ELISA zur Bestimmung von Rhodococcus-equi-Antikörpern

Zur Bestimmung der Rhodococcus-equi-Antikörper in den genommenen Proben wurde der ELISA von HIETALA et al. (1985) leicht modifiziert.

Die Untersuchung der Proben fand im Institut für Innovative Veterinärmedizinische Diagnostik der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt.

3.4.1 Auswahl des Rhodococcus-equi-Stammes für die Antigenpräparation

Es wurden zunächst drei Rhodococcus-equi-Stämme ausgewählt, deren Eignung als Testantigen im ELISA untersucht wurde. Die Stämme konnten aus

Trachealsekretproben und Nasentupfer von Fohlen des Gestüts im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover isoliert werden und wurden als Lyophilisate aufbewahrt.

Die Stämme waren durch weitere Untersuchungen mittels verschiedener PCR – Methoden näher charakterisiert worden:

- Identifizierung als Rhodococcus equi Stamm durch die 16 S PCR nach SELLON et al. (2001),

- Nachweis des Virulenzfaktors VapA und dadurch Identifizierung als virulenter Stamm, durch eine weitere PCR-Untersuchung nach MAKARAI et al. (2002).

Es wurden Mikrotiterplatten mit jeweils einem der drei Antigene beschichtet und der ELISA mit dem Serum desselben Tieres durchgeführt. Da keine Unterschiede der drei Stämme im ELISA zu erkennen waren, wurde der Stamm Nr. 1 für die weiteren Untersuchungen ausgewählt.

3. Material und Methoden

Stamm Nr. 1 war aus dem Trachealsekret eines im April 2003 auf dem Gestüt erkrankten Fohlens isoliert worden. Dieses Fohlen zeigte besonders schwere klinische Symptome, bei der sonographischen Untersuchung der Lunge waren mehrere große Abszesse festgestellt worden. Nach einer antibiotischen Behandlung mit Rifampicin in Kombination mit Erythromycin über 54 d (durchschnittliche

Behandlungsdauer 2003: 45,7 d.) erschien das Fohlen gesund. 14 Tage nach Ende der Therapie fiel das Tier erneut durch erhöhte Leukozytenzahl im Blut (17.300 G/l) und schwere Dyspnoe auf. Es konnten sonographisch erneut drei große Abszesse dargestellt werden, eine zweite Behandlung mit Azithromycin über 33 Tage wurde durchgeführt.

3.4.2 Antigenpräparation

Die Präparation des Antigens wurde im wesentlichen nach der Methode von

HIETALA et al. (1985) durchgeführt und in Anlehnung an die Methode von HIGUCHI et al. (1997) modifiziert. Die Stämme wurden aus dem Lyophilisat angezüchtet. Es wurde dazu 100 µl des rehydrierten Lyophilisates auf Blutagar ausplattiert und bei 37 °C aerob für circa 48 h bebrütet. Die Kontrolle der Reinheit der Kultur erfolgte anhand der typischen Koloniemorphologie makroskopisch. Zur Gewinnung größerer Kulturmengen wurden die Stämme in Pleuropneumonia-like Organismen (PPLO)-Bouillon vermehrt.

Dazu wurden zweimal je 10 ml PPLO-Medium mit einer Einzelkolonie einer frischen Plattenkultur der jeweiligen Stämme beimpft und über Nacht bei 37 °C aerob

bebrütet. Am nächsten Tag erfolgte die Überführung dieser Startkulturen in die vorgesehene Menge des PPLO-Mediums. Es wurden zweimal 100 ml Flüssigkultur des ausgewählten Rhodococcus-equi-Stammes angezüchtet.

Die Reinheit der Flüssigkulturen wurde vor der Antigenpräparation durch

Ausplattieren von je 100 µl Flüssigkultur auf Blutagar und Inkubation bei 37 °C für 48 h auf das ausschließliche Wachstum von Rhodococcus equi überprüft.

Die Flüssigkultur wurde für 30 min bei 20.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen und je 2 g des Pellets in 10 ml Waschpuffer (Rezept 3 im Anhang) resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurde für 90 min im Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Suspension für 30 min bei 20.000 x g und

3. Material und Methoden

4 °C erneut zentrifugiert, der Überstand vorsichtig dekantiert und das Sediment verworfen. Der klare Überstand enthielt den Tween 20-Antigen-Extrakt.

Die Proteinbestimmung des Extraktes erfolgte mit dem Micro BCA (Bichinonic acid) Protein Assay Reagent Kit^® (Pierce, Rockford, Illinois, USA) in einer Flachboden-Mikrotiterplatte nach der beiliegenden Gebrauchsanleitung. Von dem mitgelieferten Proteinstandard und den zu untersuchenden Proben wurden je 2 geometrische Verdünnungsreihen à 1:10 und 1:100 hergestellt. Anschließend wurden 100 µl BCA-Lösung in die Vertiefungen pipettiert (Research 100-1000 µl, Research 20-100 µl, Eppendorf; Hamburg, Gilson-France 1-20 µl; Mehrkanalpipetten 25-200 µl, Dunn Labortechnik GmbH, Asbach). Nach einer Stunde Inkubation bei 60 °C und

Abkühlung der Platte auf Zimmertemperatur waren die Proteinanteile der Proben und des Standards durch die chromogene Reaktion sichtbar. Die entstandene violette Färbung wurde mittels Photometer (Spectra Sunrise, TECAN, Crailsheim) bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen.

Die Berechnung der Proteinkonzentration erfolgte mit einer von FRANZ et al. (1989) entwickelten Software nach der Referenzstandard-Methode anhand des mitgeführten Proteinstandards.

3.4.3 Durchführung des Rhodococcus equi-ELISA 3.4.3.1 Prinzip des ELISA

Zur Detektion spezifischer Antikörper in Serum- und Kolostrumproben wurde die indirekte ELISA-Technik eingesetzt.

Bei der ELISA-Technik nach ENGVALL und PERLMANN (1971) erfolgt mit Hilfe eines geeigneten Puffers die Adsorption eines Antigens an eine Festphase (Mikrotiterplatte); der Prozess wird als Coating bezeichnet. Durch Aufbringen von Serum können enthaltene spezifische Antikörper an das immobilisierte, d.h. an der Festphase adsorbierte Antigen binden. Nach Zugabe eines so genannten zweiten Antikörpers, welcher mit einem Enzym gekoppelt ist und der gegen Immunglobuline gerichtet ist (Konjugat), bindet dieser an die bereits an das Antigen gebundenen Antikörper aus den Testseren. Durch Zugabe eines geeigneten Substrates können die entstandenen Immunkomplexe aufgrund der enzymatischen Aktivität des

3. Material und Methoden

Konjugates sichtbar gemacht werden. Der entstehende Farbumschlag kann photometrisch als optische Dichte (OD) gemessen werden.

3.4.3.2 Voruntersuchungen

In Voruntersuchungen wurde geprüft, ob die Antigen-Präparationen der

verschiedenen Rhodococcus-equi-Stämme Unterschiede im ELISA zeigten. Es wurden dazu Mikrotiterplatten, die mit je einer der drei verschiedenen Präparationen beschichtet waren, mit einem ausgewählten positiven Pferdeserum (von einer Stute.

deren Fohlen sonographisch sicher an einer Lungenrhodococcose erkrankt war) getestet.

Als Festphase für die Beschichtung mit Antigen wurden Maxisorp^® und Polysorp^® -Mikrotiterplatten (Firma. Nunc, Wiesbaden) mit unterschiedlichen

Bindungseigenschaften getestet. Mit Hilfe von antigenbeschichteten Vertiefungen der Mikrotiterplatten, in die nachfolgend kein Serum pipettiert wurde, konnten

unspezifische Reaktionen im Assay beurteilt werden. Die optimale Konzentration von Antigen zur Beschichtung der Testplatten sowie die einzusetzenden optimalen

Verdünnungen der Patientenseren und des Kolostrums wurden mittels

Schachbretttitration ermittelt. Das Antigen wurde dazu in Verdünnungsstufen ab einer Verdünnung ab 1:10 von 1 bis 12 eingesetzt, die Seren und das Kolostrum ab 1:50 von A bis H.

3.4.3.3 Beschichtung der Testplatten

Das Antigen wurde im Coatingpuffer (Rezept im Anhang) verdünnt, jeweils 100 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und vergleichend 1 h bei 37 °C bzw.

über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte 3-mal mit 200 µl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen (ELISA-Washer PW 96, Tecan, Crailsheim). Die Restfeuchtigkeit in den Platten wurde ausgeschlagen und die Platten kopfüber bei Raumtemperaturen für 1 h getrocknet. Die Testplatten konnten sogleich im ELISA eingesetzt werden oder wurden bei –20 °C bis zur Nutzung gelagert.

3. Material und Methoden

3.4.3.4 Durchführung des ELISA

Für die Durchführung des ELISA wurden folgende Inkubationszeiten nach HIETALA et al. (1985) ermittelt, und zwar nach Aufbringen:

der Serumverdünnungen → 1 h 37 °C,

des Konjugats → 30 min Raumtemperatur,

des Substrates → 30 min Raumtemperatur.

Zwischen den einzelnen Schritten erfolgte jedes Mal eine maschinelle Reinigung der Platten mit Waschpuffer durch einen ELISA-Washer (Tecan: PW 96, Crailsheim).

Die zu untersuchenden Seren wurden 1:100 mit Waschpuffer (Rezept im Anhang) verdünnt und auf die Platte pipettiert

Durch die Reaktion der spezifischen Antikörper mit dem Antigen entstanden Immunkomplexe, an die sich im nachfolgenden Schritt das Konjugat anlagern konnte.

Es wurde Peroxidase-conjugated Affini Pure Goat Anti-Horse IgG (H+L) (Art. Nr. 108-035-003, Dianova, Forschungsreagenzien-Immundiagnostik, Hamburg) in einer Verdünnung von 1:5000 mit Waschpuffer (Rezept siehe Anhang) verwendet. Das Konjugat war mit einem Enzym markiert. Die Reaktion erfolgte durch Zugabe eines chromogenen Substrats (ABTS, Rezept im Anhang). Dieses wurde durch das an das Konjugat gebundene Enzym umgesetzt. Der dabei entstandene Farbumschlag wurde photometrisch als optische Dichte (OD) bei 490 ηm gemessen und stand im

Verhältnis zur Menge der gebundenen spezifischen Antikörper. Das Ablesen erfolgte durch den ELISA-Reader „SLT-Spectra“ (SLT-Labinstruments Deutschland GmbH, Crailsheim) mit Hilfe des Computerprogramms Magelan.

Es wurden sämtliche Proben 2-mal im Doppelansatz untersucht, so dass sich für jede Probe 4 Werte ergaben. Durchschnittlich variierten die Werte aller untersuchten Proben um 0,287 OD, mit einer Standardabweichung von 0,23.

3. Material und Methoden

3.5 Statistische Auswertung