4. Ergebnisse
4.1 Änderungen des California ELISA
Es wurden verschiedene Stämme, Mikrotiterplatten, Coatingverfahren und
Blockschritte verglichen. Mittels Schachbretttitrationen wurden die optimale Methode sowie die optimalen Lösungskonzentrationen ermittelt. Zum Vergleich der
Ergebnisse wurde die photometrisch gemessene „optische Dichte“ (OD) ausgewählt.
Die drei getesteten Rhodococcus-equi-Stämme wiesen keine Unterschiede im ELISA mit einem Stutenserum auf.
Es wurden zwei unterschiedliche Mikrotiterplatten getestet: die Polysorp®-Platte und die Maxisorp®-Platte. Die Polysorp®-Platte zeichnet sich durch ihre hydrophilen Eigenschaften aus und weist eine hohe Affinität für Proteine, Glykoproteine und Polyglykane auf, wohingegen die Maxisorp®-Platte sowohl hydrophile als auch lipophile Eigenschaften besitzt (JARK, 1996). So kommt es bei der Verwendung von Maxisorp®-Platten zu Reaktionen mit unspezifischen Bindungsstellen, dem so
genannten Hintergrund. Durch die unspezifischen Reaktionen kommt es zu erhöhten, falsch positiven Ergebnissen. Diese konnten in den Voruntersuchungen der
vorliegenden Arbeit ebenfalls beobachtet werden. Im Durchschnitt lag diese Hintergrundreaktion beim Einsatz der Maxisorp®-Platte bei 0,104 OD. Mit der Polysorp®-Platte hingegen lagen sie durchschnittlich bei 0,049 OD.
Durch einen zusätzlichen Blockschritt mit 5 % Milchaustauscher (Rezept 2 im Anhang) konnten die unspezifischen Reaktionen der Maxisorp®-Platte nicht gemindert werden.
4. Ergebnisse
Der Cutt-off Wert wurde aus der Literatur (TAKHAI et al., 1985) übernommen.
Danach waren Werte über 0,3 OD als positiv anzusehen. Werte für Sensibilität und Spezifität, sowie postive und negative prädiktive Werte konnten nicht überprüft werden, denn das Probandengut bestand ausschließlich aus infizierten Tieren.
Zum Aufbringen von Antigenen auf die Polysorp®-Platte auch “Coating“-Technik genannt, wurde „Coaten über Nacht“ mit „Coaten eine Stunde bei 37 °C“ verglichen.
Die in den Vorversuchen ermittelten Werte beim „Coaten über Nacht“ lagen im Schnitt bei 1,12 OD, wohingegen die Werte beim „Coaten eine Stunde bei 37 °C“
durchschnittlich bei 0,922 OD und damit 8,2 % niedriger lagen. Die besten
Testbedingungen konnten mit einer Anitigen-Konzentration von 80 µg/ml und einer Verdünnung der Seren/Kolostrum von 1:100 erzielt werden. Unter diesen
Bedingungen zeigte sich im Assay ein ausgewogenes Verhältnis von Antigen und Antikörpern in den Untersuchungmaterialien.
Die einzelnen Werte können der Tab. 3 entnommen werden.
Tab. 3 :Ergebnisse der Vorversuche
Polysorp®-Platte Maxisorp®-Platte
Coatingtechnik über Nacht bei Raumtemperatur
1 h bei 37 C° über Nacht bei Raumtemperatur
1 h bei 37 C°
Blockschritt 1 h mit Milchpulver
Block ohne Block ohne Block ohne Block ohne
Hintergrund OD 0,050 0,050 0,046 0,053 0,090 0,112 0,100 0,115 OD 1,003 1,214 0,873 1,014 1,002 1,267 0,832 0,972 OD: optische Dichte; Ag: Antigen
Aufgrund der Ergebnisse dieser Voruntersuchungen wurde im weiteren Verlauf der vorliegenden Studie eine über Nacht bei Raumtemperatur beschichtete Polysorp® -Platte für den ELISA verwendet.
4.2 Studie A
In der Studie A wurden 115 Stuten sofort nach der Geburt Kolostrum und Blut
4. Ergebnisse
postpartum ebenfalls Blut gewonnen. Diese Proben wurden mittels ELISA auf Rhodococcus equi-Antikörper untersucht.
Das Alter der Stute, die Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten, der Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent sowie das Erkrankungsalter der Fohlen wurden als weitere Parameter für diese Studie ermittelt.
4.2.1 Ergebnisse der Studie A
Da für alle Merkmale der Studie A keine Normalverteilung der Werte gegeben war, wird im folgenden der Medianwert angegeben.
4.2.1.1 Rhodococcus equi-Antikörper in Kolostrum und Serum
Es wurden 115 Stutenseren mit dem California ELISA untersucht. Der Median der Ergebnisse der Stutenseren lag bei 0,796 OD. Die Werte variierten von 0,243 OD bis 2,399 OD (Einzelwerte siehe Tab. 11, Anhang). Die 115 Kolostrumproben ergaben im ELISA einen medianen Wert von 1,112 OD. Hier lagen die Werte zwischen 0,138 OD und 2,851 OD (Einzelwerte siehe Tab. 11, Anhang).
Bei den am ersten Lebenstag gewonnenen 115 Fohlenseren lagen die im ELISA ermittelten Werte im Median bei 0,575 OD (Einzelwerte siehe Tab. 11, Anhang).
Die Ergebnisse des Rhodococcus-equi-Antikörper-Gehaltes sind in Tab. 4 zusammengefasst.
4. Ergebnisse
Tab. 4: Rhodococcus-equi-Antikörper-Gehalt im Kolostrum und in Stuten- und Fohlenserum (Studie A)
OD: optische Dichte
4.2.1.2 Alter und Parität der Stuten
Der Median des Stutenalters lag bei 7 Jahren und reichte von 3 bis 20 Jahren (Einzelwerte siehe Tab. 11 im Anhang). Für die Parität der Stuten ergab sich ein Median von 3 Trächtigkeiten, so dass die meisten Stuten in dieser Studie ihr viertes Fohlen bekamen. Die Ergebnisse zur Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten variierten von 0 bis 11 Trächtigkeiten. Die Anzahl der vorangegangenen
Trächtigkeiten stand in einem engen Verhältnis zu der Dauer des Aufenthalts der Stuten auf dem Gestüt. Überwiegend waren die Stuten als junge Pferde auf das Gestüt gekommen oder wurden dort geboren, und hatten seit dem 3. Lebensjahr meist jährlich ein Fohlen bekommen. Eine Ausnahme bildeten die Stuten mit den Probennummern 14 und 21 (siehe Tab. 11 im Anhang). Sie waren 16 und 15 Jahre alt, wiesen aber nur optische Dichten im Serum von 0,735, und 0,404 auf. Die beiden Stuten wurden erst 2002 auf den Betrieb verbracht und bekamen dort 2003 ihr erstes Fohlen.
In Tab. 5 sind die Daten zu Alter und Parität der Stuten zusammengefasst.
4. Ergebnisse
Tab. 5: Alter und Parität der Stuten
Median (25% / 75%)
Niedrigster Wert
Höchster Wert Stutenalter in Jahren
(115 Stuten)
7 (4 / 11)
3 20
Anzahl vorangegangener Trächtigkeiten (115 Stuten)
3 (1 / 6)
0 11
4.2.1.3 Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent
Der Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent wurde bei 97
Geburten ermittelt. Der Median für diesen Wert lag bei 10 %. Der größte Wert lag bei 16 %, der kleinste gemessene Wert bei 6 % (Einzelwerte siehe Tab. 11 im Anhang).
Die Ergebnisse für den Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent sind in Tab. 6 zusammengefasst.
4.2.1.4 Erkrankungsalter der Fohlen
Von den 115 untersuchten Fohlen erkrankten 94 Fohlen (81,7 %). Das
Erkrankungsalter wurde definiert als der Tag, an dem sonographisch Abszesse in der Lunge des betroffenen Fohlens nachgewiesen wurden. Das mediane
Erkrankungsalter lag bei 40 Tagen. Das frühste Erkrankungsalter lag bei 12 Tagen (Fohlen Nummer 114), das späteste Erkrankungsalter lag bei 120 Tagen (Fohlen Nummer 27, 57 und 91). In Tab. 6 sind die Ergebnisse für das Erkrankungsalter der Fohlen aus Studie A zusammengefasst.
4. Ergebnisse
Tab. 6: Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent Erkrankungsalter der Fohlen
Median
Anteil der Nachgeburt am
Fohlengeburtsgewicht in Prozent
4.2.1.5 Vergleich der erkrankten und nicht erkrankten Fohlen der Studie A
In einem ersten Schritt wurde geprüft, ob eine Einteilung der Fohlen in zwei Gruppen (erkrankt und nicht erkrankt) sinnvoll war. Dazu wurde untersucht, ob Antikörper-Gehalt, Erkrankungsalter und Alter der Mutterstute der erkrankten Fohlen sich signifikant von denen der nicht erkrankten Fohlen der Studie A unterschieden. Dafür wurde der Wilcoxon two-sample Test ausgewählt.
Der Median der Ergebnisse im Serum von Stuten, deren Fohlen später nicht erkrankten lag bei 0,9 OD, der von Stuten deren Fohlen später erkrankten betrug 0,782 OD. Dieser Unterschied war nicht signifikant.
Für die Ergebnisse im Serum von gesunden Fohlen lag der Median bei 0,662 OD, für erkrankte Fohlen bei 0,55 OD. Auch dieser Unterschied war nicht signifikant.
Bei den Ergebnissen im Kolostrum von Stuten deren Fohlen später nicht erkrankten, wurde ein Median von 1,213 OD und im Kolostrum von Stuten deren Fohlen später erkrankten ein Median von 1,107 ermittelt. Dieser Unterschied war nicht signifikant.
Sowohl Stuten deren Fohlen später nicht erkrankten, als auch Stuten deren Fohlen später erkrankten, waren im Median 7 Jahre alt.
Stuten, deren Fohlen später erkrankten bekamen in der vorliegenden Studie im Median ihr viertes Fohlen und Stuten deren Fohlen nicht erkrankten, bekamen ihr drittes Fohlen. Diese Differenz war nicht signifikant.
Der Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in Prozent betrug im Median
4. Ergebnisse
9 % bei Geburten, aus denen nicht erkrankte Fohlen hervor gingen und bei
Geburten, aus denen die Fohlen erkrankten, betrug er 10 %. Der Unterschied war nicht signifikant.
Die Einzelwerte des Vergleichs erkrankter und nicht erkrankter Fohlen sind in der Tab. 7 zusammengefasst.
Bei allen erhobenen Parametern wurden keine Unterschiede zwischen erkrankten und nicht erkrankten Fohlen ermittelt. Somit wurde die Gruppe der Probanden der Studie A fortan als eine Einheit betrachtet.
Diese Gruppe wurde auf Normalverteilung für die gemessenen Werte der
unterschiedlichen Parameter überprüft. Es ergab sich für keinen Parameter eine Normalverteilung. Aus diesem Grund werden für die weitere Darstellung wie auch schon in dem vorangegangenen die Medianwerte und nicht die Mittelwerte
angegeben.
Daneben erfolgte die Berechnung der Korrelationen für nicht normal verteilte Werte mit Hilfe des Spearman Tests.
4. Ergebnisse
Tab. 7: Vergleich der Mediane der verschiedenen Parameter bei erkrankten und nicht erkrankten Fohlen mit Angabe der Signifikanz-Werte (p-Wert)
Parameter Median, gesund
(25% / 75 %)
Median, erkrankt (25 % / 75 %)
p-Wert
OD Stutenserum 0,9
(0,675 / 1,334)
0,782 (0,595 / 1,218)
0,391
OD Fohlenserum 0,662
(0,44 / 0,775)
0,55 (0,374 / 0,985)
0,811
OD Kolosturm 1,213
(0,975 / 1,714)
Anteil der Nachgeburt am Fohlengeburtsgewicht in