Semiquantitative Bestimmung von Antikörpern gegen Rhodococcus equi in Serum und Kolostrum bei Stuten und Fohlen mittels ELISA und der Vergleich mit Befunden der Lungenuntersuchung

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Aus der Klinik für Pferde und

dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Semiquantitative Bestimmung von Antikörpern gegen Rhodococcus equi in Serum und Kolostrum

bei Stuten und Fohlen mittels ELISA und

der Vergleich mit Befunden der Lungenuntersuchung

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Anna-Linda Triskatis aus Pinneberg

Hannover 2004

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Klug

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Klug

2. Gutachter: Prof. Dr. A. Tenter

Tag der mündlichen Prüfung: 3.Juni 2004

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aus Liebe und Dankbarkeit

meinen Eltern gewidmet

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltverzeichnis

1. Einleitung ... 9

2. Literaturübersicht ... 10

2.1 Rhodococcus equi ... 10

2.1.1 Taxonomie und Geschichte... 10

2.1.2 Bedeutung und Verbreitung... 10

2.1.3 Morphologie und Kultur... 13

2.1.4 Infektion von Fohlen... 15

2.1.5 Pathogenese und Virulenzproteine, Plasmide... 16

2.1.6 Pathologische Veränderungen bei erkrankten Fohlen... 17

2.1.7 Impfung von Stuten und Fohlen... 19

2.2 Immunologie ... 20

2.2.1 Übertragung von Immunglobulinen (Ig) durch Kolostrum... 20

2.2.1.1 ... Immunglobuline beim Pferd ... 20

2.2.1.2 ... Die Plazentation der Stute ... 21

2.2.1.3 ...Kolostrum der Stute ... 22

2.2.1.4 ... Aufnahme der Immunglobuline durch das Fohlen ... 22

2.2.1.5 ...Entwicklung der antikörpervermittelten Immunität beim Fohlen ... 23

2.2.2 Methoden zur Rhodococcus-equi-Diagnostik... 24

2.2.2.1 ...Agar-Gel-Immunodiffusion ... 25

2.2.2.2 ... Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) ... 26

2.2.3 Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern... 27

2.2.3.1 ...Rhodococcus-equi-Antikörpernachweis im Stutenserum ... 27

2.2.3.2 ...Rhodococcus-equi-Antikörpernachweis im Kolostrum ... 27

2.2.3.3 ...Rhodococcus-equi-Antikörpernachweis im Fohlenserum ... 28

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3. Material und Methoden ... 30

3.1 Allgemeines ... 30

3.1.1 Probanden... 30

3.1.2 Haltung der Pferde... 30

3.2 Die Versuchstiergruppe ... 31

3.2.1 Allgemeines... 31

3.2.2 Blutentnahme... 31

3.2.3 Serumgewinnung... 32

3.2.4 Entnahme und Verarbeitung der Kolostrumproben... 32

3.3 Erhebung der klinischen Daten... 32

3.3.1 Wöchentliche klinische Untersuchung der Fohlen... 32

3.3.2 Bestimmung der Leukozyten im Fohlenblut... 34

3.3.3 Ultraschalluntersuchung klinisch auffälliger Fohlen... 35

3.3.4 Tracheo-Bronchoskopie der Fohlen mit sonographischen Befunden... 35

3.4 ELISA zur Bestimmung von Rhodococcus-equi-Antikörpern ... 36

3.4.1 Auswahl des Rhodococcus-equi-Stammes für die Antigenpräparation.... 36

3.4.2 Antigenpräparation... 37

3.4.3 Durchführung des Rhodococcus equi-ELISA... 38

3.4.3.1 ...Prinzip des ELISA ... 38

3.4.3.2 ... Voruntersuchungen ... 39

3.4.3.3 ... Beschichtung der Testplatten ... 39

3.4.3.4 ... Durchführung des ELISA ... 40

3.5 Statistische Auswertung... 41

3.5.1 Studie A... 41

3.5.2 Studie B... 41

4. Ergebnisse... 43

4.1 Änderungen des California ELISA ... 43

4.2 Studie A ... 44

4.2.1.1 Rhodococcus equi-Antikörper in Kolostrum und Serum ... 45

4.2.1.2 Alter und Parität der Stuten ... 46

4.2.1.3 Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent... 47

4.2.1.4 Erkrankungsalter der Fohlen ... 47

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4.2.1.5 Vergleich der erkrankten und nicht erkrankten Fohlen der Studie A... 48

4.3 Zusammenhänge der Parameter der Studie A ... 50

4.3.2 Zusammenhang des Rhodococcus-equi-Antikörper-Gehaltes von Stutenserum und Fohlenserum... 52

4.3.2.1 ...Zusammenhang des Rhodococcus equi-Antikörper-Gehaltes von Kolostrum und Fohlenserum ... 52

4.3.2.2 ...Korrelationen des Stutenalters mit der Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten... 53

4.3.2.3 ... Korrelation des Stutenalters und der Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten mit der OD im Stutenserum... 54

4.3.2.4 ... Korrelation des Stutenalters und der Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten mit der OD des Kolostrums ... 55

4.3.2.5 ... Korrelation des Stutenalters und der Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten mit der OD im Fohlenserum ... 55

4.3.2.6 ... Korrelationen des Stutenalters und der Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten mit dem Erkrankungsalter der Fohlen ... 56

4.3.2.7 ...Korrelationen des Anteils der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent mit den in der Studie A erhobenen Parametern ... 56

4.3.2.8 ... Korrelation des Erkrankungsalters der Fohlen mit den in der Studie A erhobenen Parametern... 56

4.4 Studie B ... 56

4.4.1 Ergebnisse der Studie B... 57

4.4.2 Vergleich der erkrankten Fohlen mit den nicht erkrankten Fohlen... 58

4.4.2.1 OD-Wert der Fohlen zu den Zeitpunkten der 1., 4., 8. und 12. Lebenswoche ... 58

4.4.3 Vergleich der Medianwerte der Blutleukozyten der 4 Zeitpunkte... 60

4.4.4 Verlauf des klinischen Scores über 12 Lebenswochen ... 61

5. Diskussion ... 63

5.1 Diskussion der Methoden ... 63

5.1.1 Probengewinnung und –verarbeitung... 63

5.2 Diskussion der Ergebnisse ... 65

5.2.1 Studie A... 65

5.2.2 Studie B... 66

5.3 Schlussfolgerung ... 68

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6. Zusammenfassung ... 71

7. Summary ... 73

8. Literaturverzeichnis ... 75

9. Anhang ... 96

10. Abkürzungsverzeichnis... 105

11. Danksagung ... 107

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1. Einleitung

1. Einleitung

Rhodococcus equi, zunächst als Corynebacterium equi bezeichnet, ist ein grampositives, fakultativ intrazelluläres, pleomorphes Bakterium, welches zu der Familie der Mykobakterien gehört und schwerwiegende Pneumonien mit hoher Morbidität und Mortalität bei Fohlen bis zu 4 Monaten verursachen kann (MARTENS et al., 1982; TAKAI et al., 1994). Es ist ein weltweit ubiquitär vorkommender

unbeweglicher Bodenkeim, der auch im Kot von klinisch unauffälligen Tieren nachgewiesen werden kann (BARTON u. HUGHES, 1981).

In den meisten Fällen verursacht Rhodococcus equi eine chronische granulomatöse Bronchopneumonie, häufig vereint mit einer Lymphadenitis bei 1 bis 4 Monate alten Fohlen. Es sind aber auch zahlreiche extrapulmonale Erkrankungen in

Zusammenhang mit einer Rhodococcus equi Infektion gebracht worden.

Bei anderen Tierarten, überwiegend Schwein und Rind, wurde Rhodococcus equi hauptsächlich bei Abszessen, abszedierenden Lymphknoten und Arthritiden nachgewiesen, er muss somit auch differentialdiagnostisch beim

Tuberkuloseverdacht in der amtlichen Fleischuntersuchung berücksichtigt werden (DÜRRLING, 1991).

Beim Menschen hat der Keim als Pneumonieerreger vorwiegend im Zusammenhang mit HIV-Infektionen oder anderen immunsuppressiven Erkrankungen oder

Behandlungen Bedeutung (VERVILLE et al., 1994).

Impfungen, sowohl der Stute ante partum als auch des Fohlens, scheinen nicht gegen eine Infektion zu schützen (MARTENS et al., 1992).

Ziel der vorliegenden Untersuchung war es darum zu überprüfen, ob ein Zusammenhang zwischen dem Antikörpergehalt im Serum und Kolostrum von

Mutterstute und im Serum des entsprechenden Fohlens mit der Klinik, d. h. Zeitpunkt und Schwere der Erkrankung, besteht. Der Antikörpergehalt wurde mit einem ELISA nach einer modifizierten Methode von HIETALA et al. (1985) bestimmt.

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2. Literaturübersicht

2. Literaturübersicht 2.1 Rhodococcus equi

2.1.1 Taxonomie und Geschichte

Erstmals wurde Rhodococcus equi als Erreger eitriger Pneumonien bei Pferden von MAGNUSSON (1923) in Schweden beschrieben. Diesem Bericht folgten zahlreiche andere, wobei anfänglich keine Einigkeit über die Benennung des Keims herrschte.

MAGNUSSON (1923) bezeichnete den Erreger als Corynebacterium equi,

wohingegen JENSEN (1934) und KRASIL`NIKOV (1966) aufgrund der Ähnlichkeit mit Mykobakterien Mycobacterium equi vorschlugen.

HOLTMANN (1945) isolierte den Keim aus einem Kalb mit Pneumonie und sprach sich darum für die tierartunspezifische Bezeichnung Corynebacterium purulentus aus. GORDON (1966) hielt Mycobacterium rhodococcus für einen geeigneten Namen. BOUSFIELD und GOODFELLOW (1976) schlugen letztendlich die

Schaffung eines neuen Genus vor. Da Untersuchungen des Zellwandaufbaus von GOODFELLOW und MINNIKIN (1978) sowie Ergebnisse von DNA- und RNA- Analysen (SUZUKI et al., 1981) den Keim deutlich von Mykobakterien und Corynebakterien unterschieden (BARTON, 1992; PRESCOTT, 1991), herrschte nunmehr Einigkeit über die Neubenennung als Rhodococcus equi. Der Name Rhodococcus bezieht sich auf die morphologischen Veränderungen während der Wachstumsphase (rod to coccus) (PRESCOTT, 1991).

Phylogenetisch gehört dieses Genus zusammen mit den Genera Nocardia, Caesobacter, Gordana und Tsukamurella zu der Gruppe nocardioformer Actinomyceten (PRESCOTT, 1991).

2.1.2 Bedeutung und Verbreitung

Rhodococcus equi tritt weltweit auf und ist verantwortlich für eine Morbidität von 40 bis 80 % und einer Mortalität von 5–17 % bei Fohlen in den ersten 4 Lebensmonaten (MARTENS et al., 1982; AINSWORTH, 1999). Er wird weltweit für bis zu 5 % aller Todesfälle bei Fohlen in der genannten Altersgruppe verantwortlich gemacht (BLOOD et al., 1983).

Der Keim verursacht zunächst subklinisch verlaufende eitrige Pneumonien

(MARTENS et al., 1982). Die Erkrankung bricht klinisch bei Fohlen zwischen dem 2.

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und 4. Lebensmonat in Form einer eitrig abszedierenden Lungenentzündung aus.

Dabei wird bisher vermutet, dass die in dieser Zeit abnehmenden maternalen Antikörper und die noch nicht ausreichende Immunantwort des Fohlens die Erkrankung begünstigen (BARTON und HUGHES, 1980).

Nicht nur durch die hohe Mortalität, die durch Rhodococcus equi entsteht, kommt es zu substanziellen Verlusten auf den betroffenen Betrieben. Auch die

arbeitsaufwendige, teure und häufig sehr lange Behandlung verursacht eine erhebliche finanzielle Belastung (MARTENS et al., 1982). Um die Verluste durch Mortalität und Medikationskosten einzugrenzen, ist eine konsequente Überwachung der gefährdeten Fohlen zur Früherkennung zu empfehlen (MARTENS et al., 1982;

COHEN, 2000). Allerdings ist diese Überwachung ihrerseits ebenfalls sehr zeit- und kostenaufwendig.

Obwohl Rhodococcus equi keine Sporen bildet, erweist sich der Keim als sehr resistent gegenüber Umwelteinflüssen. Im Boden überlebt Rhodococcus equi auch bei direkter Sonneneinstrahlung über 12 Monate (MAGNUSSON, 1938). In vivo ist ein aus der Lunge eines Pferdes isolierter Rhodococcus equi auch nach 15 Jahren Wachstum auf einem einfachen Nährboden noch virulent (MAGNUSSON, 1938). Da Rhodococcus equi aus Bodenproben nachgewiesen werden konnte, unabhängig davon, ob dort Tiere gehalten wurden oder nicht (JENSEN, 1934), vermutet SMITH (1966), dass dieser Keim ubiquitär und natürlich im Boden vorkommt. Da

Rhodococcus equi eine hohe Isolierungsrate aus Kotproben von klinisch

unauffälligen Pferden hat, nehmen CARMAN und HODGES (1987) an, dass es sich eher um einen natürlichen Darmbewohner bei Pferden handelt. Da Rhodococcus equi ein obligat aerober Keim mit einem Wachstumsoptimum bei 28-30 °C und empfindlich gegenüber Gallensalzen ist, schließen sie den Gastrointestinaltrakt als ein natürliches Habitat aus. TAKAI und TSUBAKI (1985) bestätigten dies, indem sie feststellten, dass Rhodococcus equi zwar in frischem, rektal entnommenem Dung nachweisbar ist (mit einer Isolierungsrate von 46,7 % beim adulten Pferd), jedoch sowohl die Erregeranzahl als auch die Isolierungsrate aus Bodenproben deutlich höher war (100 % auf der Weide). Der Keim ist auch im Kot von anderer Tierarten, vornehmlich Herbivoren mit Weidegang und nahezu nicht in Hunde- und Katzenkot,

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nachzuweisen (CARMAN u. HODGES, 1987). Hiermit liegt die Vermutung nahe, dass der Keim mit der Nahrung in den Darmtrakt gelangt. Die Frage der Herkunft konnte letztendlich aber nicht sicher geklärt werden. TAKAI und TSUBAKI (1985) vermuten, dass Rhodococcus equi in einem Zyklus zwischen Haustieren

(insbesondere Pferden) und dem Boden ihrer Umgebung lebt.

Rhodococcus equi ist häufig in den Sommermonaten bei warmem, windigem Wetter und nur selten bei feuchter Umgebung aus der Stallluft zu isolieren (TAKAI et al., 1987). Auch eine deutliche Anhäufung von Rhodococcus-equi-Pneumonien über die Sommermonate (Mai bis August) wird verzeichnet, was zu der Bezeichnung

„Sommerpneumonie“ führte (TAKAI u. TSUBAKI, 1985).

MAGNUSSON (1938) stellte fest, dass der Keim im Boden über ein Jahr lang am Leben bleibt und vermutete, dass Rhodococcus equi sich dort auch vermehren kann, was BARTON und HUGHES (1981) bestätigen.

Als Ursachen für das überwiegende Auftreten von Rhodococcosen beim Fohlen wurden dessen unreifes Immunsystem und die besseren Lebensbedingungen für Rhodococcus equi im Fohlendarm angeführt (BARTON u. HUGHES, 1980; YAGER, 1987). Die Infektion manifestiert sich beim Fohlen am häufigsten durch eine eitrige Bronchopneumonie mit Abszessbildung und einer begleitenden eitrigen

Lymphadenitis (YAGER, 1987). Rhodococcus equi verursacht auch Durchfälle, da er in die Colonschleimhaut einwandern kann. Wahrscheinlich gelangen die Bakterien durch Abschlucken von ausgehustetem Lungensekret in den Intestinaltrakt

(BARTON u. HUGHES, 1980).

Zusätzlich, wenn auch deutlich seltener werden neben den Veränderungen an Darm und Lunge bei Rhodococcus-equi-infizierten Fohlen Arthritiden, Serositiden,

Hautabszesse, Osteomyelitis und Niereninfarkte gefunden (MARTENS et al., 1982;

ZINK et al., 1986; AINSWORTH, 1999).

Bei erwachsenen Pferden wurden bisher keine klinischen Fälle beschrieben

(PRESCOTT, 1991). ZINK et al. (1986) gelang es jedoch, vereinzelt Rhodococcus equi neben anderen abortauslösenden Keimen aus dem Uterus infertiler Stuten und aus abortierten Fohlen zu isolieren.

Bei zahlreichen anderen Tierarten wurde Rhodococcus equi zwar im Kot

nachgewiesen (CARMAN u. HODGES, 1987), der Keim verursacht aber nur selten

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Erkrankungen. Überwiegend handelt es sich dabei um eitrige Entzündungen mit Tendenz zur Abszedierung, vorwiegend an Lunge und Lymphknoten. Nur beim

Schwein wird Rhodococcus equi häufiger sowohl aus granulomatös entzündeten, wie auch aus unveränderten Mandibularlymphknoten nachgewiesen (PRESCOTT,

1991).

Die beim Menschen beschriebenen Isolierungen von Rhodococcus equi stammen überwiegend aus Krankheitsprozessen. Bei Kotproben von gesunden Menschen konnten MUTIMER und WOOLOCK (1979) nur in 2 von 521 Proben Rhodococcus equi nachweisen. Das Anzüchten von grampositiven Stäbchen und Kokken aus Proben von immunsupprimierten Patienten wird häufig als Kontamination

angesehen, Rhodococcus equi spielt eine untergeordnete Rolle in der

Humanmedizin. Die Bedeutung als Zoonose entwickelte sich erst zusammen mit der steigenden Anzahl von HIV-Infektionen (BERG et al., 1977). Menschen, die durch eine Rhodococcus-equi-Infektion gefährdetet sind, sind meistens durch HIV-Infektion oder eine lang andauernde Glykokortikoid- oder Zytostatika-Behandlung

immunsupprimiert (BERG et al., 1977, TAKAI et al., 1994). Die Erkrankung manifestiert sich auch beim Menschen überwiegend durch Bildung von eitrigen Kavernen im Respirationstrakt, aber auch durch intracerebrale, paraspinale oder Hautabszesse. Häufig ist anamnestisch der Kontakt der erkrankten Personen mit Pferden und deren Dung nachzuweisen (PRESCOTT, 1991; TAKAI et al., 1994), die als Infektionsquelle angesehen werden. THOMSEN et al. (1968) beschrieben einen der ersten Fälle einer durch Rhodococcus equi verursachten cervicalen

Lymphadenitis bei einem 9 Monate alten Kind, welches an rohen Karotten gesaugt hatte. Da aus dem Boden, dem die Karotte entstammte, Rhodococcus equi

nachgewiesen werden konnte, wurde vermutet, dass auch beim Menschen eine orale Infektion möglich ist. Hauptsächlich bildet jedoch die Lunge beim Menschen den primären Ort der Infektion (LASKY et al., 1991; TAKAI et al., 1994).

2.1.3 Morphologie und Kultur

Mikroskopisch ist Rhodococcus equi ein pleomorphes, grampositives Bakterium, das während des Wachstums sowohl bazilläre als auch kokkoide Formen annimmt (BARTON u. HUGHES, 1980; PRESCOTT, 1991). Dabei fanden MCNEIL und

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BROWN (1994) in jungen, 6 Stunden alten Kulturen überwiegend bazilläre Formen.

Mit zunehmendem Alter der Kultur wurden die Bakterien immer kokkoider, bis die Autoren ab etwa 24 Stunden nur noch die kokkoide Form fanden.

Auf festen, nicht selektiven Nährböden zeigt sich Rhodococcus equi typischerweise nach 24 bis 48 Stunden bei 37 °C aerober Bebrütung als unregelmäßig runde Kolonie mit glattem Rand, deren Durchmesser zwischen 1 bis 4 mm variiert. Die Kolonien sind feucht, glatt, glänzend, schleimig und zeigen ein Wachstum mit konfluierender Tendenz. Die meisten Kulturen zeigen eine lachsfarbene

Pigmentierung und haben einen erdigen Geruch. Die Pigmentierung variiert von lachsfarben über bräunlich, rötlich bis gelblich und backsteinrot (MAGNUSSON, 1923, PRESCOTT, 1991). Einige von MUTIMER und WOOLCOCK (1981) gefundene Isolate weichen von der typischen Form und Pigmentierung ab. Die Autoren unterscheiden die Morphologie von Rhodococcus equi nach dem

Wachstumsverhalten auf Blutagar in 4 Typen, deren Beschreibung von klassisch schleimig bis hin zu sehr kleinen, trockenen Kolonien reichen. Die Einführung von Selektivmedien erleichterte die Diagnostik und verbesserte die Isolierungsraten.

WOOLCOCK et al. (1979) benutzten dazu das so genannte Nalidixin-Acid-

Novobiocin-Acid-Tellurit Medium (NANAT- Medium). Es handelt sich dabei um ein festes Agar-Agar Nährmedium, das aus tryptisch verdautem Sojaeiweiß, Hefeextrakt und Aqua destillata mit Zusätzen aus Nalidixinsäure, Novobiocin, Cycloheximid und Kaliumtellurit besteht (WOOLCOCK, 1979). VON GRAEVENITZ und PÜNTER- STREIT (1995) verwendeten mit dem CAZ-NB-Agar (Ceftazidim-Novobiocin-Agar) ein neues Selektivmedium, dessen Grundlage Müller-Hinton-Agar ist und dem Novobiocin und Ceftazidim zugesetzt wurden. Dieses Medium erwies sich als

effektiver als das NANAT-Medium. Es konnten auf dem neuen CAZ-NB-Agar aus 11 von 15 Proben Rhodococcus equi nachgewiesen werden, aus denen die Isolierung zuvor auf NANAT nicht gelungen war. Um den Keim aus Boden- und Kotproben zu isolieren, erwies sich das von BARTON und HUGHES (1981) eingesetzte TANP- Medium (TSB mit Zusätzen von Cycloheximid, Nalidixinsäure, Penicillin und Kaliumtellurit) als äußerst nützlich.

Letztendlich erwies sich aber die Rhodococcus equi Isolierung mit Hilfe des

ursprünglichen NANAT-Mediums als günstigste Methode. TAKAI et al. (1987) gelang

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damit sogar die Isolierung von Rhodococcus equi aus der Stallluft (WOOLCOCK et al., 1979; BARTON u. HUGHES, 1981; TAKAI u. TSUBAKI, 1985).

Der diagnostische Nachweis von Rhodococcus equi am lebenden Fohlen gelingt am besten aus dem Tracheobronchialsekret (MARTENS et al., 1982). Ein negatives Ergebnis schließt jedoch eine Infektion durch Rhodococcus equi nicht aus (MANNSMAN u. KNIGHT, 1972). Da der Nachweis aus dem Nasentupfer als

schwierig gilt, ist ein negatives Ergebnis nicht aussagefähig (MARTENS et al., 1982).

Der Post-mortem-Nachweis aus Lymphkoten oder Lungenabszessen gelingt dagegen nahezu immer (MARTENS et al., 1982).

2.1.4 Infektion von Fohlen

Da Rhodococcus equi ein ubiquitär vorkommender Bodenkeim ist, sind die

Möglichkeiten für den Infektionsweg vielfältig. Die Übertragung kann oral, aerogen, omphalogen, über Wunden, intrauterin bis hin zur Übertragung durch wandernde Parasitenlarven erfolgen (BARTON u. HUGHES, 1980; YAGER, 1987). In der

Literatur finden sich zahlreiche Vermutungen darüber, welcher Weg der „übliche“ ist, der zur typischen abszedierenden Bronchopneumonie führt. Die primär intestinale Infektion mit nachfolgender Infektion der Lunge erscheint sehr wahrscheinlich. Es wird weiterhin vermutet, dass Koprophagie, die bei jungen Fohlen häufig beobachtet wird, zusammen mit dem Anstieg der Erreger im Stutenkot im späten Frühjahr zu einer Infektion der Fohlen führt (TAKAI et al., 1986, 1987). BLOOD et al. (1983) empfehlen aus diesem Grund sogar das Anlegen von Maulkörben bei jungen Fohlen, um die Koprophagie zu unterbinden. Ferner führen diese Autoren das Stuteneuter als Infektionsquelle an, da die Stuten es beim Liegen mit Kot verunreinigen. Dies kann nur ausgeschlossen werden, wenn Fohlen nur an frisch gewaschenen Eutern saugen.

Bei Versuchen von PRESCOTT et al. (1980) und JOHNSON et al. (1983) wurden die Fohlen zunächst oral, dann direkt in den Magen mit Rhodococcus equi infiziert. Die Tiere entwickelten ausnahmslos innerhalb von 2 bis 3 Wochen schwere ulzerative Colitis und Adenitis der assoziierten Darmlymphknoten. Veränderungen in der Lunge beschränkten sich dagegen auf wenige solitäre Lungenabszesse.

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Versuche mit aerogener Infektion durch intranasale, intratracheale oder

intrabronchiale Inokulation führen dagegen zur klassischen Rhodococcus-equi- Pneumonie (HILLIDGE, 1982; MARTENS et al., 1982; SMITH, 1982). Die somit induzierten Lungenläsionen werden vorwiegend in der rechten Lunge, in den vorderen und ventralen Lungenlappen angetroffen und stimmen mit den Läsionen einer natürlichen Infektion überein (MARTENS et al., 1982; JOHNSON et al., 1983;

BARTON u. EMBURY, 1987).

Das gehäufte Auftreten in einem bestimmten Lungenbereich ist typisch für eine Infektion durch Inhalation und stellt ein Argument gegen eine hämatogene Streuung in der Lunge dar (MARTENS et al., 1982; SMITH, 1982; BARTON u. EMBURY, 1987). Auch das gehäufte Auftreten von Rhodococcus equi Pneumonien zur trockenen Jahreszeit und in staubiger Umgebung spricht für die Inhalation des mit dem Keim infizierten Staubes als hauptsächlichen Infektionsweg (MAGNUSSON, 1923; HILLIDGE, 1982; MARTENS et al., 1982; SMITH, 1982; JOHNSON et al., 1983; BARTON u. EMBURY, 1987; AINSWORTH, 1999).

2.1.5 Pathogenese und Virulenzproteine, Plasmide

Die pathogene Wirkung von Rhodococcus equi wird in seiner Eigenschaft, die Phagosom-Lysosom-Fusion zu verhindern und das dadurch ermöglichte Überleben in Makrophagen vermutet (ZINK et al., 1987; PRESCOTT; 1991). Diese Annahme wird untermauert durch die Erkenntnis, dass Alveolarmakrophagen von Fohlen in vitro Rhodococcus equi nicht effektiv abtöten, wohingegen neutrophilen

Granulozyten dies gelingt (ZINK et al., 1982). Neutrophile Granulozyten verursachen allerdings durch Freisetzen reaktiver Sauerstoffmoleküle oder lysosomaler Enzyme Läsionen im umliegenden Gewebe (YAGER et al., 1986). Zwischen der Virulenz der Stämme und deren Fähigkeit, intrazellulär zu überleben, scheint eine Abhängigkeit zu bestehen. In pathogenen Rhodococcus equi–Stämmen finden sich die so genannte 15-17-Kilodalton-(kDa)-Virulenzproteine (Virulence associated Protein, Vap). Diese Proteine werden in allen untersuchten Proben, die von erkrankten Fohlen stammen, nachgewiesen, jedoch nur zu einem geringen Prozentsatz in Isolaten aus Bodenproben (TAKAI et al. 1991; 1993; 1995; 1996).

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Durch Infektion von Mäusen mit Rhodococcus equi werden deutliche Unterschiede in der Virulenz verschiedener Rhodococcus-equi-Stämme gezeigt (BOWLES et al.

1987). In Versuchen an experimentell infizierten Labormäusen zeigen nur solche Mäuse klinische Symptome, denen Stämme inokuliert werden, die Virulenzproteine exprimieren. Somit wurde die Vermutung, dass Virulenzproteine zur Entstehung klinischer Symptome beim infizierten Fohlen notwendig sind, im Mäusemodell verifiziert (TAKAI et al. 1991; 1993; 1995; 1996). PRESCOTT et al. (1996) und TAKAI et al. (1996) gelang der Nachweis spezifischer Antikörper gegen die 15-17- kDa-Virulenzproteine.

Die Expression der Virulenzproteine scheint abhängig von der Inkubation und von dem zur Anzucht benutzten Nährmedium zu sein. Nur bei einer

Inkubationstemperatur zwischen 34 °C und 41 °C und nur in nährstoffarmen Medien werden die 15-17 kDA Virulenzproteine mit Hilfe von SDS-PAGE nachgewiesen (TAKAI et al., 1991). Die Expression des VapA ist vor allem bei saurem pH-Wert und bei 38 °C nachzuweisen (TAKAI et al., 1995). Daraus schlossen die Autoren, dass dieser Vorgang im Organismus in den Phagolysosomen stattfindet, da in diesen ähnliche Bedingungen vorliegen.

Im Zusammenhang mit den 15-17-kDa-Virulenzproteinen wurden zwei Plasmide nachgewiesen, von denen nur eines bei den virulenten Stämmen vorkommt (TAKAI et al., 1993). KANNO et al. (1993) erstellten daraufhin eine Restriktionskarte des virulenzassoziierten Rhodococcus-equi-Plasmids pREAT 701, auf dem die DNA (Desoxyribonukleinacid)-Sequenz, welche die 15-17-kDa-Proteine codiert, lokalisiert wurde. TAKAI et al. (1995) injizierten plasmidtragende und plasmidlose

Rhodococcus equi Stämme intravenös in Labormäuse. Ausschließlich nach Injektion von plasmidtragenden Stämmen wurde eine humorale Antwort mittels ELISA

(Enzyme-linked immunosorbent assay) und Western Blot nachgewiesen.

2.1.6 Pathologische Veränderungen bei erkrankten Fohlen

Pathologisch kommen eine pulmonale Form und eine abdominale Form bei Fohlen vor (TAKAI et al., 1985; ZINK et al., 1986; AINSWORTH, 1999).

Die weniger häufige abdominale Form manifestiert sich in einer ulzerativen Enteritis, häufig einhergehend mit Arthritiden und subakuten Abszessen. 50 % der betroffenen

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Fohlen zeigen eine nekrotisierende Enterocolitis (SMITH u. JANG, 1980; Zink et al., 1986; YAGER, 1987; PRESCOTT, 1991; TAKAI et al., 1991). Die bei der

abdominalen Form häufig gefundenen, durch Rhodococcus equi verursachten Veränderungen anderer Organe beschränken sich zumeist auf die Gelenke in Form von eitrigen Polyarthritiden oder vertebralen Osteomyelitiden (FIRTH et al., 1980;

PRESCOTT, 1994). Die abdominale Form wird nur selten ohne Lungensymptome gefunden (PRESCOTT, 1991).

Die pulmonale Form manifestiert sich beim Fohlen als subakute bis chronische, purulente Bronchopneumonie. Sie geht meistens mit einer akuten Adenitis der Lymphknoten im Hals- und Thoraxbereich einher. Diese schwellen bis auf die

achtfache Größe an und zeigen sich von nur leicht ödematisiert bis nekrotisch (JUBB u. KENNEDY, 1970; FIRTH et al., 1980; SMITH u. JANG, 1980; TAKAI et al., 1985;

ZINK et al., 1986).

Das typische Sektionsbild eines an einer Rhodococcus equi Pneumonie verendeten Fohlens zeigt eine schwere, nicht kollabierte dunkle Lunge, deren Spitzenlappen durch eine eitrig-konfluierende und abszedierende Bronchopneumonie verändert sind. Im Lungenparenchym befinden sich milliare bis 7 cm große Abszesse, die von einer dünnen Wand umgeben sind (MAGNUSSON, 1923; MARTENS et al., 1982;

LINTON u. GALLAHER, 1996; AINSWORTH, 1999).

Der meistens zähflüssige bis käsige Inhalt der Abszesse ist von graurot-gelblicher Farbe und von unangenehm fauligen Geruch (AINSWORTH, 1999).

Histologisch befinden sich in den Wänden der Lungenalveolen eine große

Ansammlung von Makrophagen und deutlich weniger neutrophile Granulozyten. Die Makrophagen enthalten massenhaft grampositive kokkobazilläre Bakterien. Die Bronchiolen sind mit Zelldetritus gefüllt, die intraalveolären Septen meistens noch vorhanden (RAJAGOPALAN, 1936; SMITH u. ROBINSON, 1981; PRESCOTT, 1981;

AINSWORTH, 1999).

Diese schwerwiegenden Veränderungen sind nicht mehr erfolgreich therapierbar.

Da klinische Symptome meist aber erst in diesem Stadium deutlich erkennbar sind, liegt der Schwerpunkt der Bekämpfung bei der Prophylaxe und der Früherkennung der Rhodococcose beim Fohlen (RAJAGOPALAN, 1936; MARTENS et al., 1982;

PRESCOTT, 1991; AINSWORTH, 1999).

(19)

2.1.7 Impfung von Stuten und Fohlen

Es ist bisher noch nicht gelungen, eine Rhodococcus-equi-Erkrankung durch Impfung zu verhindern.

Die Rolle von Serumantikörpern gegen Rhodococcus equi wurde untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass Rhodococcus-equi-Antikörper die Bakterien effektiv markieren und so die phagozytäre und bakterizide Aktivität der equinen Phagozyten steigern (ZINK et al., 1982; MARTENS et al., 1987/88).

Die passive Immunisierung durch die parenterale Gabe von Hyperimmunplasma bietet bei Fohlen einen Schutz vor Rhodococcus equi nach experimenteller

(MARTENS et al., 1989; PERKINS et al., 2001) und natürlicher Infektion (MADIGAN et al., 1991).

Die Vermutung, dass eine passive Immunisierung der Fohlen via Kolostrum eine Möglichkeit bieten könnte, Fohlen vor Rhodococcus-equi-Pneumonien zu schützen, ist nahe liegend (MARTENS et al., 1992). Es gelang, nach Vakzinierung tragender Stuten, im Vergleich zu einer nicht vakzinierten Kontrollgruppe; eine signifikante Erhöhung der Antikörper gegen Rhodococcus equi im Stutenserum und Kolostrum zu messen. Auch im Fohlenserum konnten signifikant höhere Antikörperspiegel gemessen werden. Es konnte jedoch kein adäquater Schutz vor experimentell induzierten Rhodococcus equi-Pneumonien erreicht werden.

In einer anderen Studie stellten die Autoren fest, dass eine Kombination aus Impfung der tragenden Stute und des Fohlens in der 3.–7. Lebenswoche Schutz vor einer Rhodococcose durch natürliche Infektion mit Rhodococcus equi bot (VARGA et al., 1997). In ihrer Kontrollgruppe erkrankten 4 von 21 Fohlen. In der Versuchsgruppe erkrankte keins von 15 geimpften Fohlen (VARGA et al., 1997). Es ist anzunehmen, dass die Impfung von tragenden Stuten und Fohlen gleichzeitig mit hygienischen Verbesserungsmaßnahmen eingeführt wurde. Die Senkung der Morbidität auf dem Betrieb kann nicht nur der Impfung zugeschrieben werden.

Die Steigerung der Immunabwehr der Schleimhäute durch eine DNA-Vakzine könnte Erfolg versprechend sein. Es liegen bis heute jedoch noch keine

Untersuchungsergebnisse darüber vor (HILSENROTH, 2000; COHEN et al., 2002).

(20)

2.2 Immunologie

2.2.1 Übertragung von Immunglobulinen (Ig) durch Kolostrum 2.2.1.1 Immunglobuline beim Pferd

Die Kenntnisse über Immunglobuline (Ig) beim Pferd sind noch unvollständig. So ist bisher noch nicht endgültig geklärt, welche Isotypen beim Pferd vorkommen. Die Einteilung der Immunglobulinklassen bei Pferden basiert auf dem

Wanderungsverhalten in der Elektrophorese (HALLIWELL u. GORMAN, 1989). Aus früheren Studien ergeben sich acht verschiedene Immunglobuline beim Pferd (ROCKEY et al., 1964). Die acht Immunglobuline wurden in folgende Klassen oder Subklassen eingeteilt (ROCKEY, 1967; SUTER u. FEY, 1981):

• IgM

• IgG mit den Subklassen:

! IgGa

! IgGb

! IgGc,

! IgG(T)

• IgA

• sekretorisches IgA

• IgE

IgD konnte beim Pferd noch nicht nachgewiesen werden. Angenommen wird, dass es wie beim Menschen überwiegend als Antigenrezeptor auf der Oberfläche von B- Lymphozyten vorkommt (HALLIWELL u. GORMAN, 1989).

Die Eigenschaften der Immunglobulinklassen beim Pferd entsprechen größtenteils denen der anderen Haussäugetiere (TIZARD, 1981).

Beim Pferd wird IgG im Blutserum mit 80 % am häufigsten bestimmt. Mit einer Halbwertzeit von 18 bis 23 Tagen ist IgG beim Pferd am längsten von allen

Immunglobulinen haltbar. Wegen der geringen Größe von 180.000 Dalton kann IgG aus dem Blutserum austreten und ist bei Immunreaktionen in Gewebsräumen nachweisbar. Der IgG-Antigen-Komplex ist für die Aktivierung des

Komplementsystems verantwortlich (TIZARD, 1981).

(21)

Equines IgM ist mit 900.000 Dalton das größte und schwerste Immunglobulin. Es ist überwiegend als Pentamer im Serum zu finden. IgM hat durch seine starke

Bindungsvalenz agglutinierende, komplementaktivierende und zytotoxische Aktivität (TRAUTWEIN, 1982).

IgA wird beim Pferd überwiegend aus seromukösen Sekreten nachgewiesen. Sein Molekulargewicht liegt bei 360.000 Dalton. Es wird hauptsächlich als Dimer

gefunden. Am IgA kann eine sekretorische Komponente nachgewiesen werden.

Dabei handelt es sich um ein Protein, welches IgA vor proteolytischen Enzymen schützt. IgA ist in großen Mengen im Kolostrum zu finden und sorgt im Darmtrakt von neugeborenen Fohlen für eine passive, lokale Immunität (BACHMANN et al., 1982).

Die physiologische Aufgabe des IgE besteht in der Abwehr von Parasiten. Es hat beim Pferd ein Molekulargewicht von 196.000 Dalton und ist für allergische Reaktionen vom Typ 1 zuständig (TIZARD, 1981).

2.2.1.2 Die Plazentation der Stute

An der Plazenta wird die Placenta fetalis (Chorion) von der Placenta maternalis (Endometrium) unterschieden. Histologisch besteht die Plazenta der Stute aus den 6 folgenden Schichten (MICHEL, 1983):

- Endothel des Endometriums - Bindegewebe des Endomeriums - Epithel des Endometriums - Epithel des Chorions

- Bindegewebe des Chorions - Endothel des Chorions

Der Stoffaustausch erfolgt durch Diffusion. Die Diffusionsstrecke ist durch die sechs Schichten sehr lang, weswegen eine deutliche Trennung zwischen dem Kreislauf des Fohlens und dem der Stute vorhanden ist (MICHEL, 1983). Nur Stoffe bis zu einem bestimmten Molekulargewicht können diese Schranke passieren. Für Makromoleküle wie Immunglobuline ist die Plazentarschranke undurchlässig. Erst im letzten Drittel der Trächtigkeit kommt es, bedingt durch eine Auflockerung des Chorionepithels und

(22)

eine Reduktion maternaler Epithelanteile, zu einer Verkürzung der Diffusionsstrecke.

Dadurch wird ein geringer Transfer von maternalen Antikörpern möglich. Zur gleichen Zeit ist der Fötus bereit, einen im Uterus gesetzten Antigenreiz mit der Bildung quantitativ geringer Mengen spezifischer Immunglobuline des Typs IgG und IgM zu beantworten (THEIN, 1983). Ein ausreichender Infektionsschutz ist dadurch nicht gegeben, das Fohlen ist auf die kolostrale Aufnahme von Immunglobulinen angewiesen (THEIN, 1983).

2.2.1.3 Kolostrum der Stute

Das Kolostrum ist ein zu Beginn der Laktation abgegebenes energiereiches Sekret, das einen höheren Gehalt an Eiweiß, Vitaminen, Mineralstoffen, Leukozyten und Immunglobulinen besitzt als das während der restlichen Laktation abgegebene Sekret. Alle neugeborenen Haussäugetiere verfügen nur über geringe

Energiereserven. Sie sind darum auf die Kolostrumaufnahme direkt nach der Geburt angewiesen (THEIN, 2003). Beim Pferd spielt die Übertragung von Immunglobulinen durch das Kolostrum eine besonders große Rolle (LÖWE u. MEYER 1979;

WIESNER u. RIBECK 2000).

In den letzten Wochen der Trächtigkeit findet eine selektive Anreicherung der Immunglobuline in der Milchdrüse der Stute statt (SMITH et al., 1971).

Ab neun Stunden post partum wird zunehmend IgA in das Kolostrum abgegeben, das, passiv vom Fohlen aufgenommen, in erster Linie zu einem muzingebundenen Immunschutz im Fohlendarm führt. Die Kontrolle dieses komplexen Geschehens erfolgt über die Veränderung des Östrogen-Progesteron-Quotienten. (SMITH et al., 1971; THEIN, 2003)

2.2.1.4 Aufnahme der Immunglobuline durch das Fohlen

Das Fohlenserum vor der Kolostrumaufnahme des Fohlens hat keine nachweisbaren Immunstoffe. Erst nach der ersten Kolostrumaufnahme werden Antikörper

nachweisbar (SCHNEIDER u. SZATHMARY, 1940; BURTON et al., 1981).

Der Immuntiter des Kolostrums sinkt in den ersten 24 Stunden nach der Geburt auf nahezu null ab. Diese zeitliche Begrenzung geht von Seiten der Stute aus (THEIN, 1983). Daneben sind auch von Seiten des Fohlens Grenzen der Immunglobulin-

(23)

Absorption nachzuweisen. Der gesamten Dünn- und Dickdarm gilt als zur Resorption von Immunglobulinen genutzte Fläche (JEFFCOTT, 1972; TIZARD, 1981). Die

Aufnahme der maternalen Immunkörper erfolgt aktiv mittels Pinozytose durch die jugendlichen Darmzellen des neonatalen Intestinaltraktes. Über die Lymphe

gelangen die Antikörper in die Blutbahn. Dabei arbeiten die Darmzellen nicht selektiv (JEFFCOTT, 1975). Somit entspricht die Zusammensetzung der Immunglobuline des Neugeborenen der des Kolostrums. Die Absorption der Antikörper wird durch die geringen Verdauungsvorgänge möglich, gleichzeitig konnten im Kolostrum Trypsininhibitoren nachgewiesen werden, die einen Abbau der Antikörper im

Verdauungstrakt verhindern (JEFFCOTT, 1975; TIZARD, 1981; THEIN, 1983). Das Absorptionsmaximum im Fohlendarm liegt bei 3 bis 6 Stunden post partum. 20 Stunden post partum liegt die Aufnahme unter einem Prozent (JEFFCOTT, 1976).

Dieser Absorptionsstillstand ist zeitgleich mit der Veränderung der Darmzellen. Die neonatalen Darmzellen werden unter Einfluss von Nebennierenhormonen durch spezialisierte epitheliale Darmzellen ausgewechselt. Diese haben die Fähigkeit zur Absorption von Makromolekülen verloren. Gleichzeitig setzt die enzymatische Verdauung der Globuline ein (KIM u. SCHMIDT, 1983).

2.2.1.5 Entwicklung der antikörpervermittelten Immunität beim Fohlen Das Immunsystem eines 80 Tage alten Fetus reagiert bereits auf einen

immunologischen Reiz mit der Bildung von reaktiven T-Zellen. Mit 185 Tagen kommt es schon zur Antikörperbildung durch B-Lymphozyten (THEIN, 1989). Somit ist der Organismus zum Zeitpunkt der Geburt zwar immunologisch kompetent, jedoch reicht die Menge gebildeter Immunglobuline nicht aus, um einer Infektion standzuhalten (THEIN, 1989). Das Fohlen besitzt vor der ersten Kolostrumaufnahme keine

nennenswerte Menge an Immunglobulinen. Ohne Kolostrumaufnahme innerhalb der ersten 20 Lebensstunden ändert sich dieser Zustand erst in einem Alter von 3-4 Monaten (MCGUIRE u. CRAWFORD, 1973; JEFFCOT, 1976; BURTON et al., 1981;

PERRYMAN, 1981). Fohlen mit ausreichender Kolostrumaufnahme weisen 18-24 Stunden post partum IgG-Werte auf, die denen erwachsener Pferde entsprechen.

Die unzureichende Kolostrumaufnahme direkt nach der Geburt wird für die meisten Infektionen von Neonaten verantwortlich gemacht (MCGUIRE et al., 1977; BURTON

(24)

et al., 1981; JULIA et al., 1999). Da die Halbwertzeit für IgG von Pferden bei 22 Tagen liegt (MC DOUGALL, 1975; PERRYMAN, 1981), erreichen die IgG-Werte von Fohlen zwischen der 4. und der 8. Woche nach der Geburt ihren Tiefpunkt, wenn die maternalen Antikörper größtenteils abgebaut sind. Die eigene Antikörpersynthese ist jedoch zu diesem Zeitpunkt noch nicht voll aktiviert (JEFFCOTT, 1975; CRAWFORD u. PERRYMAN, 1980; PERRYMANN, 1981; HINES u. HIETALA, 1996; PRESCOTT et al., 1996; JULIA et al., 1999). Erst mit 6 Monaten werden wieder Antikörperwerte zwischen 8 und 10 g/l ermittelt (CRAWFORD u. PERRYMAN, 1980).

Rhodococcus-equi-Pneumonien treten klinisch am häufigsten zwischen dem 2. und 4. Lebensmonat auf (KNOTTENBELT, 1993; JULIA et al., 1999). Nach dem 6.

Lebensmonat tritt eine Erkrankung durch eine Rhodococcus-equi-Infektion kaum mehr auf (AINSWORTH, 1999).

2.2.2 Methoden zur Rhodococcus-equi-Diagnostik

Die Möglichkeit, eine Rhodococcus-equi-Infektion durch den Einsatz

immunologischer Nachweisverfahren durch Detektion spezifischer Rhodococcus- equi-Antikörper nachzuweisen, wurde erstmals von NAKAZAWA (1980) beschrieben.

Als Verfahren wurde die Agar Gel Immundiffusion beschrieben.

Dem folgten zahlreiche Versuche die Nachweisverfahren zu verbessern. PRESCOTT et al. (1984) beschrieben einen Synergistic Hemolysis Inhibition (SHI) – Test,

SKALKA und SVASTOVA (1984, 1985) beschrieben einen Neutralisationstest und TAKAI et al. (1985) und HIETALA et al. (1985) etablierten den ersten ELISA zum Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern.

Rhodococcus-equi-Isolate werden seit 1991 mit der Technik des Immunoblots untersucht (TAKAI et al., 1991). Mit der Methode werden Antigene und Antikörper genauer charakterisiert.

Im Jahre 2002 wurden die Ergebnisse fünf verschiedener serologischer

Nachweisverfahren miteinander verglichen (MARTENS et al., 2002). Es wurden drei verschiedene ELISA-Techniken, die Agar-Gel-Immundiffusion (AGID) und die SHI eingesetzt. Keine der Methoden lieferte Ergebnisse, mit denen zwischen erkrankten

(25)

und gesunden Tieren unterschieden werden konnte, so dass sie der Früherkennung der Infektion dienen könnten (MARTENS et al., 2002).

Im Jahre 2003 wurde in einer ähnlichen Studie neben den drei oben genannten ELISA -Techniken und der AGID eine vierte ELISA-Technik eingeführt (GIGUERE et al., 2003). Mit der in dieser Studie neu eingesetzten Technik wurden die besten Ergebnisse bezüglich Sensitivität und Spezifität erreicht (GIGUERE et al., 2003).

2.2.2.1 Agar-Gel-Immunodiffusion

Die Nützlichkeit der AGID zum Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern wurde erstmals von NAKAZAWA (1980) beschrieben. Bei der AGID werden Antigen und Antikörper in löslicher Form auf eine Agar-Gel-Platte gegeben. Sowohl dem Antigen als auch dem Antikörper ist die Möglichkeit gegeben, sich radial gegeneinander auszubreiten. Im Berührungsbereich entstehen durch die Antigen-Antikörper- Komplexe sogenannte Präzipitationslinien. Anhand dieser Linien wird eine

semiquantitative Aussage über das Vorhandensein von Antikörpern gemacht. Die Autoren nutzten ein Proteinantigen, welches sie aus Kulturabschwemmungen präparierten (PRESCOTT et al., 1982). Die AGID wurde 1987 in einem Feldversuch getestet. Dabei wurde beschrieben, dass sie eine nützliche Methode zur Diagnostik von Rhodococcus equi Pneumonien sowohl vor als auch nach dem Auftreten klinischer Symptome sei (NAKAZAWA et al., 1987).

Mit Hilfe der AGID ließen sich spezifische Antikörper nachweisen, die nur bei erkrankten Fohlen gefunden werden konnten (GASKIN et al., 1990).

Die AGID wurde von verschiedenen Autoren mehrmals getestet, dabei wurden unterschiedliche Ergebnisse ermittelt. Die Spezifitäten, die die unterschiedlichen Autoren ermittelten, variierten von 0 % (MARTENS et al., 2002) über 58 % (GIGUERE et al., 2003) bis 100 % (NAKAZAWA, 1987). Ähnlich streuten die Ergebnisse bezüglich der Sensitivität.

Derartige Resultate machen die Interpretation einer AGID schwierig.

HIGUCHI et al. (1998) stellten fest, dass AGID eine Möglichkeit zur Frühdiagnose von Rhodococcus-equi-Pneumonien bieten kann, jedoch sehr kosten- und

zeitaufwendig ist. Aus diesen Gründen lehnen die Autoren AGID zum Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern ab.

(26)

MARTENS et al. (2002) und GIGUERE et al. (2003) hielten die AGID als serologisches Nachweisverfahren zur Erkennung von Rhodococcus equi

Pneumonien für nicht brauchbar, da sich die Ergebnisse von nachweislich infizierten und nachweislich nicht infizierten Tieren nicht signifikant unterscheidet.

2.2.2.2 Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Der ELISA gilt als schnell durchführbares und besonders sensitives diagnostisches Verfahren zum Nachweis von Antikörpern (NIELSEN, 1988). Deshalb wurden in den letzten Jahren mehrere verschiedene ELISA-Verfahren für die serologische

Diagnostik der Rhodococcus equi Pneumonien entwickelt und miteinander verglichen.

Mit dem ersten ELISA zum Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern gelang die Bestimmung erhöhter Antikörpertiter nach experimenteller Infektion bei drei Stuten nach subcutaner, bei drei anderen Stuten nach intratrachealer Infektion. Vier Stuten verblieben als Kontrollgruppe nicht infiziert (ELLENBERGER et al., 1984).

Es wurden dann zwei ähnliche Methoden zeitgleich beschrieben: der California ELISA (HIETALA et al., 1985) und der ATCC 6939-ELISA (TAKAI et al., 1985). Beide basieren auf der indirekten ELISA-Technik mit ähnlicher Antigenpräparation. TAKAI et al. (1985) testeten die Antigene verschiedener Stämme und stellten fest, dass eine Mikrotiterplatte, die mit präpariertem Antigen des apathogenen Stamms ATCC 6939 beschichtet wurde, sich zum Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern am besten eignete. Die Ergebnisse dieses ELISA weisen höhere Werte bezüglich Sensitivität und Spezifität auf als andere bekannte ELISA-Methoden. In einer Studie konnten Rhodococcus-equi-Infektionen durch den Einsatz des California ELISA in Kombination mit klinischer Überwachung, Leukozytenwerten und Bestimmung des Fibrinogenwertes frühzeitig erkannt werden (TAKAI et al., 1985). Dadurch konnten die Therapiedauer deutlich verkürzt und die Mortalität erheblich gesenkt werden.

In einer Feldstudie zur Früherkennung von Rhodococcus-equi-Pneumonien wird der Einsatz des ATCC 6939-ELISA in Kombination mit klinischer Überwachung als sehr erfolgreich bewertet (HIGUCHI et al., 1997).

Ein virulenzassoziierter ELISA, bei dem ein durch Triton X-114 fraktioniertes Antigen mit dominierendem VapA verwandt wurde, brachte den diagnostischen Vorteil der

(27)

Minimierung von falsch positiven Ergebnissen (PRESCOTT et al., 1996). Dies wurde durch eine Studie an 124 natürlich und 4 experimentell infizierten Pferden bestätigt (PRESCOTT et al., 1996). Es wurden Fohlen mit avirulenten und virulenten

Stämmen infiziert. Durch den Einsatz des VapA-ELISA konnte zwischen ihnen unterschieden werden.

Im Vergleich mit dem California ELISA und dem ATCC 6939-ELISA liefert der VapA- ELISA allerdings schlechtere Werte. Die besten Ergebnisse bezüglich Spezifität (88 %) und Sensitivität (59 %) liefert der California ELISA (GIGUERE et al., 2003).

Es empfiehlt sich die Benutzung eines stärker gereinigten Antigens, um die Spezifität eines ELISA-Tests zu verbessern.

Die zeitsparende einfache Durchführbarkeit und die Möglichkeit, dieses Verfahren auch zu automatisieren, sind weitere Vorteile, die für den Einsatz des ELISA in der Diagnostik sprechen (NIELSEN, 1988). Mittels ELISA konnten Rhodococcus equi Antikörper nicht nur in Serumproben, sondern auch in Kolostrumproben

nachgewiesen werden (MADIGAN et al., 1991).

2.2.3 Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern

2.2.3.1 Rhodococcus-equi-Antikörpernachweis im Stutenserum

Die Untersuchung von Seren adulter Pferde erfolgte bisher überwiegend zur Bestimmung des Referenzbereiches (von Rhodococcus-equi-Antikörpertitern bei Pferden) bei der Etablierung der ELISA Techniken. In Feldstudien, in denen gesunde Pferde auf Rhodococcus-equi-Antikörper getestet wurden, wiesen mehr als 75 % der Pferde diese Antikörper auf (ELLENBERGER et al., 1984; TAKAI et al., 1985;

HIELTALA et al., 1985).

Der Rhodococcus-equi-Antikörperverlauf im Serum von Stuten vor und nach einer Lebendimpfstoff-Vakzinierung wurde mit Hilfe des ELISA verfolgt (MARTENS et al., 1992). Rhodococcus-equi-Antikörpergehalt im Serum der Stuten stieg nach der Injektion signifikant an.

2.2.3.2 Rhodococcus-equi-Antikörpernachweis im Kolostrum

Rhodococcus-equi-Antikörper wurden durch den Einsatz des ELISA auch im Kolostrum nachgewiesen. Es wurden Untersuchungen zum Schutz vor

(28)

Rhodococcus-equi-Pneumonien beim Fohlen durch Impfung tragender Stuten mit Lebendimpfstoff 30, 60 und 90 Tage vor dem Abfohltermin durchgeführt (MADIGAN et al., 1991). Mittels ELISA wurden die Antikörpertiter von Stutenserum und

Kolostrum verglichen. Es war ein signifikanter Anstieg von Rhodococcus-equi-

Antikörpern im Kolostrum vakzinierter Stuten im Gegensatz zu der nicht vakzinierten Kontrollgruppe nachzuweisen.

In einer ähnlichen Untersuchung konnte ein Anstieg der Rhodococcus-equi- Antikörpertiter nach der Immunisierung einer Stute in deren Serum festgestellt werden (MARTENS et al., 1992). Die Fohlen dieser Stuten wiesen im Serum nach der Kolostrumaufnahme ebenfalls einen höheren Rhodococcus-equi-Antikörpertiter auf als Kontrollfohlen nicht vakzinierter Stuten. Die Autoren schlossen daraus, dass auch im Kolostrum vakzinierter Stuten ein höherer Rhodococcus-equi-Antikörpertiter vorliegen muss. Das Kolostrum wurde jedoch nicht von ihnen untersucht (MARTENS et al., 1992).

2.2.3.3 Rhodococcus-equi-Antikörpernachweis im Fohlenserum

Bei der Bestimmung des Rhodococcus equi-Antikörpertiters im Serum von Fohlen stand die Frage im Vordergrund, ob signifikant unterschiedliche Werte zwischen erkrankten und gesunden Fohlen bereits vor dem Auftreten klinischer Symptome vorliegen. Die Bestimmung der Antikörper gegen Rhodococcus equi im Fohlenserum gelang mittels ELSIA (ELLENBERGER et al., 1984; HIETALA et al., 1985; TAKAI et al., 1985) und AGID (NAKAZAWA, 1980). PRESCOTT et al. (1989) untersuchten den Rhodococcus-equi-Antikörperverlauf in Fohlenseren über einen Zeitraum von 12 Wochen in einem Betrieb, in dem Rhodococcus equi endemisch vorkommt. Sie konnten bereits in der ersten Lebenswoche Rhodococcus-equi-Antikörper

nachweisen. Es gelang ihnen aber aufgrund mangelnder Datenerhebung nicht, den Antikörperverlauf in Beziehung zu den erkrankten Fohlen zu setzen.

In einer Impfstudie an 99 Stuten und Fohlen wurden Probengruppen, die aus dem Serum der Stute, Kolostrum und dem Serum des Fohlens bestanden, untersucht (MADIGAN et al., 1991). Wenn die Antikörper-Werte in Kolostrum und Stutenserum hoch waren, wurden auch höhere Antikörperwerte im Fohlenserum nachgewiesen.

MARTENS et al. (1992) führten eine ähnliche Studie durch. Sie injizierten sechs

(29)

Ponystuten monatlich bis zum Abfohltermin Rhodococcus equi Lebendimpfstoff subcutan. Auf die Titerbestimmung im Kolostrum wurde verzichtet, jedoch kamen die Autoren zu demselben Ergebnis: Im Serum von Fohlen aus Stuten mit einem hohen Rhodococcus-equi-Antikörper Gehalt konnten höhere Antikörpertiter bestimmt werden als in der ungeimpften Kontrollgruppe (MARTENS et al., 1992).

In einer Feldstudie wurden in Betrieben mit endemischer Rhodococcose 22 Fohlen wöchentlich klinisch allgemein untersucht. Ihr Blut wurde wöchentlich mit dem

California ELISA (HIETALA et al., 1985) auf das Vorhandensein und den Verlauf von Rhodococcus-equi-Antikörpern untersucht, außerdem wurden daraus die

Leukozytenwerte bestimmt. Dadurch war eine frühere Erkennung der Rhodococcose möglich, und die Therapiedauer von Rhodococcus-equi-Pneumonien konnte

signifikant gesenkt werden.

Der ELISA im Einsatz zur Frühdiagnostik von Rhodococcus-equi-Pneumonien ist in Kombination mit anderen Screening-Methoden (Blutleukozyten, Blutfibrinogen) erfolgreich (TAKAI et al., 1985).

Dagegen wurde im Vergleich von 5 serologischen Methoden zum Rhodococcus equi- Antikörpernachweis (AGID, drei ELISA, SHI) der Nachweis durch ELISA sowie durch AGID und SHI als nicht sinnvolle Methode zur Unterscheidung erkrankter und

gesunder Fohlen bezeichnet (MARTENS et al., 2002). Demgegenüber erwies sich im Vergleich fünf anderer serologischer Methoden (AGID, vier ELISA) der California ELISA (HIETALA et al., 1985) als eine spezifische und sensitive Methode zum Nachweis von Rhodococcus-equi-Antikörpern (GIGUERE et al., 2003).

(30)

3. Material und Methoden

3. Material und Methoden 3.1 Allgemeines

3.1.1 Probanden

Die Probenentnahme zu den Untersuchungen dieser Studie fand vom 9. Juli 2003 bis zum 1. November 2003 auf einem Warmblutgestüt (Oldenburger Zuchtgebiet) in Norddeutschland statt. Das Gestüt existiert seit 10 Jahren. Seit Beginn erkranken dort Fohlen in den ersten 4 Lebensmonaten an Rhodococcus-equi-Pneumonien. In den letzten Jahren stieg die Morbidität stetig an, im Jahr 2003 lag sie bei 67 %, die Mortalität lag im Jahr 2003 unter 1 %.

In der vorliegenden Arbeit wurden 115 Zuchtstuten im Alter von 3 bis 20 Jahren und deren Fohlen, 57 Stutfohlen und 48 Hengstfohlen, berücksichtigt.

3.1.2 Haltung der Pferde

Die Pferde wurden überwiegend in Gruppen, während der Wintermonate in den mit Stroh eingestreuten Laufställen und über die Sommermonate auf Weiden, gehalten.

Die Abfohlungen sowie die postnatale Versorgung der Neonaten fanden in zwei separaten Abfohlbereichen mit 13 vier mal vier Meter großen Boxen und 14 drei mal vier Meter großen Boxen unter veterinärmedizinischer Beobachtung statt. Sofern die Fohlen gesund waren, verließen sie mit den Stuten den Abfohlbereich nach

durchschnittlich 4 Tagen. Die gemauerten Boxen wurden nach dem Ausstallen entmistet, gesäubert, mit einem Flächendesinfektionsmittel desinfiziert, abgeflammt und erneut mit Spänen und Stroh eingestreut.

Zur Verbesserung der Geburtshygiene und zur Erleichterung der

Geburtsüberwachung wurde den Stuten kurz vor der Geburt der Schweif mit

elastischen Einmalbinden bandagiert und, wenn die Stute es tolerierte, das Euter mit Jodseife (Braunol^®, Braun, Melsungen) gewaschen.

Die postnatale Versorgung des Neonaten beinhaltete die Verabreichung eines Klistiers (Practoclyss^®,Friedeberg-Fresenius Kabi, Bad Homburg), die Desinfektion des Nabelstumpfs mit ethanolhaltiger Jodlösung sowie die Kontrolle über die

Aufnahme von mindestens 250 ml Kolostrum in den ersten 2 Lebensstunden. Trank das Fohlen nicht selbständig, wurde ihm von der Mutterstute abgemolkenes oder aus der betriebseigenen Kolostrumbank aufgetautes Kolostrum verabreicht.

(31)

10 Stunden nach der Abfohlung erfolgte die Bestimmung des Immunglobulin G (IgG) -Gehalts durch den Snap Foal IgG Test^® (IDEXX, Blue Ridge Pharmaceuticals, USA). Lag dieser Wert unter 800 mg/dl, bekamen die betroffenen Fohlen einen Liter aufgetautes Plasma aus der betriebseigenen Plasmabank infundiert.

Die Zuchtstuten wurden regelmäßig gegen EHV 1 und 4, Influenza und Tetanus mit Duvaxyn^®EHV1, 4, Duvaxyn^®IE plus / Duvaxyn^®IE-T plus (Fort Dodge, Mönchengladbach) geimpft. Entwurmungen der Zuchtstuten fanden 4-mal jährlich mit Dectomax^® (Pfizer, Karlsruhe) und die der Fohlen im Alter von 9 Tagen mit Thiabendazol^® (Sanofi, Schweiz),

sowie einmal monatlich mit Banminth^® (Pfizer, Karlsruhe) statt.

3.2 Die Versuchstiergruppe 3.2.1 Allgemeines

Die Versuchstiere wurden in 2 Gruppen aufgeteilt.

In der Gruppe A wurde bei 115 Stuten direkt nach der Geburt Serum gewonnen und Kolostrum abgemolken. Von dem zugehörigen Fohlen wurde am jeweils ersten Lebenstag einmal Serum gewonnen.

Auch in der Gruppe B wurde bei 12 Stuten direkt nach der Geburt Serum gewonnen und Kolostrum abgemolken. Von den zugehörigen Fohlen hingegen wurde am ersten Lebenstag und dann wöchentlich bis zu einem Alter von 12 Wochen Serum

gewonnen.

Das Alter der Stuten, die Anzahl der vorangegangenen Trächtigkeiten sowie der Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent sind in der Tab. 11 (Anhang) angegeben.

3.2.2 Blutentnahme

Sowohl zur Serumgewinnung als auch für die wöchentliche Bestimmung der Leukozyten im Rahmen der Früherkennung der Rhodococcus equi Pneumonie wurde den Fohlen Blut aus der Jugularvene entnommen. Bei kleinen Fohlen bis zur 4. Lebenswoche erfolgte die Blutentnahme mit Sterikan^® Kanülen Größe 1 (0,9 x 40 mm, Braun, Melsungen) und ab der 4. Lebenswoche sowie bei Stuten mit Neolus^® Kanülen (1,2 x 40 mm, Terumo, Eschborn).

(32)

Zur Serumgewinnung wurden 9 ml Blut in einer Serummonovette (Sarstedt^®,

Nürnbrecht) und zur Leukozytenbestimmung 1 ml Blut in einem mit Kalium beschichteten EDTA Röhrchen (EDTA K, Sarstedt^®,Nürnbrecht) aufgefangen.

3.2.3 Serumgewinnung

Die Serumgewinnung erfolgte 2 bis 8 Stunden nach der Blutentnahme direkt im Labor des Gestüts durch Zentrifugieren der Blutprobe über 10 min bei 2000 x g. Das so gewonnene Serum wurde in Serumröhrchen (Zentrifugenröhrchen aus Polysterol, 13 ml, Sarstedt^®, Nürnbrecht) auf dem Gestüt bei -20 °C gelagert.

3.2.4 Entnahme und Verarbeitung der Kolostrumproben

Direkt nach der Geburt wurden die Zitzen der Stuten trocken gereinigt und den Stuten etwa 13 ml Kolostrum in ein Serumröhrchen (Zentrifugenröhrchen aus Polysterol, 13 ml, Sarstedt^®, Nürnbrecht) abgemolken.

Nach Inkubation der Milchproben bei 5 °C über Nacht wurde das aufgerahmte Fett abgesaugt. Nach 10-minütiger Zentrifugation der Proben bei 2000 x g wurde dieses wiederholt. Beim Umfüllen der Milch wurde der als Sediment im Röhrchen meist gut sichtbare grobsinnliche Schmutz entfernt. Anschließend wurde die so aufbereitete Probe in einem weiteren Serumröhrchen (Zentrifugenröhrchen aus Polysterol, 13 ml, Sarstedt^®, Nürnbrecht) bei -20 °C gelagert.

3.3 Erhebung der klinischen Daten

Alle Fohlen standen durch wöchentliche Allgemeinuntersuchungen, Untersuchungen des Respirationstraktes und wöchentliche Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut unter permanenter medizinischer Beobachtung.

3.3.1 Wöchentliche klinische Untersuchung der Fohlen

Die Erhebung der klinischen Daten fand nach Zusammentreiben aller Fohlen und ihrer Mutterstuten von den Weiden auf Sandpaddocks statt, die zur Minimierung der Staubbelastung in den frühen Morgenstunden durch eine Sprenganlage täglich gewässert wurden.

(33)

Die Untersuchung des Allgemeinbefindens umfasste Haltung, Habitus, rektal gemessene Körperinnentemperatur und qualitative Beurteilung des Pulses des Fohlens.

Bei der Untersuchung des Respirationstraktes galten besonders Zeichen einer Dyspnoe wie eine vermehrt abdominale Atmung, Nüsternblähen oder Einsinken der Interkostalräume als schwerwiegende Symptome einer Lungenerkrankung. Eventuell vorhandener Nasenausfluss wurde nach Menge und Beschaffenheit kategorisiert.

Die Mandibularlymphknoten wurden im Hinblick auf Größe, Schmerzhaftigkeit, Lappung und Konsistenz beurteilt.

Die Auskultation des Respirationstraktes begann an der Trachea und setzte sich an je 3 Stellen – cranio-ventral, Mitte und caudo-dorsal - auf beiden Thoraxwänden über zwei vollständige Atemzyklen fort. Rasseln und Fauchen in der Trachea und Giemen, Rasseln und Knistern in der Lunge sowie spontaner oder auslösbarer Husten

während der Untersuchung wurden als besonders krankhafte Veränderungen gewertet.

Daran schlossen sich die Auskultation des Herzens, die Adspektion und Palpation des Nabels sowie die Adspektion der Gelenke an.

Zur Beurteilung des Saugverhaltens fand eine Adspektion des Stuteneuters statt.

Durch Begutachtung der Afterregion des Fohlens konnte eventueller Durchfall erkannt werden. Zum Abschluss der Untersuchung erfolgte die Blutentnahme.

Für die Studie B wurde der Schweregrad der klinischen Symptome mit Hilfe der Summe der vergebenen Punkte eines Befundbogens quantifiziert. Die Ergebnisse schwankten zwischen 0 bis 2 (klinisch gesund), 3 bis 5 (gering- mittelgradig erkrankt) und > 5 (hochgradig erkrankt). Der hypothetische Maximalwert betrug 15 (siehe Tab.

1 ). Der höchste Wert, den ein Tier in dieser Studie erreichte, war 7. Der Gesamtwert wurde definiert als der „klinische Score“ des Tieres an dem Tag der Untersuchung.

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Tab. 1: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrads der klinischen Symptome (nach OHNESORGE et al. 1998)

Merkmal Befund Punktzahl

Atemfrequenz > 80 1

nein 0

serös, seromukös 1

Nasenausfluss

purulent 2

nicht auslösbar 0

mehrfach 1

Hustenauslösung

spontan 2

o.b.B. 0

Lnn. mandibulares

vergrößert 1

nein 0

Ruhedyspnoe Einsinken der Interkostalräume,

Nüsternblähen 3

vesikulär, vesikulär verschärft 0 Lungenauskultation

Rasseln, Knistern, Giemen 2

o.b.B. 0

Tracheaauskultation

Rasseln 2

Gesamtscore 0 - 15

3.3.2 Bestimmung der Leukozyten im Fohlenblut

Die Bestimmung der Leukozytenzahl fand am Tag der Blutentnahme durch einen automatischen Hämatologie-Analysator (Sysmex KX-21N, Sysmex, Kobe, Japan) nach dem Widerstandsmessprinzip statt.

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3.3.3 Ultraschalluntersuchung klinisch auffälliger Fohlen

Bei Fohlen, die einen plötzlichen Anstieg der Leukozyten im Blut zeigten oder durch Giemen oder Rasseln bei der Lungenauskultation oder andere klinische Symptome einer Lungenerkrankung auffielen, wurde mit einem tragbaren akkubetriebenen Ultraschallgerät (Sonovet 2000^®, Kretztechnik AG, Tiefenbach, Österreich) eine sonographische Untersuchung der Lunge durchgeführt.

Dazu musste zunächst das Lungenfeld beidseits geschoren, mit Alkohol entfettet und der Kontakt zwischen Schallkopf (Linearscanner, 7,5 MHz) und Haut durch Auftragen von Ultraschallgel (BLR Sonic Ultraschallgel, Diagonal, Waldeck, Münster) optimiert werden. Mit dem Schallkopf wurde jeder zugängliche Interkostalraum, das heißt vom 4. bis zum 12. Interkostalraum, von dorsal nach ventral abgefahren. Somit wurde die Lungenperipherie auf Lungenveränderungen wie Pneumonieherde und Abszesse untersucht.

3.3.4 Tracheo-Bronchoskopie der Fohlen mit sonographischen Befunden

Wurden bei der Ultraschalluntersuchung der Lunge eines Fohlens Abszesse oder pneumonische Veränderungen festgestellt, erfolgte am darauf folgenden Tag die Endoskopie der Atemwege.

Zur Bronchoskopie wurde ein flexibles Fiberskop (60512 VG, Storz, Tuttlingen) mit einem Durchmesser von 0,84 cm und einer Arbeitslänge von 150 cm mit der direkt angeschlossenen Xenon Nova Lichtquelle (20131420 Karl Storz, Tuttlingen) benutzt.

Die Lichtintensität war manuell zu regulieren, die Spülung der Optik mit steriler NaCl- Lösung (0,9 % NaCl, Braun, Melsungen) erfolgte ebenfalls manuell.

Die Fohlen wurden zur Endoskopie mit 0,5 mg/kg KGW i. v. Xylazin sediert. Fohlen unter 2 Wochen wurden mit Diazepam (0,2 mg/kg KGW i. v.) in Kombination mit Xylazin (0,2 mg/kg KGW i. v.) sediert.

Bei der Endoskopie wurden die Farbe der Schleimhaut, die Sekretbildung und die eventuelle Schwellung der Carina beurteilt sowie eine Trachealsekretprobe

entnommen. Die Probenentahme erfolgte mit Hilfe eines in den Arbeitskanal eingeführten, sterilen Kunststoffschlauchs von 170 cm Länge, auf dessen äußeres Ende eine 20 ml Spritze (Heiland^®, Hamburg) aufgesetzt wurde. Damit konnte das Trachealsekret manuell aspiriert werden.

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Die Probe wurde mit steriler NaCl-Lösung (0,9 % NaCl, Braun^®, Melsungen) auf einen Transporttupfer mit Amies Medium (Art.: 1020005, Heinz Herenz

Medizinalbedarf, Hamburg) gespült. Zusätzlich wurde ein tief intranasaler Nastentupfer (Art. Nr. 1020005, Heinz Herenz Medizinalbedarf, Hamburg) genommen.

Die Proben wurden bis zum Transport in das Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover im Kühlschrank bei 4 °C gelagert.

3.4 ELISA zur Bestimmung von Rhodococcus-equi-Antikörpern

Zur Bestimmung der Rhodococcus-equi-Antikörper in den genommenen Proben wurde der ELISA von HIETALA et al. (1985) leicht modifiziert.

Die Untersuchung der Proben fand im Institut für Innovative Veterinärmedizinische Diagnostik der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt.

3.4.1 Auswahl des Rhodococcus-equi-Stammes für die Antigenpräparation

Es wurden zunächst drei Rhodococcus-equi-Stämme ausgewählt, deren Eignung als Testantigen im ELISA untersucht wurde. Die Stämme konnten aus

Trachealsekretproben und Nasentupfer von Fohlen des Gestüts im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover isoliert werden und wurden als Lyophilisate aufbewahrt.

Die Stämme waren durch weitere Untersuchungen mittels verschiedener PCR – Methoden näher charakterisiert worden:

- Identifizierung als Rhodococcus equi Stamm durch die 16 S PCR nach SELLON et al. (2001),

- Nachweis des Virulenzfaktors VapA und dadurch Identifizierung als virulenter Stamm, durch eine weitere PCR-Untersuchung nach MAKARAI et al. (2002).

Es wurden Mikrotiterplatten mit jeweils einem der drei Antigene beschichtet und der ELISA mit dem Serum desselben Tieres durchgeführt. Da keine Unterschiede der drei Stämme im ELISA zu erkennen waren, wurde der Stamm Nr. 1 für die weiteren Untersuchungen ausgewählt.

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Stamm Nr. 1 war aus dem Trachealsekret eines im April 2003 auf dem Gestüt erkrankten Fohlens isoliert worden. Dieses Fohlen zeigte besonders schwere klinische Symptome, bei der sonographischen Untersuchung der Lunge waren mehrere große Abszesse festgestellt worden. Nach einer antibiotischen Behandlung mit Rifampicin in Kombination mit Erythromycin über 54 d (durchschnittliche

Behandlungsdauer 2003: 45,7 d.) erschien das Fohlen gesund. 14 Tage nach Ende der Therapie fiel das Tier erneut durch erhöhte Leukozytenzahl im Blut (17.300 G/l) und schwere Dyspnoe auf. Es konnten sonographisch erneut drei große Abszesse dargestellt werden, eine zweite Behandlung mit Azithromycin über 33 Tage wurde durchgeführt.

3.4.2 Antigenpräparation

Die Präparation des Antigens wurde im wesentlichen nach der Methode von

HIETALA et al. (1985) durchgeführt und in Anlehnung an die Methode von HIGUCHI et al. (1997) modifiziert. Die Stämme wurden aus dem Lyophilisat angezüchtet. Es wurde dazu 100 µl des rehydrierten Lyophilisates auf Blutagar ausplattiert und bei 37 °C aerob für circa 48 h bebrütet. Die Kontrolle der Reinheit der Kultur erfolgte anhand der typischen Koloniemorphologie makroskopisch. Zur Gewinnung größerer Kulturmengen wurden die Stämme in Pleuropneumonia-like Organismen (PPLO)- Bouillon vermehrt.

Dazu wurden zweimal je 10 ml PPLO-Medium mit einer Einzelkolonie einer frischen Plattenkultur der jeweiligen Stämme beimpft und über Nacht bei 37 °C aerob

bebrütet. Am nächsten Tag erfolgte die Überführung dieser Startkulturen in die vorgesehene Menge des PPLO-Mediums. Es wurden zweimal 100 ml Flüssigkultur des ausgewählten Rhodococcus-equi-Stammes angezüchtet.

Die Reinheit der Flüssigkulturen wurde vor der Antigenpräparation durch

Ausplattieren von je 100 µl Flüssigkultur auf Blutagar und Inkubation bei 37 °C für 48 h auf das ausschließliche Wachstum von Rhodococcus equi überprüft.

Die Flüssigkultur wurde für 30 min bei 20.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen und je 2 g des Pellets in 10 ml Waschpuffer (Rezept 3 im Anhang) resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurde für 90 min im Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension für 30 min bei 20.000 x g und

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4 °C erneut zentrifugiert, der Überstand vorsichtig dekantiert und das Sediment verworfen. Der klare Überstand enthielt den Tween 20-Antigen-Extrakt.

Die Proteinbestimmung des Extraktes erfolgte mit dem Micro BCA (Bichinonic acid) Protein Assay Reagent Kit^® (Pierce, Rockford, Illinois, USA) in einer Flachboden- Mikrotiterplatte nach der beiliegenden Gebrauchsanleitung. Von dem mitgelieferten Proteinstandard und den zu untersuchenden Proben wurden je 2 geometrische Verdünnungsreihen à 1:10 und 1:100 hergestellt. Anschließend wurden 100 µl BCA- Lösung in die Vertiefungen pipettiert (Research 100-1000 µl, Research 20-100 µl, Eppendorf; Hamburg, Gilson-France 1-20 µl; Mehrkanalpipetten 25-200 µl, Dunn Labortechnik GmbH, Asbach). Nach einer Stunde Inkubation bei 60 °C und

Abkühlung der Platte auf Zimmertemperatur waren die Proteinanteile der Proben und des Standards durch die chromogene Reaktion sichtbar. Die entstandene violette Färbung wurde mittels Photometer (Spectra Sunrise, TECAN, Crailsheim) bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen.

Die Berechnung der Proteinkonzentration erfolgte mit einer von FRANZ et al. (1989) entwickelten Software nach der Referenzstandard-Methode anhand des mitgeführten Proteinstandards.

3.4.3 Durchführung des Rhodococcus equi-ELISA 3.4.3.1 Prinzip des ELISA

Zur Detektion spezifischer Antikörper in Serum- und Kolostrumproben wurde die indirekte ELISA-Technik eingesetzt.

Bei der ELISA-Technik nach ENGVALL und PERLMANN (1971) erfolgt mit Hilfe eines geeigneten Puffers die Adsorption eines Antigens an eine Festphase (Mikrotiterplatte); der Prozess wird als Coating bezeichnet. Durch Aufbringen von Serum können enthaltene spezifische Antikörper an das immobilisierte, d.h. an der Festphase adsorbierte Antigen binden. Nach Zugabe eines so genannten zweiten Antikörpers, welcher mit einem Enzym gekoppelt ist und der gegen Immunglobuline gerichtet ist (Konjugat), bindet dieser an die bereits an das Antigen gebundenen Antikörper aus den Testseren. Durch Zugabe eines geeigneten Substrates können die entstandenen Immunkomplexe aufgrund der enzymatischen Aktivität des

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Konjugates sichtbar gemacht werden. Der entstehende Farbumschlag kann photometrisch als optische Dichte (OD) gemessen werden.

3.4.3.2 Voruntersuchungen

In Voruntersuchungen wurde geprüft, ob die Antigen-Präparationen der

verschiedenen Rhodococcus-equi-Stämme Unterschiede im ELISA zeigten. Es wurden dazu Mikrotiterplatten, die mit je einer der drei verschiedenen Präparationen beschichtet waren, mit einem ausgewählten positiven Pferdeserum (von einer Stute.

deren Fohlen sonographisch sicher an einer Lungenrhodococcose erkrankt war) getestet.

Als Festphase für die Beschichtung mit Antigen wurden Maxisorp^® und Polysorp^®- Mikrotiterplatten (Firma. Nunc, Wiesbaden) mit unterschiedlichen

Bindungseigenschaften getestet. Mit Hilfe von antigenbeschichteten Vertiefungen der Mikrotiterplatten, in die nachfolgend kein Serum pipettiert wurde, konnten

unspezifische Reaktionen im Assay beurteilt werden. Die optimale Konzentration von Antigen zur Beschichtung der Testplatten sowie die einzusetzenden optimalen

Verdünnungen der Patientenseren und des Kolostrums wurden mittels

Schachbretttitration ermittelt. Das Antigen wurde dazu in Verdünnungsstufen ab einer Verdünnung ab 1:10 von 1 bis 12 eingesetzt, die Seren und das Kolostrum ab 1:50 von A bis H.

3.4.3.3 Beschichtung der Testplatten

Das Antigen wurde im Coatingpuffer (Rezept im Anhang) verdünnt, jeweils 100 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und vergleichend 1 h bei 37 °C bzw.

über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte 3-mal mit 200 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen (ELISA-Washer PW 96, Tecan, Crailsheim). Die Restfeuchtigkeit in den Platten wurde ausgeschlagen und die Platten kopfüber bei Raumtemperaturen für 1 h getrocknet. Die Testplatten konnten sogleich im ELISA eingesetzt werden oder wurden bei –20 °C bis zur Nutzung gelagert.