Molekularbiologischer Nachweis von Rhodococcus equi

5.3.2.1 Auswahl der geeigneten PCR

LORENZ (2005) untersuchte in einer Studie die Eignung von 6 verschiedenen PCR-Varianten hinsichtlich ihres routinemäßigen Einsatzes in der Rhodococcus equi-Diagnostik. Diesem Autor standen 55 Trachealsekretproben aus dem Jahr 2003 und 19 Trachealsekretproben aus dem Jahr 2004 von dem gleichen Gestüt zur Verfügung, von dem auch die für die vorliegende Studie verwendeten Proben stammen. Es wurden dabei zum einen die Ergebnisse der jeweiligen PCR-Variante mit dem Vorhandensein von sonographisch darstellbaren Lungenabszessen und zum anderen mit dem kulturellen Nachweis verglichen. Die Spezifität der einzelnen PCRs wurde anhand verschiedener Bakterienspezies und anhand von 123 Rhodococcus equi-Isolaten geprüft. Da mit der AceA500- und der IdeR500-PCR die besten Resultate hinsichtlich der Spezifität und der Sensitivität erzielt wurden, empfiehlt es sich diese beiden PCR-Varianten (LORENZ 2005) für den Einsatz in der Routinediagnostik der Lungen-Rhodokokkose zu testen.

Die AceA500-PCR basiert auf den Nachweis eines Genabschnittes, welcher die Isocitratlyase exprimiert. Die Isocitratlyase ist das erste Enzym des Glyoxylatzyklus, welches für die Assimilation von Fettsäuren und Acetat erforderlich ist und somit essentiell für Rhodococcus equi ist (REINSCHEID et al. 1994; KELLY et al. 2002). In den von LORENZ (2005) durchgeführten Untersuchungen hatte die AceA500-PCR eine Sensitivität gegenüber der klinischen Lungenuntersuchung von 71% und eine Spezifität von 73%. Im Vergleich zur mikrobiologischen Kultur ergab diese PCR eine Sensitivität von 81% und eine Spezifität von 65%.

Die IdeR500-PCR basiert auf den Nachweis eines Genabschnittes von „IdeR“. Dies kodiert für einen Transcriptionsrepressor, welcher die eisenabhängige Proteinexpression kontrolliert (HANTKE, 2001). Von BOLAND et al. (2000) zeigten, dass „IdeR“ ein funktionelles Protein ist und in Abhängigkeit vom Fe²⁺-Gehalt die

Proteinexpression reguliert. Die von LORENZ (2005) erzielte Sensitivität der IdeR500-PCR lag bei 57%, die Spezifität bei 71% gegenüber der Lungensonographie und gegenüber des kulturellen Nachweises lag die Sensitivität bei 75%, die Spezifität bei 91%.

5.3.2.2 Auswertung der Ergebnisse der PCRs

Alle Proben durchliefen mindestens zweimal jede PCR-Variante. Bei der Auswertung wurden dann nur Ergebnisse berücksichtigt, die jeweils innerhalb jeder PCR-Variante einheitlich waren. Somit ist die Validität der Ergebnisse der molekularbiologischen Nachweise gegeben. Dadurch waren in der AceA500-PCR 13% der Proben nicht auswertbar, in der IdeR500-PCR 14% und bei der Betrachtung beider PCRs gleichzeitig gab es bei 27% der Proben keine einheitlichen Ergebnisse. Eine mögliche Erklärung für dieses Problem ist sicherlich die zum Teil sehr hohe Viskosität des Probenmaterials und das mögliche Vorliegen von Inhibitoren im Tracheobronchialsekret, welche die Präparation von bakterieller DNA aus dem Untersuchungsmaterial für die daran anschließende diagnostische PCR stark beeinträchtigen können.

5.3.2.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse der PCRs mit den sonographischen Lungenbefunden

Vergleicht man die Ergebnisse der AceA500-PCR mit den sonographischen Lungenbefunden, so liegt die Sensitivität bei 40%, da nur bei 17 der 43 Fohlen mit einer abszedierenden Pneumonie Rhodococcus equi nachgewiesen wurde. Damit liegt die AceA500-PCR unter der von LORENZ (2005) angegeben Sensitivität von 48%. Die Spezifität dagegen liegt bei 83%, da bei 29 von 35 gesunden Fohlen Rhodococcus equi nicht angezüchtet wurde und ist damit in dem von LORENZ angegeben Bereich von 90%.

Eine ähnliche Bewertung bekommt die IdeR500-PCR mit einer Sensitivität im Vergleich zur Sonographie von nur 33%, eine Spezifität von 83%. Sie erreicht damit nicht die von LORENZ (2005) angegebenen Werte.

5.3.2.4 Gegenüberstellung der Ergebnisse der PCRs mit denen der bakteriologischen Kultur

Die bakteriologische Untersuchung des Tracheobronchialsekretes wird im Rahmen der Rhodokokken-Diagnostik der Literatur als sogenannter „Goldstandard“ empfohlen (PRESCOTT, 1991; GIGUERE u. PRESCOTT, 1997). Deshalb wurde hier der molekularbiologische Nachweis mit diesem Goldstandard verglichen. Unter diesen Voraussetzungen betrug die Sensitivität der AceA500-PCR 76%, die Spezifität 100%.

Bei der IdeR500-PCR betrug die Sensitivität im Vergleich zur Kultur 78%, die Spezifität 96%.

Diese Ergebnisse zeigen, dass zahlreiche kulturell positive Proben durch die PCR nicht erkannt werden. Möglich ist, dass das Probenmaterial für diese unzureichenden Ergebnisse mitverantwortlich ist. Die Tracheobronchialsekretproben besitzen nämlich zum Teil eine hohe Viskosität, welche die DNA-Extraktion erschweren kann. Der hier eingesetzte kommerziell erhältliche DNA-Extraktionskit, E.Z.N.A.^® Tissue DNA Mini Kit, zur Extraktion der Rhodokokken-DNA scheint nicht geeignet zu sein, aus viskösem Probenmaterial ausreichend Ziel-DNA aufzukonzentrieren und die inhibitorischen Stoffe ausreichend zu entfernen. Dieses ist an den teilweise schwachen Amplificationskontrollen zu erkennen (Beispiel im Anhang, Abb. 16).

Dieses Extraktionskit wurde verwendet, da es sich in vielen diagnostischen PCRs bereits bewährt hatte und die PCR besonders hinsichtlich ihrer Eignung im routinemäßigen Einsatz geprüft werden sollte. Als Alternative zum E.Z.N.A.^® Tissue DNA Mini Kit wurde an 21 Tracheobronchialsekretproben zusätzlich die Aufreinigung mit DNAzol^® durchgeführt. Da durch eine einmalige Extraktion mit DNAzol^® keine zufriedenstellenden Ergebnisse in der PCR erreicht werden konnten, wurde die Extraktion der Rhodokokken-DNA zweimal mit DNAzol^® vorgenommen. Die Resultate der anschließend durchgeführten PCR waren bei 19 der 21 Proben auswertbar. Dies verdeutlicht, dass die Aufbereitung der Proben noch eine große Schwierigkeit darstellt und auf diesem Gebiet weitere Untersuchungen folgen sollten.

Um negative Ergebnisse in der PCR zu überprüfen, wurde das Enzym Glyceralaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) mittels PCR nachgewiesen.

Dieses Enzym ist in jeder Säugetierzelle vorhanden ist. Dadurch sollte bewiesen werden, dass die in den Proben vorhandene DNA erfolgreich extrahiert wurde und ein negatives Ergebnis in der PCR nicht auf eine fehlerhafte Durchführung der DNA-Extraktion zurückzuführen ist. Das bei allen in diese Studie eingegangenen Proben

die GAPDH nachzuweisen war, zeigt, dass die enthaltene DNA prinzipiell erfolgreich extrahiert werden konnte. Negative Ergebnisse sind somit entweder auf fehlende oder unter der Nachweisgrenze liegende Konzentration an Rhodococcus equi-DNA zurückzuführen. Eine weitere Erklärung für die mäßige Sensitivität der PCR ist, dass die AceA500- und IdeR500-PCR stärker durch enthaltene inhibitorische Stoffe gehemmt werden als die GAPDH-PCR.

Bei einigen Proben wurde Rhodococcus equi mittels Kultur nicht nachgewiesen, der molekularbiologische Nachweis dagegen war erfolgreich. Diese Ergebnisse lassen sich damit erklären, dass Rhodococcus equi durch andere Organismen beim Wachstum in der Kultur gehemmt wurde oder dass die Rhodokokken nicht wachstumsfähig waren. Somit wird deutlich, dass sich auch die kulturelle Isolierung von Rhodococcus equi als schwierig erweist.

Bei den Proben mit positivem molekularbiologischen Nachweis lag der kulturelle Keimgehalt im Mittel zwischen mittelgradig und hochgradig. In den Proben, bei denen keine Rhodococcus equi- DNA nachgewiesen werden konnte, lag der Keimgehalt zwischen gering und mittelgradig. Das bedeutet, dass der molekularbiologische Nachweis von Rhodococcus equi-DNA bei einem hohen Keimgehalt signifikant erfolgreicher war.

5.3.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse der kulturellen und