Aus der Klinik für Pferde
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleich des Nachweises von Rhodococcus equi durch mikrobiologische Kultur mit dem Nachweis durch die Polymerase Chain Reaction in endoskopisch entnommenem
Tracheobronchialsekret bei Fohlen
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Paul Heyers
aus Rhede/EmsHannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
2. Gutachter: Jun. Prof. Dr. M. J. Pröpsting
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2005
Meinen Eltern
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb. Abbildung
AGID Agar-Gel-Immundiffusionstest cm Zentimeter
CRP C-reactive-protein dl Deziliter
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylen-diamin-tetra-Essigsäure ELISA Enzyme linked immunosorbent assay g Gramm
GAPDH Glyceralaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase ggr geringgradig
hgr hochgradig i.v. intravenös
IgG Immunglobulin G kD Kilodalton
kb Kilobase KM Körpermasse kg Kilogramm l Liter
M Molar
mAs Milliampère-Sekunde mgr mittelgradig
MHz Megahertz min Minute ml Milliliter mm Millimeter mg Milligramm µg Mikrogramm µl Mikroliter n Anzahl neg. negativ
o.b.B. ohne besonderen Befund
PCR polymerase chain reaction rRNA ribosomale RNA
RNA Ribonucleinsäure SD Standardabweichung ssp. Subspezies
Tab. Tabelle tgl täglich V Volt
Vap Virulenz assoziiertes Protein z.B. zum Beispiel
Die chemischen Elemente werden gemäß des internationalen Periodensystems abgekürzt.
1. Einleitung... 13
2. Literaturübersicht... 14
2.1 Rhodococcus equi... 14
2.1.1 Geschichtlicher Überblick und taxonomische Einordnung ... 14
2.1.2 Morphologie und Kultivierung... 14
2.1.3 Biochemische Eigenschaften ... 15
2.1.4 Virulenzfaktoren... 16
2.2 Klinische Symptome der Rhodokokkose... 17
2.2.1 Bronchopneumonie des Fohlens durch Rhodococcus equi... 17
2.2.2 Extrapulmunale Erkrankungsformen... 18
2.3 Pathogenese... 19
2.4 Diagnose... 20
2.4.1 indirekter Erregernachweis... 21
2.4.1.1 Hämatologische Parameter... 21
2.4.1.2 Serologische Diagnostikverfahren ... 22
2.4.2 direkter Erregernachweis... 23
2.4.2.1 Zytologische und kulturelle Nachweisverfahren ... 23
2.4.2.2 Molekularbiologische Nachweisverfahren... 24
2.4.3 Bildgebende Diagnostik... 26
2.5 Pathologische Veränderungen bei Rhodococcus equi-Pneumonien ... 27
2.6 Therapie... 28
3. Material und Methode... 30
3.1 Patientenmaterial ... 30
3.1.1 Haltung der Stuten im peri partum ... 30
3.1.2 Haltung der älteren Fohlen ... 31
3.1.3 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie... 32
3.1.4 Auswahl und Einteilung der Fohlen in Gruppen... 32
3.2 Methode ... 33
3.2.1 Allgemeinuntersuchung ... 33
3.2.2 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes ... 33
3.2.3 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut... 34
3.2.4 Weiterführende Untersuchungen ... 35
3.2.4.1 Auswahlkriterien für eine sonographische Untersuchung ... 35
3.2.4.2 Sonographische Untersuchung der Lunge... 35
3.2.4.3 Auswahlkriterien für die Endoskopie ... 36
3.2.4.4 Blutentnahme vor der Endoskopie der Fohlen ... 36
3.2.4.5 Endoskopische Untersuchung der oberen Atemwege ... 37
3.2.5 Kultureller Nachweis von Rhodococcus equi... 38
3.2.5.1 Isolierung und Kultivierung von Rhodococcus equi... 38
3.2.5.2 Nachweis des Equi-Faktors ... 39
3.2.5.3 Nachweis der biochemischen Eigenschaften von Rhodococcus ssp. 39 3.2.6 Nachweis von Rhodococcus equi mittels Polymerase Chain Reaction ... 40
3.2.6.1 Extraktion der molekularbiologischen DNA aus dem Tracheobronchialsekret ... 40
3.2.6.2 Durchführung der Polymerase Chain Reaction (PCR)... 42
3.2.6.3 Durchführung der Agarosegelelektrophorese ... 43
3.4.6.4 Auswertung der Elektrophorese... 44
3.2.6.5 Einsatz unterschiedlicher Primer... 44
3.2.6.6 Überprüfung negativer Ergebnisse der PCR... 45
3.2.7 Nachweis von Fibrinogen im Blut ... 46
3.2.8 Nachweis von C- reacting protein (CRP) ... 46
4. Ergebnisse... 47
4.1 Alter und Geschlecht der Fohlen... 47
4.2 Befunde der klinischen und hämatologischen Untersuchung in beiden Fohlengruppen... 48
4.3 Sonographische Befunde der Lungenuntersuchung ... 50
4.4 Ergebnisse des Erregernachweises aus dem Tracheobronchialsekret... 52
4.4.1 Ergebnisse der kulturellen Untersuchung auf Rhodococcus equi... 52
4.4.2 Ergebnisse des molekularischen Nachweises von Rhodococcus equi... 53
4.4.2.1 Ergebnisse des Nachweises von Rhodococcus equi mittels AceA500- PCR ... 54
4.4.2.2 Ergebnisse des Nachweises von Rhodococcus equi mittels IdeR500- PCR ... 54
4.4.2.3 Vergleich der Ergebnisse beider PCR-Varianten ... 55
4.5 Ergebnisse der GAPDH-PCR ... 56
4.6 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis in der AceA500-PCR ... 56
4.6.1 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis in der AceA500-PCR bei den kranken
Fohlen ... 57 4.6.2 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis in der AceA500-PCR bei den gesunden Fohlen ... 57 4.7 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis in der IdeR500-PCR... 58
4.7.1 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis in der IdeR500-PCR bei den kranken
Fohlen ... 59 4.7.2 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis in der IdeR500-PCR bei den gesunden Fohlen ... 59 4.8 Gegenüberstellung der Ergebnisse des kulturellen Nachweises von
Rhodococcus equi mit in beiden PCR-Varianten einheitlichen Ergebnissen... 60 4.8.1 Gegenüberstellung der Ergebnisse des kulturellen Nachweises von
Rhodococcus equi mit in beiden PCR-Varianten einheitlichen Ergebnissen bei den kranken Fohlen ... 60 4.8.2 Gegenüberstellung der Ergebnisse des kulturellen Nachweises von
Rhodococcus equi mit den einheitlichen Ergebnissen in beiden PCR-Varianten bei den gesunden Fohlen ... 61 4.9 Gegenüberstellung des kulturell nachgewiesenen Keimgehaltes von
Rhodococcus equi mit dem Nachweis in der AceA500-PCR ... 62 4.10 Gegenüberstellung des kulturell nachgewiesenen Keimgehaltes von
Rhodococcus equi mit dem Nachweis in der IdeR500-PCR ... 63 4.11 Gegenüberstellung des kulturell nachgewiesenen Keimgehaltes von
Rhodococcus equi mit dem Nachweis in beiden PCR-Varianten... 64 4.12 Auswertung der Gegenüberstellung des kulturellen Keimgehaltes an
Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis ... 66 4.13 Nachweis von Rhodococcus equi mittels Kultur in Abhängigkeit vom Alter der Fohlen ... 67 4.14 Nachweis von Rhodococcus equi mittels AceA500-PCR in Abhängigkeit vom Alter der Fohlen ... 68
4.15 Nachweis von Rhodococcus equi mittels IdeR500-PCR in Abhängigkeit vom Alter der Fohlen ... 68 4.16 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem klinischen Score ... 69
4.16.1 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem klinischen Score bei den lungenkranken Fohlen ... 69 4.16.2 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem klinischen Score bei den gesunden Fohlen ... 69 4.17 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mittels AceA500- PCR mit dem klinischen Score... 70 4.18 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mittels IdeR500- PCR mit dem klinischen Score... 70 4.19 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem „Lungen-Score“ ... 70
4.19.1 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem „Lungen-Score“ innerhalb der beiden Gruppen ... 71 4.20 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mittels AceA500- PCR mit dem „Lungen-Score“... 71 4.21 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mittels IdeR500- PCR mit dem „Lungen-Score“... 72 4.22 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit den Leukozytenwerten im Blut ... 73
4.22.1 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit den Leukozytenwerten im Blut innerhalb der beiden Gruppen... 73 4.23 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mittels AceA500- PCR mit den Leukozytenwerten im Blut... 73
4.23.1 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mittels
AceA500-PCR mit den Leukozytenwerten im Blut der Fohlen... 74 4.24 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mittels IdeR500- PCR mit den Leukozytenwerten im Blut... 74 4.25 Gegenüberstellung der Nachweise von Rhodococcus equi mit der Anzahl der Abszesse ... 75
4.25.1 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit der Anzahl der nachgewiesenen Abszesse ... 75
4.25.2 Gegenüberstellung des Nachweises in der AceA500-PCR von
Rhodococcus equi mit der Anzahl der nachgewiesenen Abszesse... 75
4.25.3 Gegenüberstellung des Nachweises in der IdeR500-PCR von Rhodococcus equi mit der Anzahl der nachgewiesenen Abszesse ... 75
4.26 Gegenüberstellung des Nachweises von Rhodococcus equi mit dem Abszess-Score... 76
4.26.1 Gegenüberstellung des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem Abszess-Score der kranken Fohlen ... 76
4.26.2 Gegenüberstellung des molekularbiologischen Nachweises von Rhodococcus equi mit dem Abszess-Score der kranken Fohlen... 76
4.27 Gegenüberstellung des kulturell nachgewiesenen Keimgehaltes von Rhodococcus equi mit der Abszess-Anzahl ... 77
4.28 Gegenüberstellung des kulturell nachgewiesenen Keimgehaltes von Rhodococcus equi mit dem Abszess-Score... 78
5. Diskussion ... 80
5.1 Probandengut ... 80
5.2 Probenentnahme... 81
5.3 Ergebnisse ... 82
5.3.1 Vergleich des kulturellen Nachweises von Rhodococcus equi mit der sonographischen Untersuchung der Lunge ... 82
5.3.2 Molekularbiologischer Nachweis von Rhodococcus equi... 84
5.3.2.1 Auswahl der geeigneten PCR ... 84
5.3.2.2 Auswertung der Ergebnisse der PCRs ... 85
5.3.2.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse der PCRs mit den sonographischen Lungenbefunden... 85
5.3.2.4 Gegenüberstellung der Ergebnisse der PCRs mit denen der bakteriologischen Kultur... 86
5.3.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse der kulturellen und molekularbiologischen Nachweise mit den klinischen Befunden... 87
5.3.4 Aussagekraft des Gehaltes an Fibrinogen und C-reaktivem Protein (CRP) im Blut ... 88
5.3.5 Beziehung zwischen dem Alter der Fohlen und dem Nachweis von Rhodococcus equi... 89
5.4 Schlussfolgerung... 90
6. Zusammenfassung ... 92
7. Summary ... 94
8. Literaturverzeichnis ... 96
9. Anhang ... 114
1. Einleitung
Atemwegserkrankungen gehören bei Fohlen im Alter von zwei bis sechs Monaten zu den häufigsten Erkrankungen. Sie haben verschiedene Ursachen, wobei der wichtigste Erreger von schweren Pneumonien Rhodococcus equi ist. Dieses Bakterium ist weltweit verbreitet und führt bei Fohlen zu Bronchopneumonien und pyogranulomatösen Entzündungen der Lunge, welche sowohl sporadisch als auch endemisch in der Fohlenaufzucht auftreten. Die Morbidität liegt zwischen 5-17%, wobei die Letalität in einigen Fällen 80% betragen kann (ELISSADE u. RENSHAW, 1980). Je früher die Krankheitsursache diagnostiziert und eine gezielte antibiotische Therapie eingeleitet werden kann, desto günstiger ist die Prognose für die erkrankten Fohlen. Durch die antibiotische Therapie konnte die Überlebensrate von 20% auf fast 90% gesteigert werden, aber die Therapie ist zeitaufwendig, für die Fohlen sehr belastend und die eingesetzten Antibiotika sind sehr kostenaufwendig.
In der Diagnostik wird hauptsächlich der direkte Erregernachweis durch eine bakteriologischer Untersuchung von Tracheobronchialsekret durchgeführt. Der kulturelle Nachweis von Rhodococcus equi ist allerdings nur in 60% der Proben erfolgreich, da das Bakterium ein obligat intrazellulärer Erreger ist und die Begleitflora das Wachstum von Rhodococcus equi unterdrückt. Außerdem erfordert dieser Nachweis einen relativ hohen Arbeitsaufwand und das endgültige Ergebnis liegt erst nach drei bis vier Tagen vor.
Eine schnellere Methode stellt dagegen die polymerase chain reaction (PCR) dar, welche immer mehr den Einzug in die Diagnostik erhält. In der Vergangenheit wurde versucht, dieses Verfahren auch beim Nachweis von Rhodococcus equi einzusetzen.
Dazu wurden verschiedene DNA-Abschnitte von Rhodococcus equi amplifiziert, aber bisher konnte sich keine dieser PCR-Methoden in der Routinediagnostik etablieren.
Im Rahmen der Dissertation von LORENZ (2005) wurden verschiedene Varianten der PCR zum Nachweis von Rhodococcus equi weiterentwickelt und ihre Spezifität und Sensitivität untersucht.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist, zu überprüfen, ob die von LORENZ empfohlenen PCR-Methoden in der routinemäßigen Diagnostik von Rhodococcus equi eingesetzt werden können.
2. Literaturübersicht
2.1 Rhodococcus equi
2.1.1 Geschichtlicher Überblick und taxonomische Einordnung
Rhodococcus equi wurde zunächst als Corynebacterium pyogenes (equi) bezeichnet und zum ersten Mal 1923 von MAGNUSSON in Schweden beschrieben. Es handelt sich hierbei um ein grampositives, pleomorphes, unbewegliches Bakterium mit Polysaccharidkapsel (WILSON, 1955; SMITH, 1966; WOOLCOCK u. MUTIMER, 1978, SELBITZ, 2002). Zunächst bereitete die taxonomische Einordnung Schwierigkeiten, doch durch bessere Untersuchungsmethoden, wie z.B. die Restriktionsfragmentanalyse ribosomaler RNA (VANEECHOUTTE et al., 1995), konnte eine endgültige Umbenennung des Keims von Corynebacterium equi zu Rhodococcus equi vorgenommen werden.
Das Bakterium wurde aus dem Verdauungstrakt gesunder Pferde sowie anderer Haustiere (WOOLCOCK u. RUDDICK, 1973; DEBEY u. BAILEY, 1987) und aus Böden ohne erkennbaren Kontakt mit Pferden (WOOLCOCK et al., 1980; BARTON u. HUGHES, 1984) isoliert. Rhodococcus equi ist ein obligat aerober Saprophyt (GOODFELLOW u. MINNIKEN, 1977; BARTON u. HUGHES, 1984), vermehrt sich sehr gut in sandigen Böden (BARTON u. HUGHES, 1984) und ist sehr widerstandsfähig gegenüber Trockenheit und Sonneneinstrahlung (WILSON, 1955;
ROBINSON, 1982), wogegen er sich bei hoher Feuchtigkeit schlecht entwickelt (BARTON u. HUGHES, 1984; HUGHES u. SULAIMAN, 1987). Rhodococcus equi ist unempfindlich gegenüber Säuren, Basen und einigen Desinfektionsmitteln, wie z.B.
Hypochlorsäure (MAGNUSSON, 1938; BARTON u. HUGHES, 1980).
2.1.2 Morphologie und Kultivierung
Rhodococcus equi wächst auf Blutagar nach 24 Stunden aerober Bebrütung bei 37°C in feucht glänzenden, schleimig grau-weißen Kolonien. Nach 48 Stunden sind die Kolonien rötlich bis lachsfarben, haben einen erdigen Geruch, sind ca. 1-4 mm groß und haben die Tendenz zu konfluieren (PRESCOTT, 1991). In jungen, ca. 6
Stunden alten Kulturen weisen die Bakterien überwiegend bazilläre Form auf. Doch mit zunehmendem Alter der Kulturen werden sie immer kokkoider, bis nach 24 Stunden nur noch kokkoide Bakterien zu finden sind (MCNEIL u. BROWN, 1994).
MUTIMER u. WOOLCOCK (1981) unterschieden die Morphologie nach dem Wachstum auf Blutagar in vier Typen, von klassisch schleimig bis hin zu sehr klein und trocken. Die Säurefestigkeit von einigen Rhodococcus equi-Stämmen ist nur eine unregelmäßig auftretende Erscheinung, da sie abhängig ist von dem verwendeten Medium, dem Alter der Kultur und der Färbetechnik (BARTON u.
HUGHES, 1980; PRESCOTT, 1991).
Das Bakterium wird in 27 verschiedene Serotypen unterteilt (NAKAZAWA et al., 1987). Als Basis für diese Einteilung wird die antigenetisch variable Polysaccharidkapsel verwendet. Es besteht jedoch keine Beziehungen zwischen dem Serotyp und der Virulenz.
Zur Verbesserung der Isolierungsrate und damit der Diagnostik wurden Selektivmedien eingeführt. WOOLCOCK et al. (1979) verwendeten das sogenannte NANAT-Selektivmedium (Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit), das sich aus Agar- Agar, Aqua dest., tryptisch verdautem Sojaeiweiß als flüssiges Medium (TSB) und Hefeextrakt, mit Zusatz von Novobiocin, Nalidixinsäure, Cycloheximid und Kaliumtellurit zusammensetzt. VON GRAEVENITZ u. PÜNTER-STREIT (1995) entwickelten ein nach ihrer Meinung für die Anzüchtung von Rhodococcus equi geeigneteres Medium, das CAZ-NB-Medium (Ceftazidim-Novobiocin-Agar).
2.1.3 Biochemische Eigenschaften
Da Rhodococcus equi keine besonderen Ansprüche an den Nährstoffgehalt des Mediums stellt, wächst er gut auf Blutagar (BARTON u. HUGHES, 1980;
PRESCOTT, 1991). Das Wachstum wird durch ein schwach saures Milieu von pH 6- 8 begünstigt. Rhodococcus equi-Isolate können zwar bei Temperaturen von 10°C bis 40°C überleben, aber das Temperaturoptimum liegt bei 37°C (BARTON u. HUGHES, 1980; TAKAI et al., 1985). Außerdem müssen aerobe oder mikroaerophile Bedingungen herrschen (RAJAGOPALAN, 1936; BARTON u. HUGHES, 1980).
Als Kohlenstoffquelle kann Rhodococcus equi Alkohole und Natriumlaktat (GOODFELLOW, 1986), aber auch verschiedene Karbonsäuren, wie Essig-,
(ROWBOTHAM u. CROSS, 1977) und Ammoniumsulfat (PRADIP et al., 1966) nutzen. Des weiteren beobachten MC NEIL u. BROWN (1994) die Umsetzung von Glukose.
Charakteristisch für Rhodococcus equi ist die Aktivität der Katalase (RAJAGOPALAN, 1936; JONES et al., 1989; MORAAL et al., 1990), der Nitratreduktase und der Urease (BARTON u. HUGHES, 1980; MUTIMER u.
WOOLCOCK, 1981; PRESCOTT, 1991). Außerdem produziert das Bakterium verschiedene Lipasen und Phosphatasen (MUTIMER u. WOOLCOCK, 1983) und einige Stämme hydrolysieren Äskulin und Hippurat (PRESCOTT et al., 1982).
PRESCOTT (1991) stellte in einer Studie an 236 Rhodococcus equi-Stämmen bei mehr als 90% der Stämme eine positive Leucin-Arylamidase-, Varyl-Arylamidase- und alpha-Glucosidasereaktion fest.
Außerdem kann auf Schafsblutagar ein CAMP-ähnliches Phänomen (nach den Entdeckern Christie-Aktins-Munch-Petersen) mit Staphylococcus aureus beobachtet werden. Aufgrund des Synergismus zwischen dem Equi-Faktor von Rhodococcus equi und dem Hämolysin von Staphylococcus aureus bildet sich auf dem Blutagar eine halbmondförmige Zone einer vollständigen Hämolyse (FRASER, 1964;
SELBITZ, 2002).
2.1.4 Virulenzfaktoren
Die Tatsache, dass Rhodococcus equi zwar in den meisten Pferdebeständen nachgewiesen werden kann, aber nicht auf allen Farmen zu endemisch verlaufenden Krankheitsausbrüchen führt (ROONEY, 1966), lässt Unterschiede in der Ausbildung von Virulenzfaktoren der verschiedenen Stämme vermuten.
Virulenzfaktoren können Kapselpolysaccharide sein, die die Phagozytose hemmen, Exoenzyme, z.B. Phospholipase C, und Produkte, die durch ein Virulenz-assoziiertes Plasmid kodiert werden. Das sogenannte Virulenz-assoziierte Protein A (VapA) ist ein 15-17 kD großes Protein, welches durch ein 80-90 kb großes Plasmid kodiert und ausschließlich von virulenten Rhodococcus equi-Stämmen gebildet wird (TAKAI et al, 1991; TKACHUK-SAAD u PRESCOTT, 1991). Die Expression des Proteins an der Oberfläche der Bakterien ist Temperatur- (von 34-41°C) und pH (6,5)-abhängig. Zwar ist die genaue Funktion von VapA noch ungeklärt, aber durch Versuche wurde
gezeigt, dass das Protein essentiell für die Virulenz der Stämme ist (JAIN et al., 2003).
Es wurden sechs weitere Plasmid kodierte Proteine analysiert, die auch von allen Isolaten gebildet werden, die auch VapA exprimieren. Bei allen sieben Vap-Proteinen findet eine Aufregulierung der Proteinexpression statt, wenn die Temperatur steigt und der Eisengehalt sinkt. Eine Herunterregulierung findet dagegen bei einem Magnesiummangel statt (REN u. PRESCOTT, 2003).
Die eisenabhängige Proteinexpression wird durch die zwei Transcriptionsrepressoren
„Fur“ und „IdeR“ kontrolliert (HANTKE, 2001). VON BOLAND et al. (2000) zeigten, dass „Fur“ und „IdeR“ funktionelle Proteine sind und in Abhängigkeit vom Fe2+-Gehalt die Proteinexpression regulieren.
2.2 Klinische Symptome der Rhodokokkose
2.2.1 Bronchopneumonie des Fohlens durch Rhodococcus equi
Die durch Rhodococcus equi hervorgerufene Pneumonie kommt weltweit vor und gewinnt immer mehr an Bedeutung. Sie ist verbunden mit einer hohen Letalität von bis zu 80% (ELLISADE et al., 1980; TAKAI et al., 1985; SØLAND u. OLSEN, 1995).
Außerdem sind 1-3% aller Todesfälle bei Fohlen auf eine Infektion mit Rhodococcus equi zurückzuführen (PRESCOTT et al., 1980).
Bei der Auskultation der Lunge wird bei den chronisch erkrankten Tieren häufig im cranioventralen Bereich des Thorax ein exspiratorisches und/oder inspiratorisches Knistern, Giemen und Rasseln festgestellt. Die Lungengeräusche können aber auch bei stark verdichtetem Lungengewebe vermindert sein (GIGUÉRE u. PRESCOTT, 1997). Da die Befunde bei den Krankheitsformen recht unterschiedlich sind, besteht keine Korrelation zwischen dem Auskultationsbefund und der Schwere der Pneumonie (FALCON et al., 1985).
Das typische Sektionsbild bei Infektionen mit Rhodococcus equi zeigt eine feuchte, schwere, dunkle und nicht kollabierte Lunge (SMITH u. ROBINSON, 1981).
Histologisch weisen die Veränderungen granulomatösen Charakter auf. In den Lungenalveolen um die nekrotischen Bereiche befinden sich massenhaft
grampositive intakte Rhodokokken sichtbar sind (HILLIDGE, 1986; PRESCOTT, 1991).
2.2.2 Extrapulmunale Erkrankungsformen
Bei ca. 50% der Fohlen, die an einer durch Rhodococcus equi hervorgerufenen Pneumonie leiden, treten auch gastrointestinale Symptome, wie z.B. Durchfall, Dehydratation, Anorexie, Kolik und Gewichtsverlust auf. Diese Symptome sind Folgeerscheinungen einer ulzerativen Enterokolitis und Thyphlitis (CIMPRICH u.
ROONEY, 1977; ZINK et al., 1986; PRESCOTT u. HOFFMAN,1993). Die Kolitis wird wahrscheinlich durch Rhodokokken hervorgerufen, die bei einer Pneumonie ausgehustet und abgeschluckt werden und so in den Darmtrakt gelangen (ROONEY, 1966; CIMPRICH u. ROONEY, 1977; BARTON u. HUGHES, 1980; ZINK, 1986).
Eine Rhodococcus equi bedingte Kolitis ohne vorhergehende Pneumonie wird in nur wenigen Fällen beschrieben. Dabei sind Dünn- und Dickdarmschleimhaut ödematös und mit zähem Schleim bedeckt (ROONEY, 1966). Die Erkrankung beginnt als pyogranulomatöser Prozess, der sich ulzerierend von den Peyerschen Platten bis hin zu den lokalen Lymphknoten ausbreitet (JOHNSON et al., 1983; WEISS u.
RUDOLPH, 1988).
Eine immunvermittelte, aseptische, lymphoplastische Polysynovitis tritt bei einem Drittel der lungenerkrankten Fohlen auf (SWEENEY et al., 1987). Hier ist offensichtlich hauptsächlich das Tibiotarsalgelenk betroffen. Diese Fohlen zeigen kaum Palpationsschmerz, eine geringgradige Lahmheit und eventuell einen steifen Gang (SWEENEY et al., 1987; MADISON u. SCARRAT, 1988; KENNEY et al., 1994;
CHAFFIN u. MARTENS, 1997).
Seltener streuen die Bakterien aus der Lunge und Darm in den Körper. Dadurch entstehen septische Arthritiden und Osteomyelitiden. Da diese Erscheinungen hochgradig schmerzhaft sind, zeigen die betroffenen Fohlen eine hochgradige Lahmheit (WILSON 1955; COLLATOS et al., 1990; DESJARDINS u. VACHON, 1990). Es werden von verschiedenen Autoren auch vertebrale Ostemyelitiden beschrieben (ROONEY, 1966; GIGUÉRE u. LAVOIE, 1994; OLCHOWY, 1994;
CHAFFIN et al., 1995). Diese Prozesse äußern sich in Bewegungsunlust, steifem Gang, Palpationsschmerz und Fieber (MAYHEW, 1989).
Außerdem wird das Auftreten von vertebralen und paravertebralen Abszessen von OLCHOWY (1994) und GIGUÉRE und LAVOIE (1994) beschrieben. Komprimieren diese das Rückenmark, kann es zu neurologischen Ausfallerscheinungen kommen, wie z.B. dem Cauda equina Syndrom (CHAFFIN et al., 1995).
Bei adulten Pferden kommt es nur selten zu Erkrankungen, die durch Rhodococcus equi hervorgerufen werden. Es werden vor allem Lungen-, Urogenitalinfektionen, Aborte oder seltene Wundinfektionen beschrieben (DIMOCK, 1941; WILSON, 1955;
BAIN, 1963; ROBERTS et al., 1980; ZINK et al., 1986).
2.3 Pathogenese
Die Rhodococcus equi- Infektion ist eine der wichtigsten Erkrankung der Fohlen im Alter von zwei Wochen bis sechs Monaten. Am häufigsten betroffen sind besonders Fohlen, die jünger als vier Monate sind (BARTON u. HUGHES, 1980; GIGUÉRE u.
PRESCOTT, 1997). Bisher wurde angenommen, dass die Fohlen gerade in diesem Alter betroffen sind, da sie sich in der vierten bis sechsten Lebenswoche mit virulenten Rhodokokken auseinandersetzen (AINSWORTH, 1999) und zu diesem Zeitpunkt der maternale Antikörperspiegel sinkt und die eigene humorale und zelluläre Immunantwort noch unreif ist (YAGER, 1987; TAKAI et al., 1995).
Rhodococcus equi wird als opportunistischer, pathogener Keim angesehen, da besonders immunsuppressive adulte Pferde (FREESTONE et al., 1987), immunsuppressive Fohlen (BARTON u. FULTON, 1980) und Menschen, die an einer Immundefizienz leiden (LASKY et al., 1991; ARLOTTI et al., 1996), erkranken.
In einer Studie an 220 Fohlen konnte gezeigt werden, dass es keine besonderen Risikofaktoren für Fohlen gibt, die das Auftreten einer Rhodococcus equi-Pneumonie begünstigen (CHAFFIN et al., 2003). Da der Keim in der Umwelt weit verbreitet und in den meisten Pferdebeständen nachzuweisen ist, dies aber nicht überall zu endemischen Krankheitsausbrüchen führt (ROONEY, 1966), wurde vermutet, dass es Stämme mit unterschiedlichen Virulenzfaktoren gibt. Da nicht bei allen Tieren eines Bestandes Pneumonien durch Rhodococcus equi beobachtet werden konnten, wird angenommen, dass eine Infektion von der Virulenz des Erregers und der Immunkompetenz des Wirtes abhängt (WADA et al., 1997).
TAKAI (1997) konnte zeigen, dass natürliche Infektionen hauptsächlich durch
Fähigkeit von virulenten Bakterien sich sehr schnell in Makrophagen vermehren zu können, korreliert mit der Ausbildung eines großen Plasmids, das ein oberflächlich exprimiertes Lipoprotein kodiert, das virulenzassoziierte Protein A (VapA) (HONDALUS u. MOSSER, 1994; WADA et al., 1997). Die Polysaccharidkapsel hemmt die phagozytierenden Leukozyten und durch die Produktion von Cholesteroloxidase wird die Lysosomenmembran stabilisiert (HONDALUS, 1997).
Auf diese Weise wird die Verdauung des Keimes verhindert und somit kann er als fakultativ intrazellulärer Keim angesehen werden. Dieser Mechanismus stellt wohl den größten Pathogenitätsfaktor der virulenten Rhodokokken dar (ZINK et al., 1987).
Nach HONDALUS (1997) induzieren bestimmte Zellwandbestände der Bakterien die Granulombildung.
Die Infektion mit Rhodococcus equi erfolgt hauptsächlich auf aerogenem Weg, orale, intrauterine und omphalogene Wege spielen nur eine untergeordnete Rolle (SIPPEL et al., 1968; BARTON u. HUGHES, 1980; MARTENS et al., 1982). Des weiteren sind auch Infektionen durch wandernde Parasitenlarven (BARTON u HUGHES, 1980) und offene Wunden beschrieben worden (KNIGHT, 1969; SMITH u. JANG, 1980).
2.4 Diagnose
Eine frühe Diagnose begünstigt eine bessere Prognose für die erkrankten Tiere, verringert die Behandlungsdauer und damit auch die Behandlungskosten. Außerdem ist eine sichere Diagnose wichtig, damit alle erkrankten Tiere erkannt und keine falsch positiven Tiere behandelt werden.
Da keine Korrelation zwischen den Auskultationsbefunden der Lunge und dem Gesundheitsstatus herrscht, müssen bei der Diagnosefindung alle klinischen Symptome, die Anamnese und die Erregernachweise berücksichtigt werden. Bei der Anamnese muss auf Erkrankungen weiterer Tiere, Haltungsbedingungen und vorausgegangene Rhodokokken-Erkrankungen eingegangen werden. Um die Verdachtsdiagnose zu festigen, kann ein direkter oder indirekter Erregernachweis durchgeführt werden. Dabei wird die Kombination aus bakteriologischer und zytologischer Untersuchung von Tracheobronchialsekret als sogenannter Goldstandard eingesetzt (PRESCOTT, 1991; GIGUERE u. PRESCOTT, 1997).
2.4.1 indirekter Erregernachweis
2.4.1.1 Hämatologische Parameter
Zur Diagnose einer Rhodococcus equi-Infektion können hämatologische Parameter wie z. B. Anzahl der Leukozyten, Gehalt am C-reaktiven Protein (CRP) und Plasmafibrinogengehalt herangezogen werden.
In der Studie von GIGUÉRE et al. (2003) an 162 Fohlen auf einem Aufzuchtbetrieb mit endemischer Rhodokokkose wurde gezeigt, dass bei den Fohlen ab einer Leukozytenanzahl von >13.000 Zellen/µL die Wahrscheinlichkeit einer Infektion mit Rhodococcus equi sehr hoch ist. Außerdem wurde festgestellt, dass erst Fibrinogenkonzentrationen im Blut über 500 mg/dL sicher auf eine Infektion hinweisen. Dabei erwies sich die Leukozytenanzahl aussagekräftiger als die Fibrinogenkonzentration (GIGUÉRE et al., 2003).
Auf einem weiteren Aufzuchtbetrieb mit endemischer Rhodokokkose wurde an 149 Fohlen folgende Studie durchgeführt. Es wurde bei einer Gruppe von 66 Fohlen wöchentlich eine sonographische Untersuchung der Lunge und gleichzeitig eine Bestimmung der Leukozytenanzahl im Blut vorgenommen. Dabei zeigte sich, dass bei 75% der Fohlen, bei denen sonographisch Lungenabszesse dargestellt werden konnten, die Leukozytenzahl unter 13.000/µL lag (ALTHAUS, 2004). Dies verdeutlicht, dass die Leukozytenanzahl nur ein Hilfsmittel zur Diagnosefindung sein kann.
Das C-reaktive Protein (CRP) gehört in die Gruppe der Akut-Phase-Proteine, die bei den unspezifischen Abwehrmechanismen bedeutend sind. Das Protein wird in der Leber produziert und ist in der Lage, Bakterien zu agglutinieren und zu opsionieren sowie Komplement zu aktivieren. Bei neugeborenen Fohlen ist vor der Kolostrumgabe kein CRP im Serum nachweisbar (bei einer Nachweisgrenze von 1 µg/ml). Die Konzentration steigt dann aber schnell an und erreicht ein Maximum von 14,1 µg/ml bei 12 Monate alten Pferden. Danach sinkt der Wert wieder bis auf 5,4 µg/ml bei vierjährigen Pferden ab und pendelt sich dann in einem Bereich von 7 bis 8 µg/ml ein (YAHAMASHITA et al., 1991).
YAHAMASHITA et al. (1991) konnten zeigen, dass die Konzentration an CRP im Serum von Pferden, bei denen experimentell Entzündungen hervorgerufen wurden, innerhalb von 24 Stunden ansteigt und nach 5 bis 6 Tagen 3-6mal höher als der Basiswert ist. Erst 2 bis 3 Wochen nach Therapie ging die Konzentration auf den
Anfangswert zurück. Auch TAKIGUCHI et al. (1990) wiesen bei Tieren mit akuten entzündlichen Prozessen, wie z.B. bei einer Pneumonie, Enteritis, Arthritis oder nach Kastrationen bis zu 6fach höhere Konzentrationen an CRP im Vergleich zum Normalwert nach.
2.4.1.2 Serologische Diagnostikverfahren
Als Nachweisverfahren für die Antikörperbildung werden Enzym-Linked- Immunosorbent-Assay (ELISA), Agar-Gel-Immundiffusionstest (AGID) und Verfahren zur Hemmung der synergistischen Hämolyse eingesetzt.
Durch den Agar-Gel-Immundiffusionstest werden Antikörper gegen den Equi-Faktor nachgewiesen. Dieser Faktor besteht aus den Exoenzymen Phospholipase C und Cholesteroloxidase und wird von allen Rhodococcus equi-Stämmen an der Oberfläche sezerniert. (PRESCOTT et al., 1982). HOFFMAN et al. (1993) führten bei 101 Fohlen, die an einer klinischen Pneumonie litten, den Nachweis von aeroben, anaeroben Bakterien und Viren aus Proben der oberen und unteren Atemwege durch. Dabei stellte sich heraus, dass der AGID nützlich ist, um herauszufinden, welche Fohlen Kontakt mit Rhodococcus equi hatten, aber die Ergebnisse stimmten nicht gut mit den Resultaten des kulturellen Nachweises überein. Bei 34% der kulturell negativen Proben war der AGID positiv.
Auch bei der Hemmung der synergistischen Hämolyse werden Antikörper gegen den Equi-Faktor nachgewiesen. Die Exoenzyme hämolysieren in Gegenwart der Phospholipase D von Corynebacterium pseudotuberculosis oder dem β-Toxin von Staphylococcus aureus die Erythrozytenmembran. Wenn Antikörper gegen den Equi- Faktor vorhanden sind, wird die Hämolyse gehemmt (LINDER u. BERNHEIMER, 1982). Mit Hilfe dieses Testes werden auch subklinische Infektionen nachgewiesen (GASKIN et al., 1990), aber für eine individuelle Diagnose ist er zu sensitiv.
Weiterhin wurden bisher verschiedene ELISA-Tests entwickelt, die mit unterschiedlichen Antigenen durchgeführt werden. TAKAI et al (1985) etablierten einen ELISA mit dem Tween 20-Extrakt des Rhodokokken-Stammes ATCC 6939 als Antigen. In einer Vergleichsstudie zeigte dieser Test eine höhere Sensitivität als der AGID-Test. Die besten Ergebnisse erzielte bisher jedoch der California-ELISA auf der Basis eines Antigens aus Proben von klinisch an Rhodokokkose erkrankten Fohlen (GIGUÈRE et al., 2003). Da der ELISA ein indirektes Verfahren ist, kann er
nicht den Erreger selbst, aber eine stattgefundene Auseinandersetzung des Fohlens mit dem Erreger in Form von Antikörpern signalisieren. Dies ist nicht in jedem Fall mit dem Status einer akuten Infektion gleichzustellen. Daher sind bisher beschriebene ELISA eher für die Bestandsdiagnostik als für eine individuelle Diagnose geeignet.
Außerdem gibt es keine Korrelation zwischen dem Antikörpergehalt und dem Schweregrad der klinischen Symptome (ELLENBERGER et al., 1984; HIETALA et al., 1985).
2.4.2 direkter Erregernachweis
2.4.2.1 Zytologische und kulturelle Nachweisverfahren
Der kulturelle Nachweis von Rhodococcus equi wird meistens aus dem Tracheobronchialsekret oder aus der Trachealspülprobe veranlasst. Untersuchungen über die Sensitivität und Spezifität dieses Verfahrens ergaben recht unterschiedliche Ergebnisse. MARTENS et al (1982) halten die Methode für nicht sicher, da sie nicht konstant zu positiven Ergebnissen bei erkrankten Fohlen führt. Dagegen erzielten ANZAI et al (1997) gute Ergebnisse. Ihnen gelang es, Rhodococcus equi aus Tracheobronchialsekret neun Tage nach experimenteller Infektion der Fohlen kulturell nachzuweisen. Aber auch positive Befunde müssen vorsichtig beurteilt werden. Auf einer Farm, auf der Rhodococcus equi-Infektionen enzootisch auftraten, konnte bei 35% der untersuchten, aber klinisch unauffälligen Fohlen, ein kulturell positives Ergebnis im Tracheobronchialsekret bezüglich Rhodococcus equi erzielt werden (ARDANS et al., 1986). Die positiven Ergebnisse lassen sich damit erklären, dass Fohlen ohne Krankheitserscheinungen den Erreger über kontaminierten Staub eingeatmet haben können und so der kulturelle Nachweis positiv sein kann. Daher sollte stets neben dem kulturellen Nachweis auch die klinische Symptomatik und andere Untersuchungsverfahren bei der Diagnosefindung berücksichtigt werden (GIGUÉRE u. PRESCOTT, 1997).
SWEENEY et al. (1987) bestätigten bei 61% von Trachealsekretproben, bei denen kulturell Rhodococcus equi nachgewiesen wurde, dieses Ergebnis auch zytologisch.
Kotproben sind für den Nachweis einer Rhodokokkose weniger geeignet, da ARDENS et al. (1886) den Erreger auch aus dem Kot von Pferden isolieren konnten, die aus einem Betrieb ohne Rhodococcus equi-Vergangenheit stammten.
Auch Nasentupfer sind nicht für den Nachweis einer Rhodokokkose geeignet. In einer Studie auf einem Gestüt mit endemisch auftretenden Rhodococcus equi- Infektionen wurde von den Fohlen Nasentupfer genommen und endoskopisch Tracheobronchialsekret gewonnen. Aus diesen Proben wurde der kulturelle Nachweis von Rhodococcus equi durchgeführt. Es konnte nur in 52 von 217 (24%) Nasentupfern der Erreger isoliert werden. Dabei wurde in 11 von den 52 (21%) positiven Nasentupfern das Bakterium ausschließlich aus dem Nasentupfer nachgewiesen und in den restlichen 41 Fällen war Rhodococcus equi sowohl aus dem Nasentupfer als auch aus dem Tracheobronchialsekret zu isolieren. Dagegen wurde der Erreger bei 120 Proben (54%) nur im Tracheobronchialsekret kulturell nachgewiesen (MEYER- HAMME, 2004).
2.4.2.2 Molekularbiologische Nachweisverfahren
Die Polymerasekettenreaktion ist eine in-vitro-Methode, um spezifische DNA- Sequenzen zu amplifizieren. Die Methode beinhaltet die wiederholte und rasche Abfolge von verschiedenen Temperaturzyklen, wobei immer wieder drei Schritte durchlaufen werden. Die Denaturierung der Matrizen-DNA erfolgt bei einer Temperatur von ~94°C, bei der durch das Lösen der Basenpaarungen DNA- Einzelstränge entstehen. An diese Einzelstränge heften sich bei einer Temperatur von ~55°C einzelsträngige Oligonucleotidprimer an, die spezifisch erstellt wurden, um die zu untersuchende DNA zu flankieren. Im dritten Schritt erfolgt die Extension der Primer durch die DNA-Taq-Polymerase bei ~74°C, wodurch die DNA-Synthese stattfindet. In einem Zyklus wird die Anzahl der Ziel-DNA-Moleküle verdoppelt. Da die neu synthetisierten Stränge jeweils wiederum als Matrize für die nächste Runde der Vermehrung dienen, kommt es zu einer logarithmischen Vervielfältigung, so dass bereits wenige Zyklen zu einer millionenfachen Vermehrung des spezifischen DNA- Fragments resultieren.
Der molekularbiologische Nachweis ist gegenüber der Kultur schneller und er ermöglicht selbst den Nachweis von toten Erregern oder deren Fragmenten (PERSING et al., 1993). Da alle virulenten Rhodococcus equi-Stämme das 15-17 kDa große Virulenz-assoziierte Protein A (VapA) besitzen, welches durch das VapA- Gen exprimiert wird, wurde eine Methode entwickelt, mit der eine 564 bp große Region des VapA-Gens amplifiziert werden kann. Weil mit diesem Test
ausschließlich Rhodokokken nachgewiesen werden, liefert diese Methode keine falsch positiven Ergebnisse (TAKAI et al., 1998). Da die Sensitivität der VapA-PCR nicht hoch genug eingeschätzt wird, empfiehlt TAKAI et al. (1998) die Kombination aus einer „nested-PCR“ und einer Anreicherung von Rhodococcus equi auf Selektivmedium mit anschließender PCR. In einer „nested-PCR“ wird in einem ersten Schritt ein größerer Abschnitt der DNA vervielfältigt. In einem zweiten Schritt wird dann aus diesem Abschnitt wieder ein kleiner Abschnitt amplifiziert, der das eigentliche Ziel-DNA-Fragment darstellt. Durch diese doppelte Vervielfältigung wird der Nachweis des Erregers verbessert. In einer weiteren Studie wurde bei 100% der Rhodococcus equi-Isolate, die von erkrankten Pferden stammten, mit einer VapA- PCR das Virulenz assoziierte Protein A bestätigt (OLDFIELD et al., 2004). Deshalb wird eine PCR, die das VapA nachweist, für die Diagnose einer Infektion mit virulenten Rhodococcus equi–Stämmen von diesen Autoren empfohlen. ANZAI et al.
(1997) dagegen beurteilen die VapA-PCR nicht so gut. In einer Studie lösten sie bei 5 Fohlen durch ein intratracheales Versprühen von virulenten Rhodococcus equi eine Pneumonie aus. Nach einer gewissen Zeit wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten 53 Trachealsekretproben von diesen Fohlen gewonnen und mit verschieden Methoden analysiert. Hierbei stellte sich heraus, dass die VapA-PCR zwar schnell ein Ergebnis bringt, aber die Sensitivität von 51% schlechter war als beim kulturellen Nachweis mit 100%.
BELL et al. (1996) wiesen mit einer weiteren PCR einen anderen DNA-Abschnitt von Rhodococcus equi nach. Als Probenmaterial setzten sie Rhodokokken- und Nicht- Rhodokokken-Kolonien ein. Sie verwendeten zwei Regionen in dem Gen, welches das 16S rRNA codiert, als Spezies-spezifische Pimersequenz. Da diese 16S rRNA eine Sensitivität und Spezifität von 100% brachte, empfehlen diese Autoren ihre Verwendung zur Identifikation von Rhodococcus equi. In einer weiteren Untersuchung wurde die VapA-PCR mit der 16S rRNA verglichen (SELLON et al., 1997). Es wurde von gesunden Pferden EDTA-Blut und Lungenflüssigkeit gewonnen.
Diese Proben wurden mit logarithmisch verdünnten virulenten und avirulenten Rhodococcus equi-Isolaten vermischt. Aus diesen Proben wurde dann die DNA isoliert und die16S rRNA- und die VapA-PCR durchgeführt. Dabei wies die 16S rRNA-PCR sowohl alle virulente als auch avirulente Rhodococcus equi- Stämme nach. Dagegen besitzt die VapA-PCR den Vorteil, dass sie im Gegensatz zur 16S rRNA nur die virulenten Rhodokokken nachweist.
Die Basis einer weiteren PCR entwickelte NAVAS et al. (2001). Er stellte fest, dass ein möglicher Virulenzfaktor von Rhodococcus equi das Enzym Cholesteroloxidase (ChoE) sein könnte. Dieses Enzym fungiert als Membran zerstörendes Toxin. Er identifizierte das Gen, welches die Cholesteroloxidase codiert. Auf dieser Grundlage entwickelte LADRON et al. (2003) die sogenannte ChoE-PCR und testete sie, indem er ein Gemisch aus 132 Isolaten unterschiedlichen Ursprungs und Ländern herstellte.
Diese Isolate setzten sich aus zuvor biochemisch identifizierten Rhodococcus equi- Stämmen und 30 nicht Rhodococcus equi-Actinomycten zusammen Alle Rhodococcus equi-Isolate wurden mit Hilfe der ChoE-PCR nachgewiesen, alle Nicht- Rhodococcus equi-Isolate ergaben negative Ergebnisse.
Da der heutige Kenntnisstand über die Virulenzfaktoren von Rhodococcus equi noch unvollständig ist, konnten bisher noch keine weiteren Polymerase Chain Reactions auf dieser Basis etabliert werden.
2.4.3 Bildgebende Diagnostik
Als Methoden der bildgebenden Diagnostik für Rhodokokkus-Infektionen haben sich besonders die Sonographie und das Röntgen bewährt.
Befinden sich Abszesse oder andere pneumonische Veränderungen in peripheren Bereichen der Lunge, lassen sich diese sehr gut durch eine transkutane ultrasonographische Untersuchung darstellen (COHEN et al, 2000; ALTHAUS, 2004). COHEN et al. (2000) behaupten sogar, dass die Sonographie bei diesen Veränderungen sensibler als die radiologische Untersuchung sei. Einschränkend muss jedoch berücksichtigt werden, dass Abszesse, die medial von belüftetem Lungengewebe in der Tiefe liegen, nicht darstellbar sind. Somit kann die Sonographie nicht für die sichere Bewertung der Ausbreitung von Lungenschäden eingesetzt werden (GIGUÉRE u. PRESCOTT, 1997). Zur Verlaufskontrolle der Therapie dagegen gilt dieses Verfahren als geeignet (GIGUÉRE u. PRESCOTT, 1997). Bei der sonographischen Untersuchung der Lunge von Fohlen werden Sektorfeld- oder Linearscanner mit einer Frequenz von 5 bis 7,5 MHz eingesetzt (REEF et al., 1993; O’BRIEN u. BILLER, 1997).
Latero-laterale Thoraxsaufnahmen werden bei Fohlen mit einem tragbaren Röntgengerät mit den Strahlenwerte von 80 kV und 0,10 mAs angefertigt (VIVRETTE, 1992). Bei ca. einen Monat alten Fohlen werden bei einer
Film/Folienkombination mit einer Empfindlichkeit von 400 Einstellungen von 70 - 74 kV und 0,14 mAs empfohlen (COHEN et al., 2000). Durch eine röntgenologische Untersuchung können Verdichtungen, noduläre Veränderungen, Abszesse im Lungenparenchym und die tracheobronchialen und kranialen Mediastinallymphknoten dargestellt werden. Von diesen Befunden wird dann auf den Schweregrad der Pneumonie geschlossen (FALCON et al., 1985; GIGUÉRE u.
PRESCOTT, 1997). Frühe Stadien einer Pneumonie werden jedoch durch das Röntgen nicht gut erkannt. Bei Fohlen, die jünger als drei Monate sind, gelten noduläre Veränderungen und Lymphopathien als Hinweise für eine Rhodococcus equi-Pneumonie (HILLIDGE, 1987). In einer Studie von LAVOIE et al. (1994) wurde bei 40 Pferden mit primären Lungenabszessen ohne Pleuropneumonie ein bakterieller Nachweis durchgeführt. Dabei konnte bei fast allen Tieren Rhodococcus equi isoliert werden. Nur bei einem älteren Fohlen konnte ausschließlich Streptococcus equi ssp. zooepidermicus isoliert werden.
Szintigraphische Befunde korrelieren zwar mit röntgenologischen und post mortem Befunden (MARTENS et al., 1989). Der hohe Aufwand, der mit der Szintigraphie der Lunge verbunden ist, schränkt ihren Einsatz in der Lungendiagnostik beim Fohlen ein.
2.5 Pathologische Veränderungen bei Rhodococcus equi- Pneumonien
Die Rhodococcus equi-Pneumonie ist charakterisiert durch eine bilaterale, abszedierende Bronchopneumonie (MARTENS et al., 1982; ZINK et al., 1986;
ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986; AINSWORTH, 1999). Bei der chronischen Verlaufsform treten vor allem im ventralen Bereich der Lunge Abszesse auf, die einen Durchmesser von über 7 cm erreichen können (MAGNUSSON, 1923; LINTON u. GALLAHER, 1969; ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986; ALTHAUS, 2004).
Seltener sind im Lungenparenchym miliare, dünnwandige Abszesse zu finden (BARTON u. HUGHES, 1980). Diese treten eher bei akuten Pneumonien auf (MARTENS et al., 1982). Das Exsudat der Abszesse ist purulent, gelb-schmierig bis bröckelig-käsig. Das Lungengewebe um die Abszesse ist verdickt oder eingeschmolzen (BARTON u. HUGHES, 1980). Die Abszedierung kann auf die
bronchialen und mediastinalen Lymphknoten übergreifen. In der Sektion zeigt sich eine feuchte, schwere, dunkle und nicht kollabierte Lunge (SMITH u. ROBINSON, 1981). Dieses Bild ist typisch für eine durch Rhodokokken hervorgerufene Pneumonie. Die Atemwege sind in den betroffenen Bereichen mit mukopurulentem Sekret gefüllt (BARTON u. HUGHES, 1980). In histologischen Präparaten ist der granulomatöse Charakter zu erkennen. Es befinden sich Ansammlungen von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in den Wänden der Lungenalveolen, die in ihrem Zytoplasma massenhaft phagozytierte, intakte, Rhodokokken enthalten (RAJAGOPALAN, 1936; HILLIDGE, 1986; PRESCOTT, 1991).
2.6 Therapie
Wird eine Pneumonie, die durch Rhodococcus equi hervorgerufen wurde, diagnostiziert, steht die antimikrobielle Therapie im Vordergrund.
Die Wahl des geeigneten Antibiotikums gestaltet sich schwierig. Da Rhodococcus equi ein fakultativ intrazellulärer Erreger ist, in Makrophagen überleben kann (HONDALUS u. MOSSER, 1994) und in den granulomatösen Veränderungen mit verkäsendem Inhalt enthalten ist, sind die meisten Antibiotika zwar in vitro wirksam, aber in vivo zeigen sie keine effektive antimikrobielle Wirkung. Daher müssen die eingesetzten Antibiotika folgende Eigenschaften besitzen. Sie müssen in vitro gegen Rhodococcus equi wirksam sein, sich in der Lunge gut verteilen und dort eine hohe Aktivität erreichen, in Abszesse mit verkästem Material eindringen und lebende Bakterien in Makrophagen eliminieren können (HILLIDGE, 1986: PILTZ, 2004).
Um durch die Zellwände der Makrophagen und neutrophilen Granulozyten dringen zu können, müssen die Antibiotika eine lipophile Eigenschaft aufweisen (PROKESCH u. HAND, 1982). Einige Antibiotikakombinationen wie z.B. Rifampicin-Erythromycin, Rifampicin-Minocyclin und Erythromycin-Minocyclin zeigen synergistische Wirksamkeit.
Deshalb galt bis vor einigen Jahren die Kombination aus Erythromycin (25 mg/kg KM, 3xtgl per os) und Rifampicin (7,5 mg/kg KM, 2xtgl per os) als Mittel der Wahl gegen eine Rhodococcus equi-Pneumonie (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985;
HILLIDGE, 1987; PILTZ, 2004). Als mögliches, sehr wirksames Therapeutikum bewies sich auch Azithromycin (10 mg/kg KM, 1xtgl per os) (HOLDSTOCK, 2003;
PILTZ, 2004).
Der Erfolg der Therapie sollte laufend überprüft werden (HILLIDGE, 1987) und die Therapie so lange durchgeführt werden, bis ultrasonographisch oder röntgenologisch keine Abszesse mehr nachzuweisen sind (REEF, 1998). Dies dauert in der Regel vier bis neun Wochen.
Als therapiebegleitende Maßnahmen sollten zur Verbesserung des Allgemeinbefindens nichtsteroidale Antiphlogistika und zur Verringerung des Atemwiderstandes und zur Erhöhung der mukoziliären Clearence Bronchodilatoren eingesetzt werden (AINSWORTH, 1999).
3. Material und Methode
3.1 Patientenmaterial
In der vorliegenden Studie wurde der kulturelle Nachweis von Rhodococcus equi mit dem molekularbiologischen Nachweis mittels PCR verglichen. Dazu wurde von 90 Fohlen in der Zeit vom März bis Ende August 2004 Tracheobronchialsekret gewonnen. Diese Fohlen stammen aus einem Warmblut-Gestüt in Norddeutschland, auf dem endemisch durch Rhodococcus equi verursachte Pneumonien auftreten.
Die Fohlen waren zum Zeitpunkt der Aufnahme in die Studie zwischen 18 und 150 Tagen alt. Das Durchschnittsalter betrug 80 Tage.
Von den untersuchten Pferden waren 46 Hengst- und 44 Stutfohlen. Altersangaben sowie Geschlecht sind den Tab. 14 und Tab. 15 zu entnehmen.
3.1.1 Haltung der Stuten im peri partum
Auf dem Gestüt standen zwei Abfohlställe mit 12 bzw. 13 Boxen zur Verfügung.
Diese waren von den übrigen Stallungen räumlich getrennt. In den Eingangsbereichen lagen Desinfektionsmatten aus, die in regelmäßigen Abständen mit dem Desinfektionsmittel Neopredisan 4% (Menno-Chemie, Norderstedt, Deutschland) getränkt wurden. Im Abfohlbereich war der Personenverkehr eingeschränkt.
Erst kurz vor der Abfohlung wurden die Stuten in einen dieser Abfohlställe verbracht.
Hier blieben sie mindestens drei Tage post partum. Nachdem die Stuten mit ihren Fohlen die Abfohlbox verlassen hatten, wurden die jeweiligen Boxen ausgemistet, grob gesäubert, mit einem Hochdruckreiniger gereinigt und anschließend mit dem Desinfektionsmittel Neopredisan 4% (s.o.) desinfiziert. Vier bis zwölf Stunden nach der Desinfektion wurde die Box wieder frisch mit Stroh oder Spänen eingestreut.
Der gesamte Geburtsvorgang wurde von geschultem Personal überwacht. Um die Keimbelastung zum Geburtszeitpunkt zu minimieren und zur Erleichterung der Geburtsüberwachung bzw. –hilfe wurde der Schweif der Stuten mit elastischen Einmalbinden einbandagiert. Nach der Geburt wurden die Fohlen einer Allgemeinuntersuchung unterzogen und der Nabel mit Chlorhexidindigluconat-
Lösung 20% (COM Pharma, 20539 Hamburg, Deutschland), welche auf 1% verdünnt wurde, desinfiziert. Darüber hinaus wurde ihnen ein Klistier (Practoclyss®, Fresenius Kabi, Bad Homburg) verabreicht. Die Desinfektion des Nabelstumpfes wurde vom 1.
bis zum 3. Lebenstag dreimal täglich und vom 4. bis zum 7. Lebenstag einmal täglich wiederholt.
Wenn die Fohlen nicht innerhalb der ersten zwei Lebensstunden genügend Kolostrum aufgenommen hatten, wurde von den Mutterstuten Kolostrum abgemolken und mit einer Flasche den Fohlen eingegeben. War das Abmelken der Stuten nicht möglich, stand tiefgefrorenes, gestütseigenes Kolostrum zur Verfügung.
Acht Stunden nach der Geburt wurde der Immunglobulin-Wert im Blut mit Hilfe des Snap Foal IgG Test® (IDEXX, Blue Ridge Pharmaceuticals, Westbrook, Maine, USA) bestimmt. Lag dieser unterhalb von 800 mg/dl, wurde dem Fohlen Kolostrum per Nasenschlundsonde eingegeben. War der Immunglobulin-Wert nach weiteren vier Stunden nicht auf mindestens 800 mg/dl angestiegen, wurde dem Fohlen gestütseigenes Plasma infundiert.
Zeitgleich mit der Bestimmung des IgG-Gehalts im Blut, erhielten alle Fohlen zum Schutz gegen das Equine Herpes Virus 1 eine intranasale Impfung mit Prevaccinol® (Intervet Deutschland GmbH, Unterschleißheim).
Darüber hinaus erhielten die Fohlen jeweils an den ersten beiden Lebenstagen ein stallspezifisches Oralplasma (Eurovet, Smöaunn, Dänemark) zum Schutz vor Rota- und Coronavirus- Infektionen.
Aus dem Abfohlbereich wurden die Stuten mit ihren Fohlen in Boxen einer anderen Stallabteilung verbracht, wo sie mindestens bis zum Alter von zehn Tagen verblieben. Danach kamen sie gruppenweise in Laufställe, örtlich getrennt vom Abfohlbereich.
3.1.2 Haltung der älteren Fohlen
Bis Mitte Mai wurde der überwiegende Anteil der Fohlen in mit Stroh eingestreuten Laufställen gehalten. An jedem dieser Laufställe war ein für die Pferde immer zugänglicher betonierter Auslauf angeschlossen. Die Gruppengröße variierte zwischen 3 und 14 Stuten/Fohlen-Paaren. Die Besatzdichte war so gewählt, dass jedem erwachsen Pferd mindestens 80 cm Futtertroglänge zur Verfügung stand.
Ab Mitte Mai wurden die älteren Fohlen mit den Stuten in die Weiden verbracht. Die jüngeren Fohlen wurden mindestens bis zur vierten Lebenswoche in diesen Laufställen gehalten.
Die Stuten und Fohlen blieben meistens Tag und Nacht auf den Weiden. Hier wurden sie mit Kraftfutter und Heu zugefüttert. Da der Boden dieser Weiden sandig war und die Grasnarbe an den Futterplätzen und Tränken schnell zerstört wurde, wurden die Futterplätze regelmäßig verlegt.
Alle Fohlen wurden am zehnten Lebenstag mit Tiabendazol®-Paste (CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf) entwurmt. Danach ab einem Alter von 30 Tagen jeden Monat abwechselnd entweder mit Telmin®-Paste (Janssen-CILAG GmbH, Neuss) oder mit Banminth® Pferdepaste (Pfizer GmbH, Kalruhe).
3.1.3 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie
Für diese Arbeit wurden Fohlen ausgewählt, die auf dem Gestüt geboren und unter den oben beschriebenen Bedingungen gehalten wurden. Fohlen, die später auf das Gestüt kamen, wurden nicht in die Studie aufgenommen.
3.1.4 Auswahl und Einteilung der Fohlen in Gruppen
Die Fohlen wurden in zwei Gruppen eingeteilt.
In die Gruppe 1 wurden Fohlen aufgenommen, bei denen durch eine sonographische Untersuchung Lungenabszesse festgestellt wurden. Diese Gruppe umfasste 50 Fohlen.
In Gruppe 2 wurden Fohlen aufgenommen, die folgende Kriterien erfüllten:
1. Die Fohlen dieser Gruppe mussten ungefähr im gleichen Alter wie die Fohlen aus Gruppe 1 sein.
2. Bei einer klinischen Allgemeinuntersuchung des Gesundheitszustandes durften keine Abweichung von den Normwerten festgestellt werden.
3. Die Anzahl der Leukozyten im Blut musste < 14.000/µL sein.
4. Bei der sonographischen Untersuchung der Lunge durften keine Abszesse festgestellt werden.
5. Diese Fohlen mussten die Kriterien 2 und 3 zwei Wochen vor und nach Aufnahme in diese Gruppe erfüllen.
Die Gruppe 2 bestand aus 40 Fohlen.
3.2 Methode
3.2.1 Allgemeinuntersuchung
Es wurden die Fohlen beider Gruppen ab der dritten Lebenswoche bis zum Alter von mindestens vier Monaten wöchentlich einer klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen. Dabei wurde die Haltung, das Verhalten, der Habitus, das Saufverhalten beurteilt und die rektale Körpertemperatur gemessen. Des weiteren umfasste die Untersuchung die Beurteilung des Nabels, der Gelenke und der Kotkonsistenz.
3.2.2 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes
Eine spezielle Untersuchung des Respirationstraktes wurde wöchentlich durchgeführt. Hierbei wurde die Menge und Konsistenz des Nasenausflusses, spontanes oder auslösbares Husten, Größe, Konsistenz und Schmerzhaftigkeit der Mandibularlymphknoten, Atemgeräusche der Trachea und Lunge durch Auskultation beurteilt. Die Lunge wurde auf beiden Seiten an jeweils drei Stellen auskultiert, cranioventral, mittig und caudodorsal. Hierbei wurden die physiologischen Atemgeräusche und pathophysiologische Nebengeräusche beurteilt.
Zur Bewertung der Symptome wurden diese in einen Befundbogen eingetragen. Mit Hilfe eines Beurteilungsbogens (nach Ohnesorge et al., 1998) wurde jedem klinischen Symptom eine Punktzahl zugeordnet (siehe Tab. 1). Anhand der Summe der einzelnen Punktzahlen, welche als „klinischer Score“ definiert wurde, wurden die Fohlen in folgende Gruppen eingeteilt:
- Score von 0 – 1 = gesund
- Score von 2 – 3 = geringgradig erkrankt - Score von 4 – 5 = mittelgradig erkrankt - Score von > 5 = hochgradig erkrankt
Tab. 1: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades der klinischen Symptome (nach OHNESORGE et al., 1998)
Merkmal Befund Punktzahl
< 80 0
Atemfrequenz
> 80 1
nein 0
serös, seromukös 1
Nasenausfluss
purulent 2
nicht auslösbar 0
mehrfach 1
Hustenauslösung
spontan 2
o.b.B. 0
Lnn. mandibulares
vergößert 1
nein 0
Ruhedyspnoe Einsinken der Interkostalräume
oder/und Nüsternblähen 3
vesikulär, vesikulär verschärft 0 Lungenauskultation
Rasseln, Knistern, Giemen 2
o.b.B. 0
Tracheaauskultation
Rasseln 2
klinischer Score 0 - 15
3.2.3 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut
Im Rahmen der wöchentlichen Allgemeinuntersuchung wurde jedem Fohlen durch Punktion der rechten oder linken V. jugularis mit einer Kanüle (1,2x 40 mm; Neolus®, BSN medical GmbH & Co.KG, Hamburg) ca. 1 ml Blut entnommen. Dieses wurde in einem mit EDTA di-Kaliumsalz beschichtetem Probenröhrchen (KABE Labortechnik GmbH, Nümbrecht-Elsenroth) aufgefangen.
Anschließend wurde die Leukozytenzahl im Blut mit Hilfe eines Hämatologie- Analysators (Sysmex KX-21 N, Sysmex Deutschland GmbH) nach dem elektrischen Widerstandsprinzip bestimmt.
3.2.4 Weiterführende Untersuchungen
3.2.4.1 Auswahlkriterien für eine sonographische Untersuchung
Wenn bei den klinischen Untersuchungen oder bei den Leukozytenzahlen im Blut Abweichungen von der Norm festgestellt worden waren, wurde bei diesen Fohlen eine sonographische Untersuchung der Lunge durchgeführt.
Außerdem wurden im Rahmen der Dissertation von SCHULTE (2005) eine Gruppe von ca. 120 Fohlen routinemäßig einer sonographischen Untersuchung der Lunge unterzogen. Diese wurde unabhängig von den oben genannten Auswahlkriterien bei diesen Fohlen alle zwei Wochen durchgeführt. Einige Fohlen aus dieser Gruppe, bei denen Lungenabszesse festgestellt werden konnten, wurden auch in die hier vorliegende Studie aufgenommen.
3.2.4.2 Sonographische Untersuchung der Lunge
Die sonographische Untersuchung der Lunge wurde beidseitig durchgeführt. Das Untersuchungsfeld erstreckte sich vom vierten bis zwölften Intercostalraum und wurde nach dorsal durch die Stammesmuskulatur (M. longissimus dorsi), nach cranial durch das Schulterblatt mit seiner Muskulatur (M. triceps brachii, M. tensor fascia lata), und nach ventral durch das Sternum begrenzt. Dieses Untersuchungsfeld wurde dabei noch durch zwei schräg-waagerecht verlaufende Linien in die Felder A, B, und C unterteilt. Somit wurde das Untersuchungsfeld jeder Körperhälfte in jeweils 27 Felder unterteilt (siehe Abb. 15).
Um die Sonographie optimal durchzuführen, wurden den im Stehen fixierten Fohlen das Haarkleid im zu untersuchenden Bereich geschoren, dann die Haut mit Alkohol entfettet und anschließend ein Transmissionsgel (BCR, Sonic Ultraschallgel, Diagonal, Waldeck, Münster) aufgetragen.
Die sonographische Untersuchung wurde mit dem digitalen, akkubetriebenen, tragbaren „Sonovet 2000“ (Kretztechnik AG, Tiefenbach, Österreich) und einem
Linearscanner mit einer Frequenz von 7,5 MHz durchgeführt. Der Schallkopf war 6,5 cm lang und 1,7 cm breit, um auch gut in die schmalen Intercostalräume der Fohlen zu gelangen.
Es wurde caudal im zwölften Intercostalraum mit der sonographischen Untersuchung der Lunge begonnen und dann nach cranial bis zum vierten Intercostalraum fortgesetzt. Die Befunde wurden für jedes Feld auf einem Ultraschalluntersuchungsbogen festgehalten. Konnten Abszesse dargestellt werden, wurde ihre Anzahl und ihre Tiefe dokumentiert.
3.2.4.3 Auswahlkriterien für die Endoskopie
Eine endoskopische Untersuchung der oberen Atemwege wurde bei den Fohlen der Gruppen 1 und 2 durchgeführt. Außerhalb dieser Gruppen wurden nur Fohlen endoskopiert, die schwere klinische Symptome zeigten.
3.2.4.4 Blutentnahme vor der Endoskopie der Fohlen
Direkt vor Durchführung der Endoskopie wurden von jedem Fohlen mit einem Lithium-Heparin- (enthält 17 IU/ml Lithium-Heparin; Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) und einem Natrium-Citratröhrchen (enthält 0,129 M gepuffertes Natrium- Citrat; Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) venöses Blut entnommen. Nach Gewinnung der Proben wurden die Röhrchen 10 Minuten bei 3000 U/Min.
zentrifugiert (Christ- Zentrifuge, Firma Heraeus- Christ, Hanau) und das so gewonnene Plasma in ein Kunststoffröhrchen überführt. Diese Röhrchen wurden bei –25°C tiefgefroren. Nach Abschluss der gesamten Probengewinnung wurde das mit Lithium-Heparin gemischte Plasma gefroren an das Institut für Bakteriologie und Mykologie, Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig versandt, wo der Gehalt an dem C-Reaktiven Protein ermittelt wurde.
Das mit Natrium-Citrat gemischte Blut wurde im Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover auf den Fibrinogengehalt untersucht.
3.2.4.5 Endoskopische Untersuchung der oberen Atemwege
Um die Schleimhaut und das Sekret der oberen Atemwege und der Carina tracheae beurteilen und Tracheobronchialsekret gewinnen zu können, wurden die Fohlen endoskopiert. Diese Untersuchung wurde mit einem 150 cm langen Universal- Fiberskop (Karl Storz GmbH & Co. KG, Tutlingen) durchgeführt. Der Durchmesser des Endoskops betrug 8,5 mm. Die Optik konnte während der Endoskopie über einen Spülkanal mit Ringer-Lactat-Infusionslösung (B.Braun, Melsungen) gesäubert werden. Durch einen Arbeitskanal des Endoskops wurde eine 200 cm lange sterile Plastiksonde eingeführt, auf deren äußeres Ende eine sterile 20 ml Spritze zur Sekretaspiration aufgesetzt war. Als Lichtquelle wurde die Kaltlicht-Fontäne XENON NOVA® (Karl Storz GmbH & Co.KG, Tutlingen) verwendet.
Die Fohlen wurden zur Endoskopie der Atemwege mit Xylazin in einer Dosierung von 0,5 mg/kg KM i.v. sediert. Jüngere Fohlen bis drei Wochen erhielten eine Sedierung durch eine Kombination aus 0,2 mg/kg KM Diazepam und 0,2 mg/kg KM Xylazin i.v..
Während der Endoskopie wurden die Fohlen von einer Person am Kopf und von einer weiteren an der Hinterhand fixiert. Zunächst wurden die Nüstern mit einem feuchten Tupfer gereinigt. Dann führte eine Person das Endoskop in den ventralen Nasengang, während eine vierte Person die Steuerung des Bronchoskops und die Probenentnahme aus der Trachea durchführte. Gleichzeitig wurde die Farbe der Schleimhäute, die Form der Carina tracheae und die Menge und Viskosität des Trachealsekretes beurteilt.
Ein Teil des so gewonnenen Sekretes wurde sofort mit einem Tupfer in ein steriles Versandröhrchen mit Amies-Transportmedium (Venturi Transsystem®, Copan Italia, Brescia Italy) gegeben. Dieses wurde über die Deutsche Post AG an das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover versandt, wo der kulturelle Nachweis von Rhodococcus equi durchgeführt wurde. Außerdem wurde ein Teil des Sekretes in ein steriles Versandröhrchen ohne Medium (cultiplast® SWAB) geben. Aufgrund der besseren Handhabung wurden ab dem 25.05.2004 statt des Versandröhrchens ohne Medium sterile Eppendorfgefäße verwendet. Diese Trachealsekretproben wurden bei –25°C tiefgefroren und nach Abschluss der gesamten Probengewinnung in das Institut für Innovative-Veterinär- Diagnostik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht, wo der Nachweis von Rhodococcus equi mittels Polymerase Chain Reaction durchgeführt wurde.
Nach der Endoskopie wurde das Endoskop von außen manuell grob gereinigt. Der Arbeitskanal wurde mit einer Reinigungsbürste gesäubert. Danach fand die weitere Reinigung und Desinfektion in der Endoskopwaschmaschine (Getinge Desinfection AB; Typ: S-1345; Schweden) statt. Als Reinigungsmittel wurde das vom Hersteller empfohlene Neodisher® mediclean (Dr. Weigert GmbH & Co.KG, Hamburg) und als Desinfektionslösung das empfohlene Neodisher® Septo DN (Dr. Weigert GmbH &
Co.KG, Hamburg) verwendet.
Die verwendeten Kunstoffsonden wurden manuell gereinigt und getrocknet. Danach wurden sie mit einem Folienschweißgerät (Melaseal® 101 comfort; Melag Apparate GmbH & Co. KG, Berlin) eingeschweißt und im Autoklaven (Autoklav 23, Melag Apparate GmbH & Co. KG, Berlin) für 50 min bei 1 bar autoklaviert.
3.2.5 Kultureller Nachweis von Rhodococcus equi
3.2.5.1 Isolierung und Kultivierung von Rhodococcus equi
Die kulturelle Untersuchung des Tracheobronchialsekretes wurde im Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.
Für die Anzüchtung von Rhodococcus equi wurden die Tupfer, auf die das Tracheobronchialsekret nach Entnahme aufgetragen worden war, auf Columbia-Agar mit Schafsblut (Oxoid, Wesel), auf Staphylokokken-Streptokokken- Selektivnährböden, auf Gassner-Platten (Oxoid, Wesel) und Kochblut-Platten ausgestrichen, danach zweimal fraktioniert und bis zu 48 Stunden bei 37°C inkubiert um Einzelkolonien zu erhalten. Alle Nährmedien, außer die Kochblut-Platten, wurden unter aeroben Bedingungen im Brutraum (Firma Eberle) bebrütet. Die Kochblut- Platten wurden mikroaerophil (10% CO²) im CO²- Brutschrank (CO²-Auto-Zero, Heraeus Holding GmbH, Hannover-Hamburg) inkubiert. Zusätzlich wurden die Tupfer in einer Nährbouillon für 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Anschließend wurden sie aus dieser Anreicherung auf Columbia-Agar, Staphylokokken-Streptokokken- Selektivnährböden und Gassner-Platten isoliert und fraktioniert.
Danach wurden die Kulturen visuell untersucht. Da das Erscheinungsbild der Rhodococcus equi-Kolonien nicht immer spezifisch ist, wurden Kolonien mit
feuchtem, transparentem, weißlichem Wachstum auf Columbia-Agar subkultiviert.
Von den so entstandenen Reinkulturen wurden Gram-Färbungen angefertigt. Das angefertigte Gram-Präparat wurde unter dem Mikroskop beurteilt, wobei Rhodococcus ssp. sich als grampositive kokkoide, pleomorphe Stäbchen darstellten.
Zur Absicherung der Gattungsdiagnose wurde das api-Coryne® Testsystem (bio Merieux, Nürtingen) durchgeführt (siehe 3.2.5.3).
Um die abschließende Speziesdiagnose Rhodococcus equi stellen zu können, wurde ein CAMP-Test angefertigt, in dem der Equi-Faktor (siehe Literaturübersicht) nachgewiesen wurde.
3.2.5.2 Nachweis des Equi-Faktors
Zum Nachweis des Equi-Faktors wurde der CAMP-Test durchgeführt. Auf einer Columbia-Agar-Platte wurde dazu ein hämolysierender Staphylococcus aureus- Stamm in einem Impfstrich auf ein Columbia-Schafsblut-Agar aufgetragen und senkrecht dazu das zu untersuchende Rhodococcus-Isolat. Nach 24 stündiger, aerober Bebrütung bei 37°C bildet sich aufgrund des Synergismus zwischen dem Equi-Faktor von Rhodococcus equi und dem Hämolysin des Staphylococcus aureus eine halbmondförmige Zone einer vollständigen Hämolyse (SELBITZ, 2002).
3.2.5.3 Nachweis der biochemischen Eigenschaften von Rhodococcus ssp.
Um eine Gattungsdiagnose stellen zu können, wurden die biochemischen Eigenschaften der Bakterien mit Hilfe des kommerziell erhältlichen Testsystems api- Coryne® (api BIO Mérieux, Nürtingen) durchgeführt. Dieses Testsystem dient zur Identifizierung von klinisch relevanten coryneformen Bakterien anhand von standardisierten, biochemischen Reaktionen innerhalb von 24 Stunden.
Zur Identifizierung von coryneformen Bakterien bestand das Testsystem aus 20 Mikroröhrchen, welche dehydrierte Substrate enthielten, mit denen das Vorhandensein von 12 Enzymen und 8 Kohlenhydratfermentationen überprüft wurde.
Bei den 12 Enzymen handelte es sich um die Katalase, Gelantinehydrolase, Urease, β-Glucosidase, N-Acetyl-β-Glucosaminidase, α-Glucosidase, β-Galaktosidase, β- Glucuronidase, alkalische Phosphatase, ,Pyrrolidonyl-Arylamidase, Pyrazinamidase und Nitrat-Reduktase. Die Kohlenhydratfermentation wurde mit Glucose, Ribose,
Xylose, Manitol, Maltose, Lactose, Saccharose und Glycogen durchgeführt. Die Stoffwechselprodukte, die während der 24stündigen Inkubation bei 37°C entstanden, bewirkten entweder direkt oder nach Zugabe von Reagenzien Farbumschläge.
Anhand des Farbumschlags wurde eine Identifikation der Bakterien vorgenommen.
Dabei lautete das Profil von Rhodococcus ssp. 1110004 (siehe Tab. 10).
3.2.6 Nachweis von Rhodococcus equi mittels Polymerase Chain Reaction
Die Untersuchung des Tracheobronchialsekretes mittels Polymerase Chain Reaction (PCR) wurde im Institut für Innovative Veterinärdiagnostik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.
Die Polymerasekettenreaktion ist eine in-vitro-Methode, um DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Die Methode beinhaltet die wiederholte und rasche Abfolge von verschiedenen Temperaturzyklen, wobei immer wieder drei Schritte durchlaufen werden. Die Denaturierung der Matrizen-DNA erfolgt bei einer Temperatur von
~94°C, bei der durch das Lösen der Basenpaarungen DNA-Einzelstränge entstehen.
An diese Einzelstränge heften sich bei einer Temperatur von ca. 55°C einzelsträngige Oligonucleotidprimer an, die spezifisch erstellt wurden, um die zu untersuchende DNA zu flankieren. Im dritten Schritt erfolgt die Extension der Primer durch die DNA-Taq-Polymerase bei ca. 74°C, wodurch die DNA-Synthese stattfindet.
In einem Zyklus wird die Anzahl der Ziel-DNA-Moleküle verdoppelt. Da die neu synthetisierten Stränge jeweils wiederum als Matrize für die nächste Runde der Vermehrung dienen, kommt es zu einer logarithmischen Vervielfältigung, so dass bereits durch wenige Zyklen eine millionenfache Vermehrung des gewünschten DNA- Fragments resultiert.
3.2.6.1 Extraktion der molekularbiologischen DNA aus dem Tracheobronchialsekret Um die PCR durchführen zu können, musste die molekularbiologische DNA zunächst aus dem Tracheobronchialsekret isoliert werden. Hierfür wurde das E.Z.N.A.® Tissue DNA Mini Kit (peqlab, Biotechnologie GmbH, Erlangen) verwendet. Zum Mischen der Proben wurde der Vibrationsschüttler Vortex-Genie 2 (Scientific Industrie, NY, USA),
