und ROONEY, 1977, BARTON und HUGHES, 1980, ZINK et al., 1986).
Eine Rhodococcus equi bedingte Colitis ohne vorhergehende Pneumonie wird in nur wenigen Fällen beschrieben (ROONEY, 1966). Dabei sind Dünn- und Dickdarmschleimhaut oedematös und mit zähem Schleim bedeckt (ROONEY, 1966). Wie auch die Infektion der Lunge, beginnt die Erkrankung des Darms als pyogranulomatöser Prozeß, der sich ulzerierend von den Peyerschen Platten bis hin zu den lokalen Lymphknoten ausbreitet (JOHNSON et al., 1983, WEISS und RUDOLPH, 1988).
Bei einem Drittel der Fohlen, die an einer Rhodococcus equi bedingten Pneumonie erkranken, zeigt sich eine immunvermittelte, nichtseptische lymphoplasmatische Polysynovitis, vor allem des Tibiotarsalgelenkes, in einigen Fällen aber auch aller Gelenke (SWEENEY et al., 1987, MADISON und SCARRATT, 1988, KENNEY et al., 1994). Der Grad der Gelenksbeeiträchtigung variiert und zeigt sich durch Lahmheit oder steifen Gang. Durch bakterielle Streuung von Rhodococcus equi aus der Lunge oder dem Gastrointestinaltrakt kann es, wenn auch selten, zu septischen Arthritiden und/oder Osteomyelitiden kommen (COLLATOS et al., 1990, DESJARDINS und VACHON, 1990; FIRTH et al., 1993).
Die Prognose ist in einem derartigen Fall dennoch vorsichtig zu stellen.
Auch vertebrale Osteomyelitiden werden von verschiedenen Autoren beschrieben (ROONEY, 1966, GIGUÈRE und LAVOIE, 1994, OLCHOWY, 1994, CHAFFIN et al., 1995).
Für Fohlen, die an einer Infektion mit Rhodococcus equi erkrankt sind, kann zunächst nur eine zweifelhafte bis ungünstige Prognose gestellt werden, wobei der Erfolg der Behandlung maßgeblich vom Zeitpunkt der Diagnosestellung und einer angemessenen Therapie abhängt. WILSON (1992) stellte fest, dass die Prognose deutlich günstiger ausfällt, wenn eine Erholung der erkrankten Tiere nach sieben Tagen unter Therapie zu verzeichnen ist. Dabei ist eine vollständige Genesung bei ausreichend langer Therapie möglich (PRESCOTT, 1987). Bei behandelten Tieren sind auf lange Sicht keine Spätschäden zu beobachten. Sogar der Einsatz im Sport ist nach vollständig ausgeheilter Krankheit zufrieden stellend (AINSWORTH et al., 1993).
2.2.3.3. Vorkommen beim Menschen
Einen ersten Nachweis von Rhodococcus equi beim Menschen erzielten GOLUB et al. (1967) bei einem Patienten, der unter einer Therapie mit Glykokortikoiden eine Pneumonie entwickelte. SCOTT et al. (1995) beschrieben, dass Infektionen mit Rhodococcus equi vor allem bei Patienten mit Immunsuppression in Erscheinung treten. Zu dieser Erkenntnis kamen zahlreiche weitere Autoren, die eine Rhodococcus equi-Infektion v.a. in Zusammenhang mit einer HIV-Infektion oder aber nach Chemotherapie oder Glykokortikoidbehandlung beschrieben (VAN ETTA et al., 1983, GAINSFORD und FRATER, 1986, MAC GREGOR et al., 1986, McNEIL und BRAUN, 1992, MAGNANI et al., 1992, MASTROIANNI et al., 1994, TAKAI et al., 1994c, STOLK-ENGELAAR et al., 1995).
Auch bei Patienten nach Herz-Transplantation (SEGOVIA et al., 1994) und bei Alkoholsüchtigen (LE BAR, 1986) konnte eine Infektion mit Rhodococcus equi nachgewiesen werden. In frühen Krankheitsstadien werden nach radiologischen Untersuchungen Infiltrate meistens in einem, in manchen Fällen auch in mehreren Lungenlappen nachgewiesen. Nach zwei bis vier Wochen kommt es in fast allen Fällen zu einer Abszedierung dieser Infiltrate (FLEPP et al., 1989, EMMONS et al., 1991, SHAPIRO et al, 1992). Eine Kavernenbildung in der Lunge konnte außerdem in 13 von 21 an Rhodococcus equi erkrankten Fällen von FLEPP et al. (1989) nachgewiesen werden.
Die Infektion mit Rhodococcus equi manifestiert sich beim Menschen vorwiegend im Respirationstrakt (PRESCOTT, 1991, SCOTT et al., 1995).
2.3. Pathogenese von Rhodococcus equi-Infektionen beim Pferd
Die Frage, warum gerade Fohlen eine besondere Empfindlichkeit gegenüber Rhodococcus equi aufweisen, ist bis heute nicht beantwortet. MARTENS et al.
(1988) konnten eine funktionelle Unreife der neutrophilen Granulozyten beim Fohlen nachweisen. Möglicherweise kann auch dieser Umstand als bedeutend für die Pathogenese von Rhodococcus equi-Pneumonien gezählt werden. Der bedeutsamste Pathogenitätsfaktor von Rhodococcus equi liegt an seiner Eigenschaft, die Fusion von Phagosomen und Lysosomen in den Makrophagen zu verhindern und dadurch intrazellulär zu verbleiben (ZINK et al., 1987). Eine Infektion
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mit Rhodococcus equi führt zu einer eitrig konfluierenden Bronchopneumonie, bei der zunächst Veränderungen der Spitzenlappen auftreten (PRESCOTT, 1991). Die Alveolarmakrophagen der Fohlen vermögen Rhodococcus equi in vitro nicht effektiv abzutöten (ZINK et al., 1985). HIETALA und ARDANS (1987a) sehen in der unspezifischen Degranulation der Lysosomen in infizierten Makrophagen und die daraus resultierende Schädigung des umliegenden Gewebes einen weiteren Pathogenitätsfaktor von Rhodococcus equi. Neutrophile Granulozyten, so YAGER et al. (1986), können Rhodococcus equi effektiv bekämpfen. Deren bakteriziden Mechanismen vermag Rhodococcus equi jedoch teilweise durch eine hitzestabile Oberflächenkomponente zu unterdrücken (ELLENBERGER et al., 1984a). Dabei wird bei dieser Oberflächenkomponente ein kapsuläres Polysaccharid vermutet. Zur Entstehung von Läsionen des Gewebes tragen aber wahrscheinlich auch die neutrophilen Granulozyten bei, da durch Freisetzung lysosomaler Enzyme oder reaktiver Sauerstoffmoleküle die Zellstruktur des umliegenden Gewebes geschädigt wird (YAGER et al., 1986).
Nicht sicher klären konnten YAGER (1987) und PRESCOTT (1991), ob die von BERNHEIMER et al. (1980), LINDER und BERNHEIMER (1982) beschriebene membranolytische Aktivität der Equi-Faktoren bei der Pathogenese von Rhodococcus equi von Bedeutung ist.
2.4. Bedeutung und Vorkommen von Virulenzproteinen
Die weite Verbreitung von Rhodococcus equi in der Umwelt und die Tatsache, dass der Organismus zwar in den meisten Pferdebeständen nachgewiesen werden kann, nicht aber auf allen Farmen zu endemisch verlaufenden Krankheitsausbrüchen führt (ROONEY, 1966), lässt Unterschiede in der Ausbildung von Virulenzfaktoren der verschiedenen Stämme vermuten. Da Pneumonien durch Rhodococcus equi nur bei einigen Tieren eines Bestandes zu beobachten sind, wird angenommen, dass eine Rhodococcus equi-Infektion durch das Gleichgewicht zwischen der Virulenz des Erregers und der Empfänglichkeit und Reife des Immunsystems des Wirtes bedingt wird (WADA et al., 1997). Bei experimentell induzierten Infektionen mit Rhodococcus equi, konnten verschiedene Verlaufsformen beobachtet werden, denen variierende bakterielle Virulenzen zugrunde gelegt wurden. Bei Fohlen, die mit aus
Bodenproben isolierten Rhodococcus equi-Stämmen gefüttert wurden, waren keine klinischen Symptome festzustellen. Nach Fütterung von Isolaten aus klinisch kranken Fohlen aber waren schwere Erkrankungen der Tiere zu beobachten (FLATLA, 1942).
Auch BOWLES et al. (1987) und NAKAZAWA et al. (1983a) konnten im Mäusemodell nachweisen, dass die Virulenz der unterschiedlichen Rhodococcus equi-Isolate nicht einheitlich ist. Stämme aus klinisch erkrankten Tieren scheinen virulenter zu sein als aus der Umwelt gewonnene Stämme. Außerdem ist die Virulenz bei Stämmen aus Bodenproben aus endemischen Gebieten höher als bei denjenigen, die aus Gegenden ohne Krankheitsausbruch gewonnen wurden (TAKAI et al., 1991). Das Vermögen der Stämme, intrazellulär zu überleben und sich dort zu vermehren, machten NAKAZAWA et al. (1983a) für die Virulenz verantwortlich. Nach Infektionsversuchen zeigten die Fohlen, die virulente Isolate verabreicht bekommen hatten, gravierende Krankheitserscheinungen mit akuter Bronchopneumonie. Aus diesen pulmonalen Läsionen konnten immer Virulenzplasmid tragende Rhodococcus equi-Stämme isoliert werden. Im Gegensatz dazu zeigten die Fohlen, die mit avirulenten Stämmen infiziert worden waren, weder Lungenveränderungen noch Anzeichen klinischer Symptome. Daraus schlossen WADA et al. (1997), dass das Fehlen von Virulenzplasmiden zu einem Pathogenitätsverlust führt. Die Fähigkeit sich in Makrophagen zu vermehren, scheint mit Virulenz assoziiert zu sein und korreliert mit der Ausbildung eines großen Plasmids, das ein oberflächlich exprimiertes Lipoprotein kodiert: das virulenzassozieierte Protein A (VapA).
Der pathogene Einfluss eines anderen Proteins (VapB) auf Fohlen war zunächst unbekannt. Nach Untersuchungen an infizierten Fohlen aber wurde nachgewiesen, dass es zwar zu Infektionen mit fokal granulomatösen Lungenläsionen durch Rhodococcus equi-Stämme mit VapB-Antigenen kommt, die Virulenz dieser Stämme aber wesentlich niedriger ist als von Stämmen, die VapA exprimieren (TAKAI et al., 1991, 1994c, 1995a). VapA und VapB sind in ihrer Aminosäuresequenz nahe verwandt, beide auf der Zelloberfläche lokalisiert und ihre Expression ist durch bestimmte Temperatur- und pH-Bereiche reguliert (TAKAI et al., 1995b, 1996).
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Untersuchungen von TAKAI et al. (2001) belegen das Vorkommen fünf verschiedener, nahe miteinander verwandter virulenzassoziierter Plasmide bei Rhodococcus equi, die in verschiedenen Ländern der Erde identifiziert wurden. Bei diesen fünf Plasmiden handelt es sich um das 85-kb Typ I Plasmid (p-REAT701), 85-kb Typ II (neuer Typ), 87-kb Typ I Plasmid (EcoRI und BamHI Tpy II), 87-kb Typ II (neuer Typ) und 90-kb (pREL1). Diese neuen Plasmide zeigen sehr ähnliche Polymorphismen in der Länge der Restriktionsfragmente wie das 85-kb Typ I Plasmid, weswegen die neu beschriebenen Plasmide ihren Namen erhielten. Der Hauptanteil der virulenten Rhodococcus equi-Isolate sowohl aus Fohlen- als auch aus Bodenproben enthalten das 85-kb Typ I – oder das 87-kb Typ I Plasmid.
Weitere Studien beschreiben zehn verschiedene Vap-Plasmide (VapA-P). Jedes dieser Plasmide exprimiert ein Vap-Gen (VapA-G), das für die Produktion von VapA kodiert (NICHOLSON and PRESCOTT, 1997, RAHL et al., 1999, TAKAI et al., 1999).
Nur Rhodococcus equi-Stämme, die VapA-P, bzw. VapA-G besitzen, exprimieren das Virulenzplasmid VapA. Plasmide, die virulenzassoziierte Proteine kodieren, können direkt durch ein Plasmid-Profil oder indirekt durch Auffinden von VapA-G oder VapA-P nachgewiesen werden (TAKAI et al., 1993a, 1993b, 1994a, 1995b).
2.5. Wechselwirkungen von Rhodococcus equi mit den humoralen und zellulären Komponenten der körpereigenen Abwehr
Als Grund, dass vor allem Fohlen an Rhodococcus equi-Infektionen erkranken, wurde das inkompetente Immunsystem und die damit verbundenen, unvollständig ausgebildeten zellulären Abwehrmechanismen erachtet (YAGER, 1987, WOOLCOCK et al., 1987, PRESCOTT, 1991). ZINK et al. (1985) waren dagegen der Meinung, dass die Fohlen an einer zu geringen Menge an „Surfaktant“ und damit an einer unzureichender Makrophagenaktivität leiden. Die Behandlung von Alveolarmakrophagen mit „Surfaktant“ konnte die Aufnahme von Keimen in die Makrophagen steigern (BELLANTI et al., 1979). Die Bakterien werden in vivo zellassoziiert aufgefunden, wobei vor allem in Makrophagen, aber auch in mehrkernigen Riesenzellen und neutrophilen Granulozyten Rhodococcus equi nachzuweisen war (JOHNSON et al., 1983, BOWLES et al., 1989). Aufgrund dieser
Erkenntnisse liegt die Vermutung nahe, dass Rhodococcus equi in phagozytierenden Zellen überleben, sich vermehren und zur Degeneration der Zellen führen könnte.
Nach Untersuchungen von HIETALA und ARDANS (1987b) sowie ZINK et al. (1987) vermag Rhodococcus equi in vitro in den Alveolarmakrophagen von Fohlen zu überleben und sich zu vermehren, so dass die Autoren den Keim als einen intrazellulär lebenden Organismus beschreiben. Den Mechanismen des Immunsystems entgeht der Keim durch Behinderung der Lysosomen-Makrophagen- Fusion in den Makrophagen (HIETALA und ARDANS 1987b, ZINK et al, 1987).
Dadurch kommt es zu einer irreversiblen Schädigung der Makrophagen und die intrazellulär gelegenen Bakterien werden in das umliegende Gewebe entlassen (ZINK et al., 1987). Vermutlich kommt es auch zu einer Degranulation von Lysosomen (YAGER, 1987). Nicht nur in Makrophagen, sondern auch in polymorphkernigen Granulozyten aus Pferdeblut wurde in vitro die bakterizide Aktivität durch Rhodococcus equi gehemmt (ELLENBERGER et al., 1984c). Wie HONDALUS und MOSSER (1994) aber nachweisen konnten, vermehren sich virulente Rhodococcus equi-Stämme stärker in Makrophagen als avirulente Stämme.
Die Interaktion von Rhodococcus equi mit seiner Wirtszelle wird durch eine komplementabhängige Adhärenz geprägt (HONDALUS et al., 1993, BERN und LÄMMLER, 1994). Ein bedeutender Mediator für die Adhäsion scheint die Komplementfraktion C3 zu sein. Die Bindung erfolgt über den zur Leukozytenintegrin-Familie gehörigen Komplementrezeptor MAC-1 der Makrophagenoberfläche. Rhodococcus equi adhäriert somit spezifisch an Makrophagen, nicht aber an Fibroblasten und Epithelioidzellen, sowie an verschiedenen Fibroblastoidzellen vom Menschen (HONDALUS et al., 1993).
Komplement scheint, im Gegensatz zu spezifischen Antikörpern, für die Abtötung von Rhodococcus equi eine untergeordnete Rolle zu spielen. Nach Opsonierung von Rhodococcus equi durch spezifische Antiseren, kommt es zu einem signifikanten Anstieg der Zahl der Bakterien in den Alveolarmakrophagen und neutrophilen Granulozyten. Innerhalb von sechs Stunden finden sich mehr als 90 % der abgetöteten Keime in den neutrophilen Granulozyten. In den Makrophagen ist eine vermehrte Phagosomen-Lysosomen-Fusion feststellbar. Alveolarmakrophagen von Fohlen, die Rhodococcus equi sensibilisiert sind, können die Keime effizienter
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abtöten als die Makrophagen von Fohlen, die keiner Sensibilisierung ausgesetzt worden sind (HIETALA und ARDANS, 1987b). Werden die Keime mit absorbiertem Antiserum behandelt, ist eine um 40 % reduzierte bakterizide Aktivität der neutrophilen Granulozyten zu beobachten (HIETALA und ARDANS, 1987a).
Neben der herausragenden Rolle der zellulären Immunabwehr bei Infektionen mit Rhodococcus equi (ELLENBERGER und GENETZKY, 1986, PRESCOTT, 1991), wird eine Verhinderung der Antikörperproduktion durch Bestandteile der Polysaccharidkapsel vermutet (SMITH, 1966, KNIGHT, 1969). Im Serum von Rhodococcus equi infizierten Tieren konnte jedoch ein IgM- und IgA-Anstieg festgestellt werden (TAKAI et al., 1987). Bei Infektionen mit Rhodococcus equi zeigen sowohl T-Helferzellen (CD4+-Zellen) als auch zytotoxische Zellen (CD8+-Zellen) in vivo einen maßgeblichen Einfluss auf die Immunität (NORDMANN et al., 1992b). Mäuse, denen der Thymus operativ entfernt wurde, sind innerhalb von drei Wochen nicht in der Lage, Rhodococcus equi zu eliminieren.
Gesunde Mäuse hingegen eliminieren in der gleichen Zeitspanne die Keime bis auf einen Bruchteil (KANALY et al., 1993).
Eine Infektion mit Rhodococcus equi scheint außerdem eine gesteigerte Ausschüttung unspezifischer Abwehrmediatoren hervorzurufen, da es nach Inkubation einer Milzzellkultur mit lebenden Rhodococcus equi-Isolaten zu einem Anstieg des von den Makrophagen gebildeten Tumor-Nekrose-Faktors (TNF-α) kommt (NORDMANN et al., 1993b). Nach Behandlung von mit Rhodococcus equi- infizierten Mäusen mit Antikörpern gegen TNF-α und Interferon-γ (IFN- γ), kann ein Anstieg der Bakterien im Lungen-, Milz- und Lebergewebe beobachtet werden. Als Aktivator der bakteriziden Mechanismen in den Makrophagen gelten TNF-α und IFN-γ (NORDMANN et al., 1993b). Auch in aus Menschen isolierten Stämmen kann ein toxischer Faktor nachgewiesen werden, der ausschließlich auf Fibroblasten- und Epithelzelllinien Auswirkungen zeigt (NORDMANN et al., 1994). Die Autoren vermuten, dass bei Rhodococcus equi-Isolaten vom Menschen ein Zusammenhang zwischen der Virulenz, der Resistenz gegenüber β-Lactam-Antibiotika und der Resistenz gegenüber der Abwehr durch Makrophagen vorliegt. Lebende Rhodococcus equi-Isolate führen durch die Bildung relevanter
Wirkungsmechanismen eher zu einer protektiven Immunität als attenuierte oder abgetötete Stämme (TAKAI et al., 1999).
2.6. Diagnose von Rhodococcus equi-Infektionen
Die klinische Verdachtsdiagnose der Lungenentzündung durch Rhodococcus equi wird nicht in allen Fällen durch den kulturellen Nachweis bestätigt (MARTENS et al., 1982). Dies liegt daran, dass der Erreger periodisch ausgeschieden wird und außerdem möglicherweise dadurch, dass Rhodococcus equi eine intrazelluläre Überlebensstrategie aufweist (MARTENS et al., 1982). Als effektivste Methode zur Klärung der Ätiologie der Infektion gilt die Isolierung des Erregers vom Infektionsort in Kombination mit der zytologischen Untersuchung des Tracheobronchialsekretes (PRESCOTT, 1991, GIGUÈRE und PRESCOTT, 1997).
2.6.1. Hämatologische Parameter
Zur Erkennung von kranken Fohlen in einem Bestand mit endemischer Rhodococcus equi-Infektion wird die Blutplättchenkonzentration verwendet. Gesunde Fohlen weisen eine Blutplättchenkonzentration von 250 +/- 100 x 109/Liter auf, wohingegen Fohlen, die an einer Rhodococcus equi-Infektion erkrankt sind eine mit 815 +/- 328 x 109/Liter deutlich erhöhte Konzentration aufwiesen (LEADON et al. 1988).
Auch ein Differentialblutbild inklusive der Konzentration an Plasmaproteinen und Fibrinogen sollte zur Sicherung der Diagnose von Rhodococcus equi-Infektionen durchgeführt werden. Die Hyperfibrinogenämie ist ein sehr häufiger Befund im Zusammenhang mit einer Rhodococcose. Eine neutrophile Leukozytose mit oder ohne Monozytose spricht ebenfalls für eine Infektion mit Rhodococcus equi (FALCON et al., 1985, SWEENEY et al., 1987).
2.6.2. Zytologische und mikrobiologische Nachweisverfahren
Zum Nachweis von Rhodococcus equi gelten mikrobiologische Untersuchungen von Tracheobronchialsekret als nicht verlässlich (MARTENS et al., 1982), wobei aber nach Studien von MÜLLER und MADIGAN (1992), LAVOIE et al. (1994) und ANZAI et al. (1997) diese Methode als sehr erfolgreich beschrieben wurde.
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Letztgenannten Autoren war es gelungen, Rhodococcus equi aus Tracheobronchialsekret neun Tage nach Infektion der Fohlen kulturell nachzuweisen.
Fohlen, die keine klinischen Krankheitserscheinungen zeigen, können jedoch durch eingeatmeten, kontaminierten Staub, Rhodococcus equi im Tracheobronchialsekret aufweisen. Auf einer Farm, auf der Rhodococcus equi-Infektionen enzootisch auftraten, konnte bei 35 % der untersuchten, aber klinisch unauffälligen Fohlen, ein kulturell positives Ergebnis bezüglich Rhodococcus equi erzielt werden (ARDANS et al., 1986). Aus diesem Grund sollte eine bakteriologische Untersuchung immer in Zusammenhang mit zytologischen Verfahren, aber auch den klinischen und serologischen Ergebnissen gegenübergestellt werden (GIGUÈRE und PRESCOTT, 1997).
Auch für die zytologische Untersuchung auf Rhodococcus equi war Tracheobronchialsekret gut geeignet. SWEENEY et al. (1987) konnten in 61 % der untersuchten Proben, die in der Kultur positiv waren, intrazelluläre, gram positive, pleomorphe Stäbchen identifizieren.
Proben aus bronchioalveolarer Lavage sind hingegen weniger gut für die Rhodococcus equi-Diagnostik geeignet, da etwa die Hälfte der an Pneumonie erkrankten Pferde keine zytologischen Veränderungen der Lavageflüssigkeit aufwiesen (ROSSIER et al., 1991). Um zuverlässige Ergebnisse durch bakteriologische Kulturen zu erzielen, führten HASHIKURA et al. (2000) Versuche durch, in denen sie einen Katheter nasotracheal bis zur Carina tracheae vorschoben und Sekret aspirierten. Diese nicht invasive, einfache und effektive Methode scheint weitaus sicherer als eine transtracheale Punktion. Allerdings muss eine Kontamination durch Keime aus den Nasengängen berücksichtigt werden. In Kombination mit einer PCR konnten dann aber auch aus nasotrachealen Proben virulente bzw. avirulente Stämme von Rhodococcus equi nachgewiesen werden (HASHIKURA et al., 2000).
Einer anderen, aufwändigeren Methode zum Nachweis von Rhodococcus equi, bei der durch einen Lymphozyten-Stimulationstest die zelluläre Immunreaktion bestimmt wird, bedienten sich PRESCOTT et al. (1980). Dazu verglichen die Autoren die Reaktion peripherer Leukozyten bei Fohlen, die nach Infektion mit Rhodococcus equi erkrankten mit der von denen, die nicht an einer Rhodococcus equi-Infektion erkrankt
waren. Im Blutbild von Fohlen, die erkrankt oder sich in der Rekonvaleszenz befanden, war eine signifikant größere Lymphozytenantwort zu erkennen als bei den Tieren, die zu der Kontrollgruppe zählten. Dieses sehr sensible Verfahren kann aber nur bei Fohlen bis zu einem Alter von zwei Monaten angewandt werden, da bei älteren Fohlen und erwachsenen Pferden die Lymphozyten-Reaktion stärker in Erscheinung treten kann als bei erkrankten Tieren.
Um eine frühe Diagnose einer durch Rhodococcus equi bedingten Enteritis zu stellen, schlugen TAKAI et al. (1986c) vor, die Erreger im Kot der Tiere auszuzählen.
Lag eine Erkrankung vor, erhöhte sich die Zahl der Bakterien von 4 auf 7-8 x 1010 pro Gramm Kot.
2.6.3. Serologische Diagnostikverfahren
Indirekte serologische Verfahren zum frühen Nachweis spezifischer Antikörper gegen Rhodococcus equi gelten für die Diagnostik als ungeeignet. Dies liegt daran, das Fohlen schon sehr früh und mit noch nicht ausgereiftem Immunsystem dem Antigen ausgesetzt sind und maternale Antikörper das Testergebnis beeinflussen können.
Dadurch kann es zu falsch positiven Reaktionen kommen. Spezifische und ausreichend sensitive kommerzielle Tests sind bis heute noch nicht erhältlich (GIGUÈRE und PRESCOTT, 1997).
Besonders direkte serologische Nachweisverfahren sind heute in der Diagnostik von Rhodococcus equi-Infektionen von Bedeutung. Bei den serologischen Diagnostikverfahren spielt vor allem der Agar-Gel-Immunodiffusionstest, aber auch die synergistische Hemmung der Hämolyse eine wichtige Rolle. Ganz besonders bedeutsam ist hier aber auch der ELISA. Alle Rhodococcus equi-Stämme produzieren Exoenzyme, die so genannten „Equi-Faktoren“ (PRESCOTT et al., 1982). Mit dem Agar-Gel-Immunodiffusionstest können präzipitierende Antikörper gegen diese Exoenzyme im Serum natürlich oder experimentell infizierter Fohlen nachgewiesen werden (NAKAZAWA, 1980). Auch mit verwendeten Equi-Faktoren als Antigene konnten NAKAZAWA et al. (1987) Rhodococcus equi-Infektionen mit gleicher Methode diagnostizieren, wobei allerdings auch bei einer geringen Zahl der gesunden oder nicht infizierten Fohlen ein positives Testergebnis herauskam.
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Als weiteres Diagnostikverfahren prüften PRESCOTT et al. (1984a) die Hemmung der synergistischen Hämolyse. Die Autoren wiesen mit dieser Methode spezifische Antikörper gegen Equi-Faktoren bei infizierten Fohlen nach. In diesem Falle führen die Exoenzyme von Rhodococcus equi zusammen mit der von Corynebacterium pseudotuberculosis gebildeten Phospholipase D, oder dem von Staphylococcus aureus produzierten β-Toxin zu einer Hämolyse der Erythrozytenmembran (LINDER und BERNHEIMER, 1982). Die Präsenz von Antikörpern gegen diese Exoenzyme führt zu einer Hemmung der Hämolyse. Mit Hilfe dieses Testverfahrens ist es möglich, auch subklinische Infektionen zu diagnostizieren (GASKIN et al., 1990).
Letztendlich sind bisher vier verschiedene ELISA-Verfahren beschrieben worden, um die humorale Immunantwort gegen Rhodococcus equi zu untersuchen.
TAKAI et al. (1985a) etablierten einen ELISA mit dem Tween 20-Extrakt eines bestimmten Rhodococcus equi-Stammes, dem „typ strain“ ATCC 6939 als Antigen.
Bei diesem Verfahren handelt es sich um eine sehr sensible Methode, durch die auch eine nur geringe Menge von Antikörpern gegen Rhodococcus equi nachgewiesen werden kann. Da der „typ-strain“ ATCC 6939 die breiteste Kreuzreaktivität mit anderen Serotypen auswies, wurde er als Antigen ausgewählt.
Einen weiteren ELISA-Test an 2879 Seren von Fohlen und erwachsenen Pferden etablierten SANADA et al. (1992) und stellten in 318 Fällen (11 %) eine positive Antikörper-Reaktion fest, wobei die positive Antikörperrate bei weiblichen Tieren höher lag als bei männlichen. Bei Pferden, die älter als zwei bis drei Jahre alt waren, war diese Diskrepanz nicht mehr feststellbar.
2.6.4. Bildgebende Diagnostikverfahren
Als bildgebende Diagnostikverfahren für Rhodococcus equi-Infektionen haben sich besonders die röntgenologischen und die ultrasonographische Untersuchung bewährt. Daneben werden, wenn auch anekdotisch, die scintigraphische (MARKEL et al., 1986) und die computertomographische Untersuchung (MARKEL et al., 1988, WION et al., 2001) erwähnt.
Lungenabszesse, so HILLIDGE (1986), sind auch schon vor Auftreten klinischer Symptome nachweisbar und können röntgenologisch nachgewiesen werden. Diese
zeigen sich im Röngtenbild als regionale Verschattungen (FALCON et al., 1985).
Abszesse können darüber hinaus Gas enthalten und deswegen röntgenologisch einfach dargestellt werden. Knotige Lungenveränderungen und Lymphadenopathien, die bei Fohlen im Alter unter drei Monaten röntgenologisch festgestellt werden, weisen auf eine Infektion mit Rhodococcus equi hin, wobei auch Streptococcus equi subsp. zooepidemicus zu Lungenabszessen führt und deswegen in der Diagnosefindung berücksichtigt werden muss (LAVOIE et al, 1994).
Die transkutane ultrasonographische Untersuchung ist ebenfalls ein geeignetes Verfahren zur Diagnose von Rhodococcus equi, wobei in diesem Falle die Lungenveränderungen peripher liegen müssen und die Ausdehnung und die Anzahl der Läsionen nicht genau auszumachen sind.
2.7. Kultureller Nachweis von Rhodococcus equi
Über das Habitat von Rhodococcus equi werden in der Literatur verschiedene Ansichten vertreten. Vor allem in Erde, Wasser, Dung und Abfall sind diese ubiquitär vorhandenen nocardiformen Actinomyceten zu finden. Als Erdsaprophyt wird Rhodococcus equi von JENSEN (1934), ROONEY (1966), SMITH (1966), SIPPEL et al. (1968) und KNIGHT (1969) beschrieben. Als Bewohner des Gastrointestinaltraktes hingegen sehen den Keim KARLSON et al. (1940). Die weitere Umgebung von Tieren, so BRUNER et al. (1939) und WILSON (1955) sei das natürliche Habitat von Rhodococcus equi. BARTON und HUGHES (1981) stellten wiederum fest, dass ein Nachweis mit Hilfe von Selektivmedien notwendig ist, um Aussagen über das genaue Vorkommen von Rhodococcus equi zu treffen.
Mit Hilfe von Selektivmedien gelang es WOOLCOCK et al. (1979) den Organismus in 90 von 127 Kotproben von Pferden nachzuweisen. Für diesen Nachweis verwendeten sie das sogenannte NANAT-Selektivmedium (Nalidixin-Acid- Novobiocin-Acid-Tellurit), das aus Agar-Agar, Aqua-dest., tryptisch verdautem Sojaeiweiß als flüssiges Medium (TSB) und Hefeextrakt, mit Zusatz von Novobiocin, Nalidixinsäure, Cycloheximid und Kaliumtellurit zusammengesetzt ist. Sogar aus staubigen Spinnweben, die aus mit infizierten Fohlen besetzten Ställen gewonnen wurden, konnte Rhodococcus equi nachgewiesen werden (SMITH und ROBINSON, 1981). Der Nachweis von Rhodococcus equi gelang TAKAI et al. (1987) auch aus
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der Stalluft, indem Platten mit NANAT-Medium für 15 Minuten ca. einen Meter hoch aufgestellt und anschließend für drei Tage im Labor bei 37°C bebrütet wurden. Auch für den Nachweis von Rhodococcus equi aus dem Trinkwasser von Schafen und Rindern wurde NANAT-Medium verwendet. Das Sediment des zuvor zentrifugierten Wassers wurde auf das Selektivmedium aufgetragen und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert (CARMAN und HODGES, 1987). Zum Nachweis von Rhodococcus equi aus Kot- und Bodenproben verglichen BARTON und HUGHES (1981) verschiedene Selektivmedien und konnten feststellen, dass das TANP-Medium für die Isolation besonders geeignet ist. TANP ist ein flüssiges Medium aus TSB und Zusätzen von Nalidixinsäure, Cycloheximid, Penicillin und Kaliumtellurit. Dieses Medium wird entweder allein oder in Verbindung mit unterschiedlichen festen Medien eingesetzt.
Diese weiteren Selektivmedien sind durch Zugabe von Kaliumtellurit (M3-Medium) oder Cycloheximid (Tinsdale-Medium) in ihrer Zusammensetzung modifiziert (ROWBOTHAM und CROSS, 1977). Für die Isolierung von Rhodococcus equi aus dem Direktausstrich aus Boden- und Kotproben ist das M3T-Medium am besten geeignet. Die Verbindung von Anreicherung in TANP-Flüssigmedium und anschließendem Ausstreichen auf M3T-Agar erlaubt allerdings ebenfalls einen sichereren Nachweis von Rhodococcus equi aus Kotproben (BARTON und HUGHES, 1981). Um die störende oder hemmende Begleitflora abzutöten, wird 2,5 %ige Oxalsäure verwendet, indem das mit Polymyxin-B versetzte TANP-Medium nach der Inkubation zentrifugiert und das Sediment anschließend für eine Stunde mit Oxalsäure behandelt wurde (SMITH und ROBINSON, 1981).
Anschließend wird das Sediment mit Na-Phosphat neutralisiert, nochmals zentrifugiert und auf ein festes Tellurit-Selektivmedium, das mit Amphotericin-B versetzt ist, ausgestrichen. Für den Nachweis von Rhodococcus equi aus Bodenproben wurde das sogenannte YCC-Medium angewandt, das gegenüber dem herkömmlichen NANAT-Medium für besser geeignet gehalten wurde (TAKAI und TSUBAKI, 1985, und TAKAI et al., 1986a und b). Beim YCC-Medium handelt es sich um NANAT-Medium, auf der Basis von Hefe-Casein-Cystein.
Auch aus infektiösem Material gelingt der Nachweis von Rhodococcus equi. Nach Abbrühen von Lymphknoten mit kochendem Wasser und anschließendem Ausstreichen auf Schafblutagar kann das Bakterium isoliert werden
(MUTIMER und WOOLCOCK, 1980). Nach Inkubation von Gewebeproben, die aus an Enteritis erkrankten Fohlen entnommen wurden, und anschließendem Ausstreichen auf Blutagar und Thioglycolatmedium, gelingt es Rhodococcus equi aus Lunge, Lymphknoten und Darm zu isolieren (CIMPRICH und ROONEY, 1977).
Auch aus Lymphknoten von Schweinen, die an Lymphadenitis erkrankt oder aber gesund sind, gelingt schließlich der Nachweis von Rhodococcus equi, indem die Proben direkt auf NANC-Medium ausgestrichen werden (KATSUMI et al., 1991).
NANC-Medium besteht aus tryptisch verdautem Sojaeiweiß (TSA) unter Zusatz von Nalidixinsäure, Novobiocin und Cycloheximid. Aus venösem Blut von erkrankten Pferden, das für 10 Tage in Para-Amino-Benzoesäure- und CO2-versetztem Hirn- Herz-Flüssigmedium (BHIP-PAP) bei 37°C bebrütet wurde, kann Rhodococcus equi ebenfalls isoliert werden (MARTENS et al., 1982). Zum Direktausstrich von Sputum- und Kotproben Rhodococcus equi-infizierter Menschen, eignet sich am besten Hirn- Herz-Agar (MAGNANI et al., 1992, WOOLCOCK et al., 1979). Dabei besteht allerdings der Nachteil, dass auch Pseudomonaden und Candida spp. auf diesem Nährmedium wachsen, während einige Rhodococcus equi-Stämme hierauf kein Wachstum zeigen (BARTON und HUGHES, 1981). Um diesem Hindernis entgegenzuwirken, wurde der sogenannte CAZ-NB-Agar, ein neues Selektivmedium, das als Basis Müller-Hinton-Agar enthält, dem Novobiocin und Ceftazidim zugesetzt wird, entwickelt (VON GRAEVENITZ und PÜNTER-STREIT, 1995). Ceftazidim hemmt dabei das Wachstum gram negativer Bakterien. Das CAZ-NB-Medium (Ceftazidim-Novobiocin-Agar) ist nach Meinung der Autoren für den Nachweis von Rhodococcus equi sogar effektiver als das NANAT-Medium.
2.8. Morphologische Eigenschaften von Rhodococcus equi 2.8.1. Kolonienmorphologie und Pigmentierung
Bei Rhodococcus equi handelt es sich um ein aerobes Bakterium, das sich auf nicht selektivem Agar nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C als unregelmäßig runde, leicht durchscheinende, tränenförmige, glatt, glänzende, schleimige, 2 bis 4 mm große Kolonie, mit der Tendenz zu konfluieren zeigt (PRESCOTT, 1991). Als überwiegend rund mit glattem Rand beschrieben hingegen MAGNUSSON (1923), BULL (1924), DIMOCK und EDWARDS (1931) und JENSEN (1934) Rhodococcus equi-Kolonien.
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Die feucht glänzende, glatte Oberfläche von Rhodococcus equi verglich ROBERTS (1957) mit Wassertropfen. Drei verschiedene Formen der Kolonienmorphologie von Rhodococcus equi wurden von McNEIL und BROWN (1994) beschrieben: schwach purpurfarben und schleimige Kolonien, korallenrote und nicht schleimige Kolonien und als dritte schwach gelbe, nicht schleimige, aber opake Kolonien. MUTIMER und WOOLCOCK (1981) legten sich hingegen auf vier verschiedene Kolonienformen fest, die auf Blutagar zu sehen sind, wobei die häufigste Kolonienform aber die viskös-schleimig, durchscheinende Kolonie ist.
Als lachsfarbene von pink über gelblich, gelblich-rot bis gelbbraun, orange und backstein-rot bis rot beschrieben BARTON und HUGHES (1980) sowie auch GOODFELLOW (1986) die verschiedenen Pigmentierungen von Rhodococcus equi- Kolonien. Die Kolonien erscheinen zunächst grau-weiß oder grau. Erst nach weiterer Inkubation bei Raumtemperatur zeigt sich dann eine Pigmentierung (DAFAALA et al., 1960, GOLUB et al., 1967, LINTON und GALLAHER, 1969).
Vollkommen unpigmentiert erscheinen die von RAHMAN (1957) untersuchten Kulturen. Eine Pigmentbildung der Rhodococcus equi-Kolonien ist auch auf Milch- oder Kartoffelagar zu bemerken (BUXTON und FRASER, 1977). Die Kolonien zeigen auf Kartoffelagar ein Backstein-rotes Pigment (COTCHIN, 1943, KARLSON et al., 1940, MOITRA, 1972). Auf Agar mit Kaliumtellurit bildet Rhodococcus equi schwarze Kolonien (RAJAGOPALAN, 1936). Das Pigment von Rhodococcus equi ist nach PRADIP et al. (1966) ein Karotinoid, zu dessen Produktion Thiamin notwendig ist. Die Pigmentproduktion, so die Vermutung der Autoren, ist von der Zusammensetzung des jeweiligen Mediums abhängig, da das Thiamin das für die Karotinoid-Synthese notwendige Enzymsystem aktiviert und so eine Verfärbung der Kolonien bewirken kann. Wächst Rhodococcus equi in flüssigen Medien, ist eine gleichmäßige Trübung der Bouillon zu beobachten. Am Boden des Röhrchens wird zum Teil ein pigmentiertes Sediment beschrieben (JENSEN, 1934, MERCHANT, 1935, KARLSON et al., 1940). Auf der Oberfläche der Bouillon beobachteten WOODROOFE (1950), DAFAALA et al. (1960) und COBB (1963) die Bildung eines Häutchens.
Den Geruch von Rhodococcus equi-Kulturen beschrieb PRESCOTT (1991) als erdig, keinen spezifischen Geruch hingegen konnte SIMPSON (1964) feststellen.
Auf festen Medien angezüchtete und aus Abszeßmaterial isolierte Rhodococcus equi-Keime erscheinen zumeist kokkoid. In flüssigen Medien angezüchtete jüngere Kulturen zeigen sich als Stäbchen oder kurze Filamente mit rudimentären Verzweigungen (PRESCOTT, 1991). Bei Rhodococcus equi-Kulturen, die vom Menschen isoliert werden konnten, stellten EMMONS et al. (1991) und MAGNANI (1992) ebenfalls eine Pleomorphie fest. Abhängig von der Inkubationszeit änderten die Keime ihre Form von „bazillär“ bis „kokko-bazillär“ zu kokkoid (MAGNANI et al., 1992).
2.8.2. Mikroskopisches Aussehen und Anfärbbarkeit
Abhängig von den Kulturbedingungen ist die Morphologie von Rhodococcus equi als pleomorphes Bakterium variierend von „bazillär“ bis kokkoid zu beschreiben (PRESCOTT, 1991). McNEIL und BRAUN (1994) konnten feststellen, dass die Form der Bakterien sich mit der Bebrütungsdauer verändert. Junge Kulturen, die sechs Stunden lang inkubiert werden, zeigen eher „bazilläre“ Wuchsformen. In Kulturen, die über 24 h bebrütet werden, sind mehr kokkoide Formen vorhanden. Dieser Übergang von „bazillärer“ zu kokkoider Form, so GOODFELLOW (1989), entsteht durch Fragmentierung der stäbchenförmigen Keime, wobei der Zeitpunk dieser Fragmentierung von den Anzüchtungsbedingungen und deren Einfluss auf die bakterielle Wachstumsrate abhängig zu sein scheint (WILLIAMS et al., 1976).
Aus Sputum, Pleuralflüssigkeit, Bronchialspülungen und Blut konnten stäbchenförmige Rhodococcus equi-Keime durch WEINGAREN et al. (1988) isoliert werden. Vor allem kokkoide Formen, aber auch bazilläre Bakterien in Gewebe und eitrigem Probenmaterial waren hingegen in Untersuchungen von McNEIL und BRAUN (1994) zu finden. Vor allem in Flüssigmedien sind bazilläre Formen zu beobachten, die in der Lage sind, Verzweigungen zu bilden (GOODFELLOW, 1989, PRESCOTT, 1991).
Bei Rhodococcus equi handelt es sich nach heutiger Meinung der Wissenschaft um ein grampositives Bakterium (SELBITZ, 2002a). In Kulturen aber, die schon älter sind, können in der Gramfärbung auch als negativ zu beurteilende Bakterien gefunden werden (BARTON und HUGHES, 1980). Die Frage, ob es sich bei Rhodococcus equi um ein säurefestes Bakterium handelt, wurde lange kontrovers
