Evaluierung eines Impfstoffes zur Vorbeugung der Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen

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Evaluierung eines Impfstoffes zur Vorbeugung der Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Susanne Finze

Burg

Hannover 2015

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Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde

1. Gutachterin: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM Klinik für Pferde

2. Gutachter: Prof. Dr. Hoedemaker, Klinik für Rinderkrankheiten und Bestandsbetreuung

Tag der mündlichen Prüfung: 28. April 2015

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für Andreas und meine Eltern

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INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung 11

2. Literaturübersicht 13

2.1. Rhodococcus equi 13

2.1.1. Vorkommen und Bedeutung 13

2.1.2. Pathomorphologie der Rhodokokkose 14

2.1.3. Virulenzfaktoren 15

2.1.4. Krankheitsbild beim Fohlen 17

2.1.5. Diagnose der Rhodokokkose 18

2.2. Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen 19 2.2.1. Die humorale Immunität und Ansatzpunkte zur passiven

Immunisierung 19

2.2.2. Das unspezifische Immunsystem und Ansätze zur

Immunisierung 21

2.2.3. Die zelluläre Immunität und ihre Cytokinmuster 23 2.2.4. Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen 27 2.2.5. Immunprophylaxe am Beispiel eines anderen intrazellulären

Erregers beim Fohlen 30

3. Material und Methode 32

3.1. Probanden 32

3.1.1. Allgemeine Haltungsbedingungen der Fohlen 32 3.1.2. Bedingungen für die Aufnahme der Fohlen in die Studie 33

3.1.3. Studiendesign 33

3.2. Methoden 33

3.2.1. Untersuchungen der Fohlen 33

3.2.1.1. Allgemeinuntersuchung der Fohlen 33

3.2.1.2. Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes 34 3.2.1.3. Ultrasonografische Untersuchung der Lunge 34 3.2.2. Labordiagnostische Untersuchung des Blutes 35

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3.3. Klinische Durchführung der Studie 36 3.3.1. Charakterisierung von Impfstoff und Placebo 36

3.3.2. Die Impfung 37

3.3.3. Behandlung der Fohlen mit Pneumonie 37 3.4. Evaluierung der humoralen und zellulären Immunantwort auf den

Impfstoff 38

3.4.1. Bestimmung des Antikörpertiters im Serum 38

3.4.2. Bestimmung der Cytokinproduktion 40

3.4.2.1. Aufbereitung der PBMC 40

3.4.2.2. Stimulation der Zellen zur Cytokingewinnung 42 3.4.2.3. Bestimmung der Cytokine mittels Multiplexassay 43

3.5 . Statistische Auswertung 46

4. Ergebnisse 48

4.1. Ergebnisse der klinischen Untersuchungen 48

4.1.1. Anzahl, Geschlecht und Alter der Fohlen bei Studienbeginn 48

4.1.2. Anzahl der klinisch erkrankten Fohlen 48

4.1.3. Alter der Fohlen bei Diagnosestellung 49

4.1.4. Erkrankungsrate in Abhängigkeit vom Alter zum Impfzeitpunkt 50 4.1.5. Abszessscore bei Diagnosestellung in Hinblick auf das

Erkrankungsalter 50

4.1.6. Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung bis zur

Genesung 52

4.1.7. Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung bis

zum Therapiebeginn 53

4.1.8. Anzahl der Blutleukozyten zum Zeitpunkt der

Diagnosestellung 54

4.1.9. Diarrhö 55

4.2. Ergebnisse der Antikörperbestimmung 56

4.2.1. Antikörpertiter beider Gruppen vergleichend 56 4.2.2. P-Werte der Antikörpertiter für den Vergleich beider Gruppen 57

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4.3. Ergebnisse der Cytokinmessungen im Multiplexassay 57

4.3.1. Interleukin-4 (Medium – Ansatz) 57

4.3.2. Interleukin-4 (R. equi – Ansatz) 58

4.3.3. Interleukin-4 (PMA- Ansatz) 59

4.3.4. Gegenüberstellung der Interleukin-4 Mittelwerte 60

4.3.5. Interferon- (Medium – Ansatz) 62

4.3.6. Interferon- (R. equi – Ansatz) 63

4.3.7. Interferon- (PMA- Ansatz) 64

4.3.8. Gegenüberstellung der Interferon- Mittelwerte 65

5. Diskussion 75

5.1. Probanden 75

5.2. Unerwünschte Wirkungen 77

5.3. Klinische Wirksamkeit 77

5.4. Stimulation des humoralen Immunsystems 82

5.5. Stimulation des zellulären Immunsystems 83

5.6. Schlussfolgerungen 87

6. Zusammenfassung 89

7. Summery 91

8. Literaturverzeichnis 93

9. Anhang 112

Abbildungsverzeichnis 128

Tabellenverzeichnis 130

Danksagung 132

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

A Abszess

Abb. Abbildung

bzw. beziehungsweise C Celsius

CD Cluster of Differentiation CFU Colony-forming unit cm Centimeter

CpG Cytosin-Phosphat-Guanin CR Complement receptor CTL Cytotoxische T-Zelle

d Day

DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

Fa. Firma

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung HIP Hyperimmunplasma

HPR Meerrettichperoxidase IFN Interferon

Ig Immunglobulin IL Interleukin kb Kilobase kDA Kilodalton KGW Körpergewicht

L Lawsonia

NO Stickstoffmonooxid M. Musculus

Mac-1 Macrophage-1 antigen ml Milliliter

µl Mikroliter

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o.b.B. ohne besonderen Befund mRNA messenger Ribonukleinsäure

PAMP Pathogen-assoziierte molekulare Muster PBMC Peripherial blood mononuclear cells PCR Polymerase-Chain-Reaction

PMA Phorbol Myristase Acetat Pn Pneumonie

p.o. per os

R. equi Rhodococcus equi RNA Ribonukleinsäure Tab. Tabelle

TBS Tracheobronchialsekret TCR T-Zellrezeptor

Th T-Helferzellle TLR Toll-like receptor TNF Tumornekrosefaktor

Vap Virulenz-assoziiertes Protein

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1 Einleitung

Immunologische Defizite bei Neugeborenen gelten als Grundlage verschiedenster Erkrankungen. Beim Fohlen wird diese Unreife als Ursache für die teils dramatische Entwicklung einer Infektion mit Rhodococcus (R.) equi angesehen. R. equi ist ein grampositiver, ubiquitär vorkommender Bodensaprophyt, der weltweit sporadisch oder, vor allem in Betrieben mit Pferdeaufzucht, endemisch in Erscheinung tritt. Er verursacht beim Fohlen eine eitrige, abszedierende Bronchopneumonie, die akut bis chronisch verlaufen kann. Pferde, welche älter als sechs Monate sind, erkranken in der Regel nicht. Vor allem in größeren Zuchtbetrieben verursacht die Rhodokokkose des Fohlens hohe wirtschaftliche Schäden durch Fohlenverluste und langfristige Therapiemaßnahmen. Oft wird die Erkrankung erst spät erkannt, wenn sich bereits viele Abszesse in der Lunge des Fohlens gebildet haben. Einen wirksamen Schutz vor der Rhodokokkose des Fohlens durch immunprophylaktische Maßnahmen gibt es trotz jahrelanger Bemühungen bislang nicht.

In den letzten Jahrzehnten wurden vielfältige Versuche mit unterschiedlichen Impfstrategien durchgeführt, um eine geeignete Methode zur Immunisierung von Fohlen zu ermitteln. Doch bisher konnten weder die Varianten der aktiven Impfung noch die passive Immunisierung die Rhodokokkose des Fohlens zufriedenstellend verhindern. Als Ursache dafür wird die Unreife des neonatalen Immunssystems angenommen, denn die Fohlen infizieren sich oftmals bereits kurz nach der Geburt.

Hinzu kommt die Schwierigkeit, einen intrazellulären Erreger zu bekämpfen.

Virulente Stämme von R. equi haben sowohl die Fähigkeit, in Makrophagen zu überleben, als auch sich dort zu vermehren. Um einen wirksamen Immunschutz aufzubauen, muss somit das humorale und das zelluläre Immunsystem aktiviert werden. Eine Schlüsselrolle dabei spielt Interferon-, ein entzündungsförderndes Cytokin, dessen Konzentration bei neugeborenen Fohlen als insuffizient eingeschätzt wird. Neuere Studien zeigen, dass die Immunantwort von Fohlen zwar quantitativ geringer ausgebildet ist als die von adulten Pferden, qualitativ jedoch der erwachsener Pferde entspricht (WAGNER et al. 2010). Diese Ergebnisse zeigen,

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dass Fohlen in der Lage sind, eine proinflammatorische Immunantwort aufzubauen.

In der vorliegenden Studie wurde ein R. equi - Impfstoff auf seine Wirksamkeit und Unbedenklichkeit getestet. Durch die mehrfache Impfung der Fohlen wenige Tage nach der Geburt soll frühestmöglich eine schützende Immunantwort aufgebaut werden. Der attenuierte Lebendimpstoff bietet dabei eine optimale Antigenpräsentation, ohne eine Erregerverbreitung zu bewirken. In der Studie wurden neben der klinischen Wirkung eines neu entwickelten, attenuierten Lebendimpfstoffes ebenfalls die Bildung spezifischer Antikörper als Ausdruck der humoralen Immunität und die Produktion verschiedener pro- und antiinflammatorisch wirksamer Cytokine als Ausdruck der zellulären Immunität geprüft.

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2 Literaturübersicht

2.1 Rhodococcus equi

2.1.1 Vorkommen und Bedeutung

Rhodococcus equi (R. equi) wurde erstmalig im Jahr 1923 von MAGNUSSON als Erreger einer eitrigen Bronchopneumonie beim Fohlen beschrieben und aufgrund seiner morphologischen Eigenschaften zunächst der Gattung Corynebakterium zugeordnet.

R. equi ist ein weltweit verbreiteter, ubiquitär vorkommender Bodensaprophyt mit hoher Tenazität (TAKAI et al.1986; DEBEY u. BAILEY 1987; KNOTTENBELT 1993;

MEYER-HAMME 2004). In Pferdehaltungen, in denen die Rhodokokkose des Fohlens endemisch auftritt, sorgt diese Erkrankung durch Fohlenverluste, Management- und Therapiekosten für hohe wirtschaftliche Schäden (MUSCATELLO et al 2006a). Die Morbidität der Fohlen beträgt zwischen 5 und 60% weltweit. Die Letalität liegt unbehandelt bei 40 bis 80% (HILLIDGE 1986; MARTENS et al. 1989).

Neben der Bronchopneumonie treten in einigen Gebieten bei etwa 50% der erkrankten Fohlen zugleich extrapulmonale Symptome auf (PRESCOTT u.

HOFFMAN 1993; AINSWORTH 1999). Pferde, die älter als sechs Monate sind, erkranken nicht an Rhodokokkose (WILSON 1955; YAGER 1984), können jedoch Träger sein. Der Erreger wird sogar als ein Bestandteil der physiologischen Darmflora des Pferdes angesehen (WOOLCOCK u. MUTIMER 1980).

Die Isolierung von R. equi ist auch in verschiedenen anderen Tierarten beschrieben.

Bei Schweinen kann der Erreger eine chronische, cervicale Lymphadenitis verursachen, aber auch bei gesunden Tieren nachgewiesen werden (KARLSON et al. 1940; BARTON u. HUGHES 1984).

R. equi gilt als potentiell humanpathogen. Als gefährdet gelten immunsupprimierte Menschen, die beispielsweise unter einer HIV-Infektion leiden oder mit Cortikosteroiden längerfristig therapiert werden (HARVEY u. SUNSTROM 1991;

PRESCOTT u. HOFFMAN 1993).

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2.1.2 Epidemiologie, Morphologie und Pathogenese

R. equi ist ein grampositives, säurefestes, pleomorphes, unbewegliches, ca. 1,2 x 1,4 µm großes Stäbchen mit einer Polysaccharidkapsel (WILSON 1955; WOOLCOCK u.

MUTIMER 1978; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Ferner ist R. equi ein obligat aerober Keim, der äußerst widerstandsfähig gegenüber Säuren, Basen und Desinfektionsmitteln ist (WILSON 1955; BARTON u. HUGHES 1984; TAKAI et al.

1991; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993). Optimale Bedingungen findet das Bakterium in den Sommermonaten bei Trockenheit und Wärme. In diesem Zeitraum findet man die höchste Prävalenz an Lungenentzündungen bei Fohlen (WILSON 1955; YAGER 1987). Das Einatmen von R. equi-haltigem Staub wird als Hauptinfektionsweg angesehen. Des Weiteren stellt die orale Aufnahme von Kot eine wichtige Infektionsquelle dar (PRESCOTT et al. 1984). Die Besiedlung des Darmtraktes der Fohlen beginnt bereits in ihrer ersten Lebenswoche. TAKAI et al. (1986) konnten schon zu diesem Zeitpunkt R. equi im Fohlenkot nachweisen. Diese Route führt allerdings in den meisten Fällen lediglich zur weiteren Verbreitung des Keims, es sei denn, das Fohlen nimmt wiederholt eine große Anzahl an Bakterien auf (JOHNSON et al. 1983a). Das ist möglich, da sich R. equi in frischem Fohlenkot besonders gut vermehren kann (TAKAI et al. 1986b). Beschrieben sind ebenfalls die intrauterine Infektion und die Infektion über den Nabel (BARTON u. HUGHES 1980).

An Rhodokokkose erkranken Fohlen bis zu einem Alter von sechs Monaten. Die Mehrzahl der erkrankten Tiere ist allerdings jünger als vier Monate (ZINK et al. 1986, MUSCATELLO et al. 2006b). Die Erkrankung kann sporadisch oder endemisch auftreten (WILSON 1955; PRESCOTT et al. 1984; YAGER 1987; AINSWORTH 1999). Es besteht dabei ein Zusammenhang zwischen einer hohen Tierdichte und großen Erkrankungszahlen (COHEN et al. 2005). Trotzdem gilt es als gesichert, dass der Krankheitsverlauf nicht in erster Linie vom Keimdruck, sondern vom Vorhandensein des Virulenzproteins A (Vap A) abhängig ist (TAKAI et al. 1991).

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Nach der Inhalation wird R. equi von Alveolarmakrophagen phagozytiert. Virulente Stämme haben die Fähigkeit, sich in Makrophagen zu vermehren und zu einer pyogranulomatösen Entzündungsreaktion mit Bildung von mehrkernigen Riesenzellen zu führen (JOHNSON et al. 1983b).

Die Phagozytose des opsonierten R. equi erfolgt in erster Linie über die Bindung am Makrophagen-Komplement-Rezeptor CR3 (Mac-1; CD11b, CD18) (HONDALUS et al.

1993). Auch eine Beteiligung von Lipoarabinomannan, einem Oberflächenprotein von R. equi, welches am Mannose-Rezeptor von Makrophagen bindet, wird in Betracht gezogen (GARTON et al. 2002). Virulente Stämme sind nun in der Lage, das Phagosom so zu beeinflussen, dass die Ansäuerung und die Phagosom-Lysosom- Fusion verhindert wird (ZINK et al. 1987; FERNANDEZ-MORA et al. 2005;

TOYOOKA et al. 2005). Daraufhin führt die unkontrollierte Vermehrung von R. equi in der Zelle zur Nekrose des Makrophagen (LÜHRMANN et al. 2004), gefolgt von einer pyogranulomatösen Entzündungsreaktion des umliegenden Lungenparenchyms.

In vitro Versuche zeigen, dass Makrophagen von Mäusen, die durch Interferon-

(IFN-) aktiviert wurden, in der Lage sind, reaktive Sauerstoffspezies zu bilden, und dass sie dadurch R. equi erfolgreich abwehren können (DARRAH et al. 2000).

Außerdem scheinen Bakterien, welche mit R. equi-spezifischen Antikörpern opsoniert sind, die Phagosom-Lysosom-Fusion eher zu fördern als zu unterbinden (HIETALA u.

ARDANS 1987). Das zeigt, dass Antikörper eine gewisse Rolle bei der Bekämpfung der Infektion spielen.

2.1.3 Virulenzfaktoren

Virulente Stämme von R. equi haben die Fähigkeit, intrazellulär zu überleben und sich dort zu vermehren (HONDALUS u. MOSSER 1994). Diese Fähigkeit ist auf verschiedene Virulenzfaktoren zurückzuführen. Je nach Vorhandensein dieser Virulenzfaktoren kann es zu endemischen Krankheitsausbrüchen kommen oder aber trotz R. equi–Isolaten in Betrieben keinerlei oder nur sporadisch Probleme geben (ROONEY 1966; TAKAI et al.1991). Isolate von klinisch auffälligen Fohlen haben eine höhere Virulenz als Isolate aus der Umgebung (ROONEY 1966, VENNER et al.

2007).

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Diese virulenten Stämme besitzen eine oder mehrere Kopien eines etwa 80-90 kb großen Plasmides (TAKAI et al. 1991b; RODRIGUEZ-LAZARO et al. 2006). Auf der Pathogenitätsinsel dieses Plasmides sind die Gene der Proteinfamilie der Virulenz- assoziierten Proteine (Vaps) codiert. Dazu gehören sechs vollständige Gene (VapA, -C, -D, -E, -G, -H) und drei unvollständige Pseudogene (VapF, -I, -X) (LETEK et al.

2008). Bis heute wurde nur die Rolle des VapA als wichtiger Virulenzfaktor beim Fohlen bewiesen. Dieses etwa 15 – 17 kDa große VapA ist ein Lipoprotein auf der Oberfläche des Bakteriums, welches immunogen wirkt (GIGUÈRE et al. 1999;

LÜHRMANN et al. 2004). Es wurde gezeigt, dass VapA für eine persistierende Infektion und das Vermehren in Makrophagen essentiell ist (JAIN et al. 2003).

Neuere Studien an Fohlen zeigen, dass neben VapA auch VapC stark immunogen wirkt und eine lymphoproliferative Immunantwort auslöst (JACKS et al. 2007).

Die Expression der Vap–Gene wird erhöht, wenn das Bakterium sich in Makrophagen befindet. Nährstoffe, Temperatur und pH-Wert beeinflussen dies maßgeblich.

Besonders günstig für die Expression von VapA ist eine Temperatur von 37°C, ein pH-Wert von 5 – 6,5 und verfügbares Eisen. Auch die Konzentration von Magnesium beeinflusst die Genexpression (TAKAI et al. 1996; MEIJER u. PRESCOTT 2004).

Neben den Plasmid-codierten haben auch chromosomal-codierte Gene eine Bedeutung für die Virulenz. Beispielsweise besitzt das Genom von R. equi Gene für Zwei-Komponenten-Regulationssysteme, welche die Expression anderer Gene fein justieren. Mutationen dieser Regulationssysteme können zu Hypervirulenz führen (REN u. PRESCOTT 2004; PEI 2007). LETEK et al. (2010) zeigten in Microarray- Studien, dass zwischen dem Virulenzplasmid und dem chromosomalen Genom von R. equi eine molekulare Kommunikation („cross-talking“) stattfindet. Dadurch kann sich der Erreger optimal an seine Umgebung anpassen und seine Überlebensfähigkeit verbessern.

Das 20 kDa große Oberflächenprotein VapB wird als intermediär virulent bezeichnet.

Es konnte in Lymphknoten erkrankter Schweine und Menschen isoliert werden, wurde jedoch niemals bei Fohlen oder in ihrer Umgebung gefunden (TAKAI et al.

1996; LÜHRMANN et al. 2004; LETEK et al. 2008).

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Weitere mögliche Virulenzfaktoren sind die „Equi-Faktoren“. Dazu gehören Kapselpolysaccharide, die die Phagozytose des Wirtes hemmen, ebenso wie Exoenzyme mit membranolytischen Eigenschaften, wie die Phospholipase C oder die Cholesteroloxidase (PRESCOTT et al. 1982; HONDALUS 1997).

2.1.4 Krankheitsbild beim Fohlen

Die klassische Ausprägung einer Rhodokokkose beim Fohlen ist die pyogranulomatöse Bronchopneumonie (ZINK et al. 1986). Nicht immer tritt diese klinisch zum Vorschein. Oftmals erholen sich subklinisch erkrankte Fohlen ohne Behandlung spontan, die Infektion ist dann nur bei einer Ultraschalluntersuchung der Lunge sichtbar (VENNER et al. 2012).

Die Symptome der klinisch apparenten Rhodokokkose sind wenig spezifisch und könnten auch durch andere Erreger verursacht werden (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; AINSWORTH 1999). Das zu erwartende Krankheitsbild spiegelt das einer chronischen Erkrankung der Atemwege wider. Die Fohlen zeigen ein- oder beidseitig mukösen bis purulenten Nasenausfluss, eine abdominal verstärkte Atmung und Inappetenz. Des Weiteren können sie Gewicht verlieren und ein struppiges Haarkleid bekommen. Während der Auskultation von Lunge und Trachea kann ein verschärftes Atemgeräusch, Rasseln oder Giemen festgestellt werden. Wird die Diagnose erst spät gestellt, ähneln die Symptome einer akuten Atemwegserkrankung. Die Fohlen zeigen Tachypnoe, Husten, Fieber und Lethargie. Ein kleiner Teil der Fohlen entwickelt eine schwere Verlaufsform. Diese ist gekennzeichnet durch plötzliche, schwere Atemnot und hohes Fieber. Wenn die Diagnose zu spät gestellt wird, können solche Fohlen auch trotz eingeleiteter Behandlung versterben (MARTENS et al. 1982; FALCON et al. 1985; GIGUÈRE u PRESCOTT 1997; AINSWORTH 1999).

Extrapulmonale Krankheitsformen können unabhängig oder in Verbindung mit der Bronchopneumonie einhergehen. Diarrhö kann als Folge einer ulcerativen Typhlocolitis, aber auch als Reaktion auf eine Antibiotikatherapie auftreten. Die Colitis ist gekennzeichnet durch eine pyogranulomatöse Lymphadenitis der regionalen Lymphknoten. Intraabdominale Abszesse und Peritonitis treten nur selten auf

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(JOHNSON et al. 1983a; ZINK et al. 1986; REUSS et al. 2009). Zuweilen können septische Arthritis, Osteomyelitis oder Polysynovitis auftreten (CHAFFIN et al. 1995;

REUSS et al. 2009). Fohlen, bei denen immun-vermittelte Symptome wie Uveitis, hämolytische Anämie oder Pemphigus auftreten, haben schlechtere Chancen auf Genesung als andere (REUSS et al. 2009).

2.1.5 Diagnose der Rhodokokkose

Um die Prognose für die erkrankten Fohlen zu optimieren, ist es essentiell, im frühen Stadium der Pneumonie die richtige Diagnose zu stellen. Der Verdacht kann nach eingehender Anamnese und Untersuchung gestellt werden. Oftmals werden lethargische Fohlen mit Dyspnoe und Fieber vorgestellt. Hinweisend sind die klinischen Befunde in Kombination mit hämatologischen Ergebnissen, wie einer ausgeprägten Leukozytose und Hyperfibrinogenämie. Der Verdacht wird verstärkt durch den Nachweis von multifokalen Verdichtungen im Lungengewebe durch die ultrasonografische und/oder röntgenologische Untersuchung (FALCON et al. 1985;

HILLIDGE 1986; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; GIGUÈRE et al. 2003). Die ultrasonografische Untersuchung ermöglicht die Visualisierung der lateralen Lungenoberfläche und somit den Nachweis pleuranaher Abszesse. Dabei erweist sie sich als wesentlich sensibler als die Röntgenuntersuchung der Lunge (VENNER 2014). Nicht zuletzt wegen der vergleichsweise einfachen Durchführung eignet sich die Ultraschalluntersuchung der Lunge gut für Monitoring und Früherkennung auf endemischen Betrieben, auch wenn Abszesse tief im Lungengewebe nicht erkannt werden können (RAMIREZ et al. 2004).

Die Verdachtsdiagnose muss durch eine Erregerisolierung bestätigt werden. Diese gestaltet sich oftmals problematisch, da R. equi potentiell intrazellulär überleben kann und nur periodisch über die Atemwege oder den Kot ausgeschieden wird. Somit gelingt der Nachweis nur in etwa 50% der Fälle (MARTENS 1982; HILLIDGE 1986;

GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Geeignetes Material sind Proben von Tracheobronchialsekret (TBS) und Kot. Als „Goldstandard“ gilt die Kultivierung des Erregers aus dem TBS (HILLIDGE 1986; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Der

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Nachweis aus dem Kot ist ebenfalls zuverlässig und einfach durchzuführen (LÄMMER 2010). Um den Nachweis eines virulenten Stammes zu erbringen, ist die Polymerasekettenreaktion (PCR) eine geeignete Methode. Sie benötigt wesentlich weniger Zeit als die Kultivierung des Erregers aus dem TBS, jedoch sind Sensitivität und Spezifität der PCR geringer (SELLON et al. 2001; VENNER et al. 2007).

2.2 Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen

Dass erwachsene Pferde und auch einige Fohlen nicht an einer R. equi–Infektion erkranken, junge Fohlen hingegen schwere Krankheitsbilder zeigen können, geht auf die Virulenz des Pathogens im Zusammenspiel mit der Empfänglichkeit des Wirtes zurück (HONDALUS u. MOSER 1994). Neugeborene gelten als immunologisch unreif und haben im Vergleich zu erwachsenen Tieren immunologische Defizite.

Dazu gehören eine weniger wirksame unspezifische Immunantwort, weniger effiziente Antigen-präsentierende Zellen und die verminderte Fähigkeit, eine schützende, zelluläre Immunantwort aufzubauen (GREENOUGH 1996; ADKINS et al. 2004). Da R. equi ubiquitär vorkommt und in Gestüten und anderen Pferdebetrieben konzentriert verbreitet ist, infizieren sich neugeborene Fohlen häufig bereits kurz nach der Geburt (PRESCOTT et al. 1984). Daraus entsteht die Schwierigkeit, eine zuverlässig wirksame und sichere Immunprophylaxe gegen die R.

equi–Pneumonie der Fohlen zu entwickeln. Trotz jahrelanger Forschung und unterschiedlichsten Herangehensweisen ist noch immer kein Impfstoff kommerziell verfügbar.

2.2.1 Die humorale Immunität und Ansatzpunkte zur passiven Immunisierung

Immunglobuline bilden einen wichtigen Teil der adaptiven Immunabwehr. Sie haben die Fähigkeit, gezielt Antigene, wie immunologisch wirksame Oberflächenproteine von Erregern, zu opsonieren und damit deren Aufnahme durch Phagozyten zu verbessern. Equine Immunglobuline umfassen IgG, IgA, IgM und IgE, auch IgD scheint von Pferden gebildet zu werden. Der Anteil an IgG, welcher sieben Subklassen einschließt, beträgt etwa 80% am Gesamtrepertoire der Antikörper

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(WAGNER et al. 2004). Es wird angenommen, dass IgGb eine Schlüsselrolle in der Abwehr von bakteriellen Pathogenen spielt. JACKS et al. (2007) konnten bei erwachsenen, immunkompetenten Pferden nach experimenteller Infektion mit R. equi einen deutlichen Anstieg an IgGb nachweisen. Die Synthese von IgGb im jungen Fohlen beginnt im Vergleich zu anderen Subklassen wie IgGa und IgGT spät und erreicht in den ersten drei bis acht Monaten nicht deren Werte. Maternale Antikörper haben im Fall von IgGb nur eine Halbwertszeit von 32 Tagen. Somit liegt die Haupterkrankungsphase der Fohlen an Rhodokokkose deutlich in dieser immunologischen Lücke (HOLZNAGEL et al. 2003, WAGNER 2006). Es scheinen jedoch sowohl IgGb als auch IgGa entscheidend zu sein für die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität und die Aktivierung des Komplementsystems (TAOUJI et al.

2004; LEWIS et al. 2008).

Antikörper gegen das Oberflächenprotein VapA sind bei den meisten Fohlen mit R.

equi-Pneumonie erhöht. Jedoch können sie auch bei klinisch gesunden Fohlen nachgewiesen werden und sind auf die Vermehrung der Bakterien im Darmtrakt zurückzuführen (GIGUÈRE et al. 2003). TAOUJI et al. (2002) demonstrierten die Produktion von mucosalem IgA gegen VapA. Vermutlich bedarf es des Zusammenwirkens von lokaler und systemischer Abwehr, um den Erreger erfolgreich zu bekämpfen. Hier bietet sich eine weitere immunologische Lücke auf. IgA wird im ersten Lebensmonat noch nicht endogen gebildet und fehlt somit auf den Schleimhäuten des Respirationstraktes der Fohlen (HOLZNAGEL et al. 2003).

Um die Versorgung des neugeborenen Fohlens mit Immunglobulinen und anderen Immunmodulatoren zu verbessern und somit früh eine gezielte Abwehr zu ermöglichen, wird seit vielen Jahren mit unterschiedlichen Erfolgen Hyperimmunplasma (HIP) verabreicht. Es wurden zahlreiche Studien zu dessen Wirksamkeit durchgeführt, doch der Einsatz bleibt nach wie vor umstritten. Einige Autoren konnten positive Effekte, wie verringerte Morbidität und Letalität nachweisen (MARTENS et al. 1989; HIGUCHI et al. 1999). Andere Gruppen konnten keine schützende Wirkung demonstrieren (HURLEY u. BEGG 1995; GIGUÈRE et al. 2002;

SCHULTE 2006). Es gibt verschiedene Faktoren, die bei dem Gebrauch von HIP in der Praxis berücksichtigt werden müssen. Unterschiedliche Bedingungen können

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bereits beim Haltungs- und Hygienemanagement sowie dem Infektionsdruck auftreten. Unklarheiten folgen daraufhin über die richtige Dosierung zum richtigen Zeitpunkt, bis hin zu der Frage, ob die im HIP enthaltenen anti-R.equi-Antikörper in genügender Menge und Qualität vorliegen (HOOPER-MCGREVY et al. 2001). Aus den uneinheitlichen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass sich nicht durch die Gabe von Antikörpern allein eine Schutzwirkung gegen Rhodokokkose beim Fohlen erzielen lässt, sondern weitere Faktoren des Immunsystems berücksichtigt werden müssen.

2.2.2 Das unspezifische Immunsystem und Ansätze zur Immunisierung

Verschiedene Studien der letzten Jahre zeigten, dass auch das unspezifische Immunsystem eine tragende Rolle bei der Bekämpfung einer R. equi-Infektion spielt.

Dass Makrophagen und neutrophile Granulozyten viele Infektionen primär abwehren, ist unbestritten (TIZARD 2008). Allerdings ist die Fähigkeit der Fohlenneutrophilen, durch „oxidativen Burst“ Pathogene zu töten, in den ersten drei Lebensmonaten schwach ausgeprägt (DEMMERS et al. 2001). Verschiedene Cytokine, IFN- und TNF-α werden zum Auslösen dieser Mechanismen benötigt. Eine reduzierte IFN-- Bildung der Fohlen könnte das verminderte Abtöten der Keime durch Phagozyten erklären (BREATHNACH et al. 2006).

DARRAH et al. (2004) stellten an Mäusen fest, dass VapA effektiv die Toll-like- Rezeptor (TLR)-abhängige Aktivierung von Makrophagen und somit die Produktion und Freisetzung von Cytokinen auslösen kann. Sie untersuchten dabei die Rolle des TLR2, welcher auf Makrophagen, Dendritischen Zellen, B- und T-Zellen zu finden ist.

Der TLR2 erkennt Pathogen-assoziierte, molekulare Muster (PAMP), wie Lipoproteine, auf der Bakterienoberfläche. Nach der Bindung der Abwehrzelle an PAMPs kommt es zu einer intrazellulären Signalkaskade, welche zur Ausschüttung verschiedener Entzündungsmediatoren führt. R. equi bewirkt eine sehr effiziente Ausschüttung von TNF, IL-12 und NO aus Makrophagen. Interleukin-12 induziert die Bildung von IFN- aus T-Zellen und Natürlichen Killerzellen. IFN- bewirkt die Aktivierung von Makrophagen und fördert somit das Abtöten intrazellulärer Erreger (DARRAH et al. 2000). Beim Menschen konnte in Nabelschnurblut eine verminderte

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TLR3-vermittelte IL-12 Produktion in festgestellt werden, nachdem durch das Stimulanz Polyinosinic-polycytidylic-acid eine virale, intrazelluläre Infektion imitiert wurde (DE WIT et al. 2003). Ob hingegen der TLR2-Pfad bei neugeborenen Fohlen insuffizient ist, bedarf weiterer Untersuchungen.

Neutrophile Granulozyten von Fohlen können über den TLR9 stimuliert werden.

Dieser befindet sich im Gegensatz zum TLR2 im Inneren der Zelle, nämlich im Endosom, und erkennt aufgenommene bakterielle DNA, welche reich an unmethylierten CpG-Dinukleotiden ist (VOLLMER 2006). TLR9 ist somit besonders wichtig für Phagozyten, um intrazelluläre Pathogene zu bekämpfen. Dieser Signalweg ist bei neutrophilen Granulozyten des Fohlens entwickelt und kann bereits kurz nach der Geburt durch CpGs aktiviert werden. Auch die Aktivierung der Neutrophilen durch R. equi gelingt bereits kurz nach der Geburt. Die Bildung des Cytokins IL-12 steigt jedoch erst acht Wochen nach der Geburt deutlich an (LIU et al.

2009).

Die Fähigkeit von CpGs, über den TLR9 Phagozyten zu aktivieren, wurde wiederholt zur Impfstoffentwicklung herangezogen. Die Wirkung einer rekombinanten VapA/CpG-Vakzine wurde an neugeborenen Fohlen untersucht (LOHMANN et al.

2013). Die Fohlen der Impfgruppe (n = 8) wurden im Mittel am dritten Lebenstag intramuskulär geimpft. Die Impfung wurde nach 14 Tagen wiederholt. Vier Wochen nach der ersten Impfung wurden die Fohlen intrabronchial mit virulentem R. equi infiziert. Die Fohlen der Impfgruppe zeigten einen signifikanten Anstieg an VapA- spezifischen IgG. Des Weiteren konnten sie nach der Infektion einen deutlichen Anstieg von IFN--mRNA in bronchoalveolären Lavagezellen der geimpften Fohlen feststellen. Post mortem zeigte die Untersuchung der Lungenläsionen jedoch keine Unterschiede zwischen Impf- und Kontrollgruppe. Die Impfung konnte die Fohlen trotz Antikörperproduktion und IFN--Expression nicht schützen. Die Autoren mutmaßen, dass die lokale (pulmonale) Immunität mehr stimuliert werden müsse und der CpG-Strang nicht genügend stimulatorische Wirkung zeigte. Weitere Untersuchungen werden benötigt, um genauere Einblicke in den Einfluss einzelner Immunkomponenten zu bekommen.

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23

2.2.3 Die zelluläre Immunität und ihre Cytokinmuster

R. equi ist ein fakultativ intrazellulär lebendes Pathogen. Daher geht man davon aus, dass T-Zell-vermittelte Immunmechanismen die entscheidende Rolle in der Bekämpfung der Infektion spielen. In diesem Feld wurde viel Forschung an Mäusen betrieben. T-Lymphozyten sind für die Elimination von virulentem R. equi in Mäusen unbedingt erforderlich (KANALY et al. 1995). Doch funktionelle T-Lymphozyten allein genügen dazu nicht, die Differenzierung der CD4⁺ (Helfer) T-Zellen in Th1 oder Th2 ist wichtig. Denn diese entscheidet über die Sekretion bestimmter Cytokine und den Charakter der weiteren Immunantwort. Eine Th1-Antwort, welche durch IFN-- Bildung gekennzeichnet ist, bewirkt eine pulmonale Clearance von R. equi, was unter einer Th2-Antwort mit IL-4 Produktion nicht gelingt (KANALY et al. 1995, 1996).

Diese Schlüsselrolle der Th1-Antwort, welche proinflammatorisch wirkt und sowohl CD4⁺ also auch CD8⁺(cytotoxische) T-Zellen rekrutiert, wurde auch bei adulten Pferden dargelegt (HINES et al. 2001). Ein starkes Stimulanz, um naive T-Zellen zu Th1-Zellen zu differenzieren, stellt IL-12 dar. Es wird von aktivierten Makrophagen, Neutrophilen und dendritischen Zellen gebildet (KANALY et al. 1995). Die dabei mobilisierten CD4⁺ und CD8⁺T-Zellen sind eine wichtige Quelle für IFN- (HINES et al. 2003). Mäuse, in denen IFN- neutralisiert wurde, können R. equi nicht erfolgreich bekämpfen und entwickeln Lungengranulome (KANALY et al. 1995).

Lymphozyten von neugeborenen Fohlen zeigen in vitro ein hochgradiges Defizit sowohl bei der Expression der IFN--Gene als auch bei der IFN--Protein-Produktion.

Beide steigen mit zunehmendem Alter an und erreichen mit etwa drei Monaten das Level von erwachsenen Pferden. Das scheint nicht allein mit einer verminderten Th1- Antwort oder wenigen Gedächtniszellen zusammenzuhängen, sondern vielmehr eine unvollständige IFN--Produktion durch T-Zellen unabhängig vom Differenzierungsstatus widerzuspiegeln (BREATHNACH et al. 2006). Die Autoren nutzten in dieser Studie mononukleäre Blutzellen (PBMC) und stimulierten diese mit Phorbol Myristase Acetat (PMA) und Ionomycin. PMA kann verschiedene Zellpopulationen über die Aktivierung der Protein Kinase C anregen. Dazu gehören unter anderem T-Zellen und B-Zellen. In T-Zellen läuft normalerweise nach einer

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24

Antigen-spezifischen T-Zellrezeptor (TCR)-Aktivierung ein intrazellulärer Signalweg ab, der zur Differenzierung der Zelle und Produktion verschiedener Cytokine führt.

PMA kann T-Zellen unabhängig von ihrem TCR aktivieren und somit die Produktion von Cytokinen veranlassen. Dabei entsteht eine polyklonale Cytokinantwort aus dem naiven T-Zellpool, welche zeigt, was diese Zellen potentiell bilden können (WEISS et al. 1984). Ebenfalls mit PBMC von Fohlen und unter anderem auch mit PMA arbeitete die Gruppe um WAGNER, als sie die Th-Zellantwort bei Fohlen in den ersten drei Lebensmonaten analysierten. Sie untersuchten dafür die Cytokinproduktion von IFN- (Th1), IL-4 (Th2) und IL-10 (mit IFN- TR1=

regulatorische T-Zellen). Dabei wurde ebenfalls eine reduzierte IFN--Produktion bei Neonaten im Vergleich zu adulten Pferden nach PMA-Stimulation festgestellt. Ähnlich waren jedoch auch IL-4- und IL-10-Produktion vermindert. Das Th1/Th2-Verhältnis stellte sich abhängig vom Alter deutlich zu Gunsten der Th1-Antwort dar. Außerdem zeigten sich IFN-/IL-10-Verhältnisse wie beim erwachsenen Pferd und die Produktion von IFN- durch Th-Zellen und CD8⁺CTL (cytotoxische T-Zellen) in den ersten fünf Lebenstagen war klar ersichtlich. Das bedeutet, dass T-Zellen von equinen Neonaten und Fohlen in der Lage sind, Th1-, CTL- und TR1-Antworten zu bilden, die qualitativ ähnlich denen adulter Pferde sind. Darüber hinaus wurde eine verminderte Th2-Antwort beim Fohlen nachgewiesen, welche innerhalb der ersten drei Lebensmonate quantitativ nicht an Werte von erwachsenen Pferden heranreicht (WAGNER et al. 2010). Dies steht im Widerspruch zu Forschungsergebnissen bei neonaten Mäusen und Menschen, bei denen davon ausgegangen wird, dass die zellvermittelte Immunantwort den Th2-Weg durchläuft (ADKINS 2000). Eine Th2- Antwort auf Pathogene wurde auch für equine Neonate angenommen, da die Expression von IFN--spezifischer mRNA der Fohlen erst im Alter von vier Wochen signifikant steigt (BOYD et al. 2003).

Hingegen wurde die Insuffizienz der IFN--Produktion bei Fohlen deutlich in Frage gestellt (JACKS et al 2007). Neonate Fohlen wurden dazu intrabronchial mit verschiedenen Dosen virulenter R. equi infiziert. Anschließend wurden Zellen aus den bronchialen Lymphknoten mit R. equi–Antigen stimuliert. Es zeigte sich, dass Fohlen, welche mit einer geringen Infektionsdosis (1x10⁶ CFU pro Fohlen) infiziert

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worden waren, eine signifikant höhere Expressionsmenge von IFN- mRNA und ein höheres IFN-/IL-4 Verhältnis hatten als adulte Pferde. Es muss erwähnt werden, dass alle Fohlen trotzdem Läsionen in der Lunge zeigten, was darauf schließen lässt, dass neben der Th1-Antwort ein anderer Immunmechanismus nicht funktionierte.

Den Effekt der Infektionsdosis auf die zelluläre und die humorale Immunantwort von neugeborenen Fohlen untersuchten JACKS und GIGUÈRE (2009). Fünf Fohlen wurden intrabronchial mit einer geringen Dosis (1 x 10⁶ CFU) und drei Fohlen mit einer hohen Dosis (1 x 10⁸ CFU) eines virulenten R. equi Stammes infiziert. Die Fohlen der niedrig dosierten Gruppe zeigten klinisch keine Krankheitssymptome, hatten jedoch kleine, makroskopisch sichtbare Lungenläsionen. Dagegen zeigten die Fohlen der hoch dosierten Gruppe schwere Krankheitsanzeichen und schwere, großflächige Lungenläsionen. Die hoch dosierte Gruppe entwickelte signifikant mehr IgG(T) als die niedrig dosierte. Darüber hinaus gab es eine Tendenz zu einem größeren IFN-/IL4 Verhältnis bei der niedrig dosierten Gruppe. Diese Studie zeigt, dass die Infektionsdosis sowohl die Antikörpersubklassen als auch das Cytokinprofil der Immunantwort von Fohlen beeinflussen kann. Schon in einer früheren Studie wurde virulentem R. equi die Fähigkeit zugeschrieben, die Cytokinantwort von Fohlen modulieren zu können, indem die Expression von IFN- mRNA in CD4⁺ Zellen herunterreguliert wird (GIGUÈRE et al. 1999). Die Infektionsdosis ist demnach eine entscheidende Größe für die Entwicklung sicherer und wirksamer Lebendimpfstoffe.

Bei adulten Pferden ist nachgewiesen, dass cytotoxische T-Zellen (CTL) an der Bekämpfung von R. equi beteiligt sind (HINES et al. 2003). Diese R. equi- spezifischen CTL sind nicht darauf beschränkt, den Haupthistokompatibilitäts- komplex I (MHC) zu erkennen, sondern bemerken CD1 als nicht klassenspezifisches MHC-Molekül. Dadurch scheinen sie besondere Lipide aus der Zellwand des Bakteriums zu erkennen. Dieser Weg der Antigenpräsentation ist auch bei dem R.

equi in vielerlei Hinsicht ähnlichen Erreger Mycobacterium tuberculosis beschrieben.

Dessen Lipidantigene sind Lipoarabinomannan oder Mycolsäure (PATTON et al.

2005). Unterschiede in der CD1-Expression sind bei Alverolarmakrophagen (gering) und Monozyten (höher) und der Verteilung auf mit R. equi infizierten (gering) und

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nicht infizierten (höher) Makrophagen gezeigt worden. Dabei wird vermutet, dass R.

equi die Expression von CD1 auf der Oberfläche von Makrophagen herunterregeln kann (PARGASS et al. 2009). Die signifikant verminderte Ausbildung von CD1 auf Fohlenmakrophagen im Vergleich derer adulter Pferde könnte ebenfalls ein negativer Faktor bei der Beseitigung der R. equi–Infektion durch Fohlen sein (PARGASS et al.

2009).

Abb. 1: Die zelluläre Immunantwort auf R. equi (GIGUÈRE et al. 2011)

Weiterhin wird der Einfluss des Cytokins Interleukin-17, welches stark inflammatorisch wirkt und die Abwehr von Pathogenen unterstützt sowie eine Rolle in autoimmunen Prozessen spielt (KORN et al. 2009), auf die Abwehr von R. equi angenommen. IL-17 wird von Th17-Zellen sezerniert, einer Untergruppe der T- Helferzellen. IL-23 und IL-6 bewirken die Differenzierung von Th17-Zellen aus naiven

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CD4^+-Zellen. IL-17 induziert die Bildung entzündungsfördernder Cytokine, Chemokine und Prostaglandine aus beispielsweise Makrophagen, Fibroblasten und Epithelzellen. Die mRNA von IL-17 wird ähnlich der von IL-4 in den ersten Lebenswochen der Fohlen von R. equi-stimulierten PBMC geringer gebildet als bei adulten Pferden (LIU et al. 2011). Die Mengen steigen jedoch wesentlich schneller an als bei IL-4. Interessanterweise konnte keine verminderte Th1-Antwort durch reduzierte IFN- mRNA Expression bei neonaten Fohlen festgestellt werden (LIU et al. 2011). Durch seine unterstützende Wirkung bei der Erregerabwehr wird dem IL-17 eine wichtige Bedeutung bei der Bekämpfung von R. equi zugesprochen.

2.2.4 Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen

In den vergangenen drei Jahrzehnten wurde an unterschiedlichsten Ansätzen geforscht, um eine wirksame und sichere Vakzine gegen die Rhodokokkose beim Fohlen zu entwickeln. Mit dem gleichen Hintergrund wie die bereits beschriebene Gabe von Hyperimmunplasma wurden Stuten aktiv geimpft, um Fohlen durch Aufnahme von antikörperreichem Kolostrum passiv zu schützen. Schon in frühen Untersuchungen wurde trotz eines erhöhten Antikörpergehaltes im Kolostrum kein zufriedenstellender Schutz gegen die R. equi-Pneumonie des Fohlens erkannt (MARTENS et al. 1991). In einem großen Feldversuch (800 Stuten) wurde die Gabe einer Vakzine in den letzten Monaten der Trächtigkeit getestet (BECÚ et al. 1997).

Diese Vakzine enthielt lösliche Antigene von R. equi, darunter auch VapA. Nach der Impfung wurde ein Rückgang der Fohlenmortalität, verursacht durch die R. equi- Pneumonie, von 3% auf 1,2% beobachtet. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Immunantwort der geimpften Stuten sehr variabel war. Letztlich konnte durch die Vakzine kein zuverlässiger Schutz erzielt werden. Eine weitere Studie verglich die IgG-Konzentrationen in tragenden Stuten, welche mit VapA-Antigen verbunden mit einem wasserbasierten Nanopartikeladjuvans (n = 24) oder einem abgetöteten Ganzzellimpfstoff (n = 8) vakziniert wurden (CAUCHARD et al. 2004). Die VapA- Vakzine bewirkte höhere Serum-IgG-Werte als die andere Impf- und die Kontrollgruppe. Von den 32 in diesem Versuch passiv immunisierten Fohlen

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entwickelte keines eine R. equi-Pneumonie. Daraus ergeben sich Ansätze, um auf diesem Gebiet in größeren Tiergruppen weitere Untersuchungen durchzuführen.

Im Rahmen der Entwicklung neuer Impfstrategien gegen die Rhodokokkose beim Fohlen ist die Testung von Vakzinen an Mäusen nicht wegzudenken. Doch vielversprechende Ergebnisse im Mausmodell bedeuten nicht zwangsläufig ebensolche Resultate beim Fohlen. Eine VapA exprimierende DNA-Vakzine bewirkt bei Mäusen eine ausgeprägte Th1-Immunantwort und schützt gegen eine Infektion mit R. equi (HAGHIGHI u. PRESCOTT 2005). Bei erwachsenen Pferden konnte mit einer ähnlichen Vakzine sowohl eine starke zelluläre als auch humorale Immunantwort erzeugt werden (LOPEZ et al. 2003). Im selben Versuch wurden neonate Fohlen (8. bis 15. Lebenstag, n = 5) mit dieser Vakzine geimpft. Nur bei wenigen Fohlen konnten nach 45 Tagen R. equi-spezifische IgGa, IgGb und IgM gemessen werden. Fohlen reagierten somit wesentlich schwächer auf diese Vakzine als erwachsene Pferde.

Ein anderer Impfversuch an Mäusen erzielte eine gute Schutzwirkung gegen R. equi.

Der verwendete attenuierte Lebendimpfstoff enthielt VapA exprimierende Salmonella enterica typhimurium. Nach oraler Immunisierung konnten alle Mäuse der Impfgruppe eine Infektion mit R. equi abwehren und überlebten, dagegen starben alle Mäuse der Kontrollgruppe (OLIVEIRA et al. 2007). Gemessen wurden die Clearance, welche bei der Impfgruppe bis zu siebenfach höher war, sowie Antikörper im Serum der Mäuse, wo sich in der Impfgruppe hohe Werte von IgGa zeigten. Die nasale Applikation des Impfstoffes an Mäusen zeigte, dass durch den attenuierten Lebendimpfstoff ein langanhaltender, humoraler und zellulärer Schutz gegen eine Infektion mit R. equi aufgebaut wird. Außerdem wurde an TLR2-negativen Mäusen dargestellt, dass dieser für den Aufbau einer protektiven Immunantwort nicht unbedingt erforderlich ist (CARDOSO et al. 2013). Es bleibt abzuwarten, welche Ergebnisse Studien an Fohlen in diesem Feld bringen.

LOPEZ et al. (2008) untersuchten die Wirkung eines vollständig attenuierten Lebendimpfstoffes, der einen Riboflavin-auxothrophen R. equi-Stamm enthält. Die

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Autoren immunisierten zunächst Mäuse intrabronchial. Der Impfstoff erwies sich als immunogen und induzierte die Bildung von IFN-, war sicher und schützte die Mäuse bei einer Infektion mit virulentem R. equi. Auch die intrabronchiale Immunisierung von Fohlen stimulierte eine spezifische Immunantwort und erwies sich als sicher, schützte allerdings nicht vor einer Erkrankung mit virulentem R. equi. Man geht davon aus, dass die Vermehrung des Pathogens notwendig ist, um eine starke zelluläre Immunantwort zu entwickeln. Anderenfalls ist es möglich, dass der Erreger schnell eliminiert wird, ohne ausreichend immunologisch wirksam zu sein. Dies trifft auch auf avirulente R. equi-Stämme zu (HINES et al. 2003).

Die orale Verabreichung einer virulenten R. equi-Lebendvakzine schützte Fohlen vor einer induzierten, intrabronchialen Infektion mit virulentem R. equi (HOOPER- MCGREVY et al. 2005). Die Fohlen (n = 4) wurden am 2., 7. und 14. Lebenstag oral mit 100 ml der Vakzine, die 1 x 10⁸ CFU/ml R. equi enthält, geimpft und in der dritten Lebenswoche intrabronchial infiziert. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe (n = 3) entwickelten die geimpften Fohlen weder eine klinische Erkrankung noch Läsionen in der Lunge. Antikörper gegen VapA und VapC konnten bei der geimpften Gruppe nachgewiesen werden. Entgegen anderen Ergebnissen zeigten sich dabei hohe Titer an IgGT und ein geringes IgGa/IgGb-Verhältnis im Serum geimpfter Fohlen. Die Studie zeigt, dass trotz maternaler Antikörper und der Unreife des neonatalen Immunsystems eine erfolgreiche Impfung sehr junger Fohlen möglich ist. Der Vorteil einer oralen Impfung liegt in der zusätzlichen Stimulation der mucosalen Immunität.

Nachteilig ist die fäkale Verbreitung des Pathogens und somit die Kontamination der Umgebung. Daher ist die orale Gabe einer virulenten Lebendvakzine nicht praxistauglich (HOOPER-MCGREVY et al. 2005). Vielversprechend scheint die Gabe einer attenuierten Lebendvakzine, die einerseits immunologisch wirksame Komponenten enthält und die Vermehrung des Erregers zulässt, andererseits durch Modellierung ihrer virulenten Eigenschaften sicher ist und sich zur Applikation über Schleimhäute eignet. Die Erprobung solch einer Vakzine ist Inhalt der vorgelegten Studie.

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30

2.2.5 Immunprophylaxe am Beispiel eines anderen intrazellulären Erregers beim Fohlen

Die equine proliferative Enteropathie ist eine Erkrankung, die vom gram-negativen, obligat intrazellulären Bakterium Lawsonia intracellularis hervorgerufen wird. Anders als bei der Rhodokokkose können auch erwachsene Pferde erkranken, vorwiegend gefährdet sind jedoch Fohlen vom zweiten bis achten Lebensmonat. Als besonders prädestinierend gilt die Phase nach dem Absetzen. L. intracellularis vermehrt sich hauptsächlich in Enterozyten (LAVOIE et al. 2000).

Ein attenuierter Lebendimpfstoff von L. intracellularis wurde frisch abgesetzten Fohlen zweimal im Abstand von drei Wochen oral (Gruppe 1) oder intrarektal (Gruppe 2) appliziert. Die Ausbildung der humoralen Immunantwort und die Dauer der fäkalen Ausscheidung des Pathogens wurden untersucht. Der Nachweis im Kot war bei Gruppe 2 nur wenige Tage länger (bis zu 15) als bei Gruppe 1 (bis zu 12) möglich. Die Ausbildung von spezifischen Antikörpern war in Gruppe 2 bei allen Fohlen nach der ersten Impfung im Serum messbar, in Gruppe 1 dagegen nur bei 50% (PUSTERLA et al. 2009).

Die zelluläre Immunantwort auf eine Infektion mit L. intracellularis wurde nach Impfung mit einer avirulenten L. intracellularis-Lebendvakzine und natürlicher Infektion verglichen (PUSTERLA et al. 2012a). Dabei zeigte sich, dass die IFN-- Genexpression in PBMC bei geimpften (n = 6) und natürlich infizierten Fohlen (n = 16) ähnlich war, jedoch signifikant höher als bei unbehandelten Kontrollfohlen (n = 6).

Schließlich testete die Gruppe die Wirksamkeit einer avirulenten L. intracellularis- Lebendvakzine nach experimenteller Infektion mit virulentem L. intracellularis an abgesetzten Fohlen. Die Fohlen wurden 60 und 30 Tage vor der Infektion intrarektal geimpft. Es stellte sich heraus, dass geimpfte Fohlen (n = 4) signifikant weniger Bakterien im Kot ausschieden als ungeimpfte, infizierte Fohlen (n = 4). Keines der geimpften Fohlen zeigte klinische Symptome, ungeimpfte Fohlen erkrankten teils schwer (PUSTERLA et al. 2012b).

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Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass ein intrarektal applizierter Lebendimpfstoff bei Fohlen eine schützende humorale und zelluläre Immunantwort gegen ein intrazelluläres Pathogen herbeiführen kann und außerdem zur Eindämmung der fäkalen Verbreitung des Erregers führt. Ob ein zur Bekämpfung der Rhodokokkose eingesetzter, intrarektal applizierter Lebendimpfstoff dies auch bei neonaten Fohlen bewirkt, ist Gegenstand der vorgelegten Studie.

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3 Material und Methoden

3.1 Probanden

Für die Untersuchungen wurden insgesamt 60 gesunde Warmblutfohlen in die Studie aufgenommen. Die Fohlen waren zum Studienbeginn zwischen acht und 14 Tage alt.

Sie wurden auf einem deutschen Gestüt mit endemischer Rhodokokkose geboren, auf welchem die Studie auch durchgeführt wurde. Die Untersuchungen an den Probanden erstreckten sich von März bis November 2013 über einen Zeitraum von 26 Wochen für das jeweilige Fohlen.

Die Studie ist vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Abteilung Gentechnik, genehmigt (Aktenzeichen 6786-01-0213).

3.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen der Fohlen

Die Fohlen wurden in Einzelboxen geboren, welche sich im Abfohlbereich des Gestüts befanden, der nur über eine Hygieneschleuse zu betreten war. Die Einzelboxen waren mit Stroh eingestreut und hatten eine Fläche von etwa 12 m². Dort wurden sie in den ersten Lebenstagen täglich klinisch untersucht, was bei unauffälligen Fohlen neben der Erfassung des Allgemeinzustandes die Untersuchung des Nabels und die Messung der Rektaltemperatur umfasste.

Nach fünf bis zehn Lebenstagen wurden die Fohlen mit Stuten in einen separierten Stallbereich verbracht, welcher sich etwa 12 km vom Hauptgestüt entfernt befand.

Dort wurden nacheinander zwei Gruppen mit jeweils 30 Stuten und Fohlen in Laufställen mit Stroheinstreu untergebracht. Sie hatten jederzeit Zugang zu Wasser und Heu und wurden zweimal täglich mit Mischfutter, bestehend aus Mais- und Grassilage, Hafer und Mineralstoffen, zugefüttert.

Die Stuten wurden entsprechend der Herstellerangaben gegen Influenza, Tetanus sowie Equines Herpes Virus 1 und 4 geimpft. Außerdem wurden alle Pferde regelmäßig entwurmt.

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3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme der Fohlen in die Studie

Aufnahmebedingung für die Studie waren gesunde, gut entwickelte Fohlen im Alter von sieben bis 14 Tagen. Sie durften bis Studienbeginn keine Antibiotika erhalten haben. Des Weiteren durften sie keine Plasmatransfusion erhalten haben. Auch schwerwiegende Fehlstellungen waren ein Ausschlusskriterium.

3.1.3 Studiendesign

Der vorgelegte Versuch ist eine kontrollierte, randomisierte Blindstudie. Sie wurde in zwei Durchgängen zu jeweils 30 Fohlen durchgeführt. Die Impfung und die Untersuchungen des ersten Durchgangs begannen im März 2013, die des zweiten Durchgangs im Mai 2013. Die Durchgänge wurden jeweils in eine Impfgruppe mit 15 Fohlen und eine Kontrollgruppe mit 15 Fohlen eingeteilt. Somit wurden insgesamt 30 Fohlen geimpft und 30 Fohlen mit einen Placebopräparat behandelt.

In den ersten zehn Wochen nach der Impfung wurden die Fohlen im separierten Stallbereich von einem konstanten Team untersucht und versorgt. Über diesen Zeitraum galten strickte Isolierungs- und Hygienemaßnahmen. So erfolgte kein Tierverkehr und nur eingewiesenen Mitarbeitern wurde Zugang gewährt. Spätere Untersuchungen erfolgten am Hauptgestüt, wohin die Fohlen nach Rhodococcus equi-negativen Kotproben (PCR auf den Impfstamm: Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. Intervet, Boxmeer, NL)) frühestens acht Wochen nach der letzten Impfung zu den anderen Stuten und Fohlen wieder integriert wurden.

3.2 Methoden

3.2.1 Untersuchungen der Fohlen

3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung der Fohlen

Alle Fohlen wurden während der gesamten Studiendauer in verschiedenen Abständen regelmäßig klinisch untersucht. In den ersten sechs Tagen ab dem

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jeweiligen Impftag wurden täglich klinische Untersuchungen durchgeführt, während der übrigen Zeit wurde dies auf eine einmal wöchentlich vorgenommene Untersuchung reduziert.

Bei der klinischen Allgemeinuntersuchung der Fohlen wurden Haltung, Verhalten und Ernährungszustand bewertet und weiterhin das Fress- und Saugverhalten sowie die Kotkonsistenz überprüft. Darüber hinaus wurden die rektale Körpertemperatur ermittelt und der Nabelstumpf kontrolliert. Außerdem wurde auf Gelenkfüllungen, Verletzungen und sonstige Auffälligkeiten wie mögliche Impfreaktionen geachtet.

Die dabei ermittelten Befunde wurden in speziellen Befundbögen notiert und entsprechend einem Score-System gewertet.

3.2.1.2 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes

Die spezielle Untersuchung des Respirationstraktes wurde stets im Anschluss an die klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt. Dabei wurden Größe, Form und Konsistenz der Manibularlymphknoten durch Palpation beurteilt. Des Weiteren wurde möglicher Nasenausfluss beurteilt. Es wurde auf spontan auftretenden Husten geachtet. Anschließend erfolgte die Auskultation von Trachea und Lunge. Dabei wurde an der Trachea mittig und an der Lunge an beiden Thoraxseiten über mindestens zwei Atemzüge auskultiert, und eventuelle verschärfte Atemgeräusche wurden in gering-, mittel- oder hochgradig eingeteilt. Pathologische Nebengeräusche wie Giemen oder Rasseln wurden ebenfalls notiert.

Die erhobenen Befunde wurden anschließend nach Schweregrad in einem klinischen Score festgehalten (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998, MEYER- HAMME 2004; LÄMMER 2010, siehe Anhang: Tab. 29).

3.2.1.3 Ultrasonografische Untersuchung der Lunge

Die ultrasonografische Untersuchung der Lunge wurde alle 14 Tage oder bei Vorliegen bestimmter krankhafter Befunde zu zusätzlichen Zeitpunkten durchgeführt.

Zu den krankhaften Befunden gehörten mittel- und hochgradig verschärfte Atemgeräusche sowie Rasseln und Giemen, Husten, deutliche Dyspnoe mit

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geblähten Nüstern und abdominaler Atmung, purulenter Nasenausfluss, hochgradig veränderte Mandibularlymphknoten, Fieber über 39,5°C sowie eine Blutleukozytenzahl von über 13.000 Zellen pro µl Blut.

Durchgeführt wurde die Untersuchung mit einem tragbaren Ultraschallgerät mit Akkubetrieb und einem 5 MHz Linearschallkopf (Tringa L, Fa. Esaote Pie Medical, Maastricht, Niederlande) nach der bereits beschriebenen Methode (MEYER-HAMME 2004; LÄMMER 2010).

Schallleitende Veränderungen von mindestens 10 mm Durchmesser, welche hypoechogen und rundlich waren, wurden als Abszess (A) dokumentiert.

Veränderungen von unter 10 mm wurden als Pneumonien (Pn) betrachtet. Waren diese Veränderungen eher oval, so wurden Länge und Breite der Zentimeterskala entnommen, addiert und durch zwei geteilt, um auf die Größe des Befundes zu schließen. Nun wurden Art, Größe und Lokalisation der Veränderung in den Befundbogen eingetragen. Schließlich wurde die Summe der einzelnen Abszesse in Zentimetern berechnet. Dies entspricht dem sogenannten „Abszessscore“, welcher den Schweregrad der Lungenveränderungen wiedergibt.

3.2.2 Labordiagnostische Untersuchung des Blutes

Während der Studie wurden den Fohlen zu verschiedenen Zeitpunkten unterschiedliche Blutproben entnommen.

Wöchentlich im Anschluss an die klinische Allgemeinuntersuchung erfolgte die Abnahme von 1-2 ml Blut aus der Vena jugularis externa mittels einer 1,2 mm x 40 mm Kanüle (BD Microlance^TM, Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland). Das Blut wurde in einem EDTA-Kalium beschichtetem Probenröhrchen aufgefangen (EDTA K, 4ml, Fa. Sarstedt AG, Nümbrecht). Nach dem elektrischen Widerstandsprinzip wurde anschließend die Leukozytenzahl pro µl Blut im Blutanalysegerät „SYSMEX KX-21N“

(Fa. Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg) bestimmt.

Des Weiteren wurde in Woche 0, 2, 4, 6, 10, 16, 26 jeweils 9 ml Blut aus einer Vena jugularis externa zur Serumgewinnung in ein Serumröhrchen (Röhre, 10 ml, Fa.

Sarstedt AG, Nümbrecht) gefüllt. Anschließend wurden die Serumröhrchen aufrecht stehend etwa 4-8 Stunden bei 4°C gelagert. Daraufhin wurden die Serumröhrchen

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36

zehn Minuten bei Raumtemperatur und 1000xg zentrifugiert. Dann wurden zweimal 1,5 ml Serum in ein Eppendorf-Röhrchen pipettiert und bei -20°C bis zur weiteren Analyse gelagert.

Außerdem wurde den Fohlen vor der Impfung sowie an Tag 1, 14, 28, 56, 84 und 112 nach der Impfung jeweils 20 ml Blut aus der Vena jugularis externa abgenommen, welches in fünf Lithium-Heparin-Probenröhrchen (Li-Heparin, 4 ml, Fa. Sarstedt AG, Nümbrecht) abgefüllt wurde. Die weitere Bearbeitung wird unter 3.4.2.1 beschrieben.

3.3 Klinische Durchführung der Studie

3.3.1 Charakterisierung von Impfstoff und Placebo

Die Fohlen der Impfgruppe erhielten die attenuierte Lebendvakzine Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL). Diese enthält den Rhodococcus equi-Stamm RG2837 mit 8 x 10¹⁰ CFU/Impfampulle. Dieser Stamm ist eine markerfreie Deletionsmutante, welche sich vom für Fohlen pathogenen und VapA-Plasmid enthaltenden Stamm R. equi RE1 ableitet. Aus dem Genom des Impfstammes RG2837 wurden gezielt große Teile der kodierenden Regionen von vier chromosomalen Genen entfernt. Neue Gene wurden nicht hinzugefügt. Der Impfstamm enthält unverändert das VapA-Plasmid, um Immunschutz im Fohlen aufbauen zu können. Deletiert wurden die Cholesterinkatabolismusgene ipdAB und die sequenzhomologen Gene ipdAB2 mittels gentechnischer Verfahren unter Verwendung des Suizid-Vektors pSelAct (VAN DER GEIZE et al. 2008, 2011).

Die Fohlen der Placebogruppe wurden mit Equillis RhodE Batch 01E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL) geimpft. Dabei handelt es sich um eine lyophilisierte Placebovaccine, welche frei von Rhodococcus equi ist.

Im Anschluss an die klinische Studie wurden Impfdosen der Vakzine sowie des Placebopräparates mittels PCR vom Hersteller (Fa. MSD) untersucht, um zu überprüfen, ob Inhalt und Kennzeichnung der Impfdosen korrekt waren.

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37 3.3.2 Die Impfung

Die Impfung der Fohlen und die Verabreichung des Placebo-Präparates wurden an Tag 0, 1, 14 und 15 der Studie durchgeführt. Dabei wurde den Fohlen jeweils 3 ml Impfstoff bzw. Placebo rektal verabreicht. Dies wurde mittels einer 5 ml Spritze und einem Intrarektalapplikator (Fa. Mai/Genesis, Spring Valley, WI, USA) durchgeführt.

Zum Zeitpunkt der Impfung wurde jedes Fohlen klinisch untersucht und eine spezielle Untersuchung des Respirationstraktes durchgeführt. Nur gesunde Fohlen durften die Impfung erhalten. Vier Stunden nach der Impfung wurde bei allen Fohlen erneut die Rektaltemperatur gemessen und der Allgemeinzustand überprüft. Die Impfung wurde von der Autorin unter der Aufsicht von Dr. T. Jacobs (Firma MSD, Boxmeer, NL) durchgeführt.

An Tag 3 und Tag 17 wurde der Laufstall komplett gemistet. Täglich wurde die Betonfläche vor dem Stall mit 1% Halamidlösung desinfiziert (Halamid® Chloramine T, Fa. Axentive, Bouc Bel Air, Frankreich). Diese Maßnahmen wurden vorgenommen, um der Verbreitung des Impfstammes in die Umwelt vorzubeugen.

3.3.3 Behandlung der Fohlen mit Pneumonie

Fohlen, die während der Studie an einer abszedierenden Bronchopneumonie mit einem Abszessscore über 8 cm erkrankten, ebenso wie Fohlen, die mindestens drei Tage Fieber über 39,5°C in Verbindung mit einem mittel- oder hochgradig verschärften Atemgeräusch sowie Rasseln, Giemen, Husten, deutlicher Dyspnoe mit geblähten Nüstern und abdominaler Atmung, purulentem Nasenausfluss oder hochgradig veränderten Mandibularlymphknoten zeigten, wurden antibakteriell therapiert.

Diese Therapie umfasste die Gabe von Azithromycin (10 mg/kg KGW, p.o., einmal täglich) in Kombination mit Rifampicin (10 mg/kg KGW, p.o., einmal täglich) über sechs Wochen. Die Behandlung wurde nach sechs Wochen beendet, wenn die sonografische Untersuchung der Fohlenlunge keine Abszesse oder Pneumonien

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mehr zeigte und die Fohlen klinisch frei von mittel- oder hochgradigen Symptomen einer Pneumonie waren.

3.4 Evaluierung der humoralen und zellulären Immunantwort auf den Impfstoff

3.4.1 Bestimmung des Antikörpertiters im Serum

Der Antikörpertiter (IgG) der Fohlen gegen R. equi-Zellextrakt wurde mittels ELISA in den Serumproben der Fohlen bestimmt. Die Untersuchungen wurden von der Firma MSD (Boxmeer, NL) durchgeführt. Dazu wurden zunächst die Löcher einer 96-Loch- Mikrotiterplatte mit Flachboden mit je 150 µl der Antigenlösung befüllt und abgedeckt bei 37°C für 16–24 Stunden inkubiert. Die Antigenlösung enthält Zellwandextrakt des virulenten R. equi-Stammes 85F, welches in PBS gelöst ist. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte dreimal mit Waschpuffer (PBS + 0,05% Polysorbat 20 als Emulgator) gewaschen, wobei der flüssige Inhalt nach jedem Schritt aspiriert wurde. Daraufhin wurde in alle Löcher 100 µl ELISA-Puffer (EIA-Puffer + 0,05% Polysorbat 80) pipettiert.

Nun wurde in den Reihen A bis G der Mikrotiterplatte mit dem zu testenden Fohlenserum jeweils eine 1:2-Verdünnungsreihe in zehn Schritten hergestellt. Dazu wurden zunächst 100 µl Testserum in Spalte eins hinzugefügt und gemischt, und dann jeweils 100 µl zum nächsten Loch überführt. Schließlich wurden in Spalte zehn 100 µl verworfen. In der Reihe H der Mikrotiterplatte wurde wie beschrieben eine 1:2 Verdünnungsreihe in zehn Schritten mit einem Standardserum (positives, gemischtes Pferdeserum) hergestellt. Aus dem letzten Loch der Standardserumreihe (H10) wurden nun 100 µl nach A11 pipettiert, woraus eine 1:2-Verdünnungsreihe in acht Schritten vertikal in Spalte 11 erstellt wurde. In Spalte 12 blieb nur der ELISA – Puffer als Negativkontrolle in den Löchern der Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplattenanordnung zur Antikörpertiter-Bestimmung wird in Tabelle 1 dargestellt.

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Tab. 1: Mikrotiterplattenanordnung des ELISAs zur Antikörpertiter-Bestimmung aus dem Fohlenserum. Pro Mikrotiterplatte können sieben Proben gemessen werden.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 Std ELISA 1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹⁰ Puffer B F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 Std ELISA

1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹¹ Puffer C F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 Std ELISA

1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹² Puffer D F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 Std ELISA

1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹³ Puffer E F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 Std ELISA

1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹⁴ Puffer F F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 Std ELISA

1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹⁵ Puffer G F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 Std ELISA

1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹⁶ Puffer H Std Std Std Std Std Std Std Std Std Std Std ELISA

1:2⁰ 1:2¹ 1:2² 1:2³ 1:2⁴ 1:2⁵ 1:2⁶ 1:2⁷ 1:2⁸ 1:2⁹ 1:2¹⁷ Puffer F = Fohlen (gilt als Einzelprobe); Std = Standardserum (positives, gemischtes Pferdeserum)

Die Mikrotiterplatte wurde anschließend abgedeckt und sofort 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurde die Mikrotiterplatte dreimal mit Waschpuffer (PBS + 0,05%

Polysorbat 20 als Emulgator) gewaschen, wobei der flüssige Inhalt nach jedem Schritt aspiriert wurde. Dann wurden alle Löcher der Platte mit 100 µl HRP-rec Protein G Konjugat (Invitrogen™, Camarillo, CA, USA), welches 22000fach in ELISA- Puffer verdünnt wurde, versetzt und für 30 Minuten bei 37°C abgedeckt inkubiert.

Nun wurde die Mikrotiterplatte wiederholt dreimal mit Waschpuffer (PBS + 0,05%

Polysorbat 20 als Emulgator) gewaschen, wobei der flüssige Inhalt nach jedem Schritt aspiriert wurde.

Die Löcher der Mikrotiterplatte wurden dann mit jeweils 100 µl der Substratlösung befüllt und lichtdicht abgedeckt bei Raumtemperatur für zehn Minuten inkubiert. Die Substratlösung enthält 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine, welches als Substrat der