Genotypisierung von Rhodococcus equi Stämmen aus Deutschland, isoliert bei Fohlen und anderen Tierarten

Tierärztliche Hochschule Hannover

Genotypisierung von Rhodococcus equi Stämmen aus Deutschland, isoliert bei Fohlen

und anderen Tierarten

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet)

vorgelegt von Claudia Hagist

Waldshut

Hannover 2016

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Monica Venner, PhD

Klinik für Pferde, Tierärztliche Hochschule Hannover

1.Gutachterin: PD Dr. Monica Venner, PhD

2.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Goethe

Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2016

Gewidmet aus Liebe und Dankbarkeit meiner Familie.

In Gedenken an meinen Großvater.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 11

2 Literaturübersicht ... 13

2.1 Rhodococcus equi ... 13

2.1.1 Vorkommen und Bedeutung ... 13

2.1.2 Morphologie und Kultivierung von R. equi ... 15

2.2 Epidemiologie und Pathogenese der R. equi-Pneumonie ... 16

2.2.1 Diagnose einer R. equi-Pneumonie ... 18

2.2.2 Indirekter Nachweis von R. equi ... 18

2.2.3 Direkter Nachweis von R. equi ... 19

2.2.4 Bildgebende Diagnose einer R. equi-Pneumonie ... 21

23 Therapie einer R. equi-Pneumonie ... 22

2.4 Pathogenität von R. equi: Die Virulenzfaktoren... 22

2.4.1 Genotypisierung anhand des Plasmides ... 24

3 Material und Methoden ... 31

3.1 Haltungsbedingungen der Fohlen ... 31

3.2 Probanden ... 31

3.2.1 Allgemeinuntersuchung ... 31

3.2.2 Spezielle Untersuchung ... 32

3.2.3 Ultrasonographische Untersuchung ... 34

3.2.4 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie ... 34

3.3 Probenentnahme ... 34

3.3.1 Gewinnung von Bodenproben... 35

3.4 Mikrobiologische Untersuchung der Proben ... 35

3.5 Genotypisierung der R. equi-Isolate ... 35

3.5.1 Nachweis VapA-Gen ... 36

3.5.2 Nachweis VapB-Gen ... 37

3.5.3 Plasmidisolierung ... 37

3.5.4 Restriktionsverdau des Plasmids ... 38

3.5.5 PCR Genotypisierung ... 39

3.5.6 Pulsfeldgelelektrophorese ... 40

4 Ergebnisse ... 44

4.1 Ergebnis der Untersuchung der gestütsinternen Proben ... 45

4.1.1 Allgemeine Angaben zu den Probanden ... 45

4.1.2 Ergebnis der klinischen-, hämatologischen- und sonographischen Untersuchung der gestütseigenen Fohlen ... 46

4.1.3 Nachweis von R. equi aus Tracheobronchialsekret der gestütsinternen Proben ... 49

4.2 Nachweis von R. equi aus Bodenproben ... 51

4.3 Übersicht über die externen Proben ... 52

4.4 Ergebnis der Plasmidisolierung... 56

4.5 Ergebnis des VapA- und VapB-Nachweis ... 58

4.6 Nachweis kryptischer Plasmide bei den externen Proben und den Bodenproben ... 59

4.7 Bestimmung des Genotyps der R. equi-Isolate ... 60

4.8 Ergebnis der PCR-Genotypisierung ... 64

4.9 Ergebnis der PFGE ... 66

5 Diskussion ... 70

5.1 Gestütsinterne Probanden ... 70

5.2 Probenentnahme ... 70

5.3 Ergebnisse ... 71

5.3.1 Nachweisrate von R. equi bei den gestütsinternen Proben ... 71

5.3.2 Externe Isolate ... 73

5.3.3 Plasmidisolierung ... 73

5.3.4 VapA–Nachweis ... 74

5.3.5 Kryptischen Plasmide ... 75

5.3.6 Genotypen ... 75

5.3.7 Pulsotypen ... 78

6 Zusammenfassung ... 80

7 Summary ... 82

8 Literatur ... 84

9 Anhänge ... 102

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Aqua dest. Aqua destillata

bp Basenpaar

d.h. das heißt

DNS Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzyme-linked immunosorbent Assay

g Gramm

ggr geringgradig

h Stunden

hgr. hochgradig

HIV Humanes Immundefizienz-Virus

JLU Justus-Liebig Universität

Kb Kilo Basenpaar

kDA Kilo Dalton

KGW Körpergewicht

LD 50 mittlere letale Dosis

Lnn. Lymphonodi

M. Musculus

mgr mittelgradig

min Minuten

ml Milliliter

mm Millimeter

[N] Anzahl

nU nicht Untersucht

o.b.B ohne besonderen Befund

OD optische Dichte

PCR Polymerase Kettenreaktion

PFGE Pulsfeldgelelektrophorese R. equi Rhodococcus equi

rpm rounds per minute

sec Sekunden

Tab. Tabelle

TAE Puffer Tris-Acetat-EDTA Puffer

TBS Tracheobronchialsekret

TE Puffer Tris-EDTA Puffer

TiHo Tierärztliche Hochschule

UV Ultraviolett

V Venae

VAP virulenz assoziertes Protein

% Prozent

♂ männlich

♀ weiblich

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1 Einleitung

Atemwegs- und Durchfallerkrankungen führen in der Aufzucht von Tieren immer wieder zu erheblichen Verlusten. Bei der Fohlenaufzucht sind Viren wie z.B.

Influenza und Herpes, sowie Bakterien wie Streptokokken, Klebsiellen, Pasteurellen, Actinobacillus und Rhodokokken die Hauptursachen für Atemwegserkrankungen.

Rhodococcus equi (R. equi) als Erreger von Bronchopneumonie und pyogranulomatösen Entzündungen bei Fohlen spielt hier eine wichtige Rolle. Das Bakterium verursacht aufgrund seiner hohen Morbidität und Mortalität wirtschaftliche Verluste und führt ohne Behandlung häufig zum Tod der Fohlen.

R. equi wurde erstmals 1923 aus der Lunge eines Fohlens in Schweden isoliert. Das Bakterium zeigte sich als ein unbewegliches, grampositives und pleomorphes Bakterium, dem die Fähigkeit zur Sporenbildung fehlt. Aufgrund dessen wurde es den Corynebakterien zugeordnet und als Corynebacterium equi bezeichnet (M^AGNUSSON 1923). Aufgrund verbesserter Untersuchungsmethoden konnte eine phylogenetisch enge Beziehung zu Mykobakterien hergestellt werden. Weshalb das Bakterium in Mykobacterium equi umbenannt wurde.

Später wurden in der Zellwand des Bakteriums N-glykolierte Muraminreste nachgewiesen. Diese wurden bisher nur bei Mykobakterien, Nokardien und Rhodokokken festgestellt. Aufgrund dieser Erkenntnis und der unterschiedlichen Morphologie, von rund bis stäbchenförmig, wurde das Bakterium 1977 durch GOODFELLOW u. ALDERSON (1977) zu Rhodococcus equi umbenannt.

R. equi ist in vielen Boden- und Kotproben nachweisbar, weshalb es zu den ubiquitär vorkommenden Bakterien zählt. Auch bei Hitze und Trockenheit überlebt das Bakterium im Erdboden. Der Erreger tritt endemisch auf manchen Gestüten auf und sorgt dort für eine Morbidität von 5% bis 17% und einer Mortalität von 40% bis 80%.

Eine R. equi-Pneumonie verläuft meist subklinisch und wird aufgrund dessen von den Besitzern bzw. Betreuern der Fohlen erst spät erkannt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Veränderungen in der Lunge bereits weit fortgeschritten und eine Therapie wird zunehmend schwieriger. Deshalb empfiehlt sich, auf Gestüten auf denen R. equi endemisch auftritt, die Fohlen mit Hilfe eines Früherkennungsprogramms zu überwachen. Dadurch können erkrankte Fohlen deutlich früher erkannt und somit

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rechtzeitig therapiert werden. Die Behandlung der R. equi-Pneumonie dauert vier bis sechs Wochen. Standardmäßig wird mit einer Kombination aus Rifampicin und Azithromycin behandelt.

R. equi ist ein Erreger, der nicht nur bei Fohlen nachgewiesen wurde. Er konnte auch aus Proben von Fleischfresser, Schweinen, Rindern, Ziegen und auch Wildtieren isoliert werden. Zusätzlich kommt es immer wieder zu Erkrankungen bei immunsupprimierten Menschen verursacht durch R. equi. Jedoch nicht bei allen erwähnten Wirten kommt es zu Krankheitserscheinungen, da nicht immer eine Infektion mit einem virulenten R. equi-Stamm vorliegt. Es wurden virulente, schwach- virulente und avirulente Stämme isoliert. Des Weiteren konnten Unterschiede in der weltweiten Verbreitung der unterschiedlichen Genotypen von virulenten R. equi Stämmen festgestellt werden. Aus diesem Grund befasst sich die vorliegende Studie damit herauszufinden, welche Genotypen bei Fohlen in Deutschland derzeit nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde untersucht welche Genotypen bei einigen anderen Tierarten vorkommen.

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2 Literaturübersicht

2.1.1 Vorkommen und Bedeutung

Rhodococcus equi (R. equi) ist ein weltweit ubiquitär auftretender aerober, gram positiver Bodensaprophyt (B^ARTON u. H^UGHES 1982, T^AKAI et al. 1986a, P^RESCOTT 1987, M^USCATELLO et al. 2006). Er gehört zu den bedeutendsten Krankheitserregern bei Fohlen im Alter von 1-6 Monaten. Die meisten Fohlen erkranken an einer R. equi- Pneumonie im Alter zwischen 31–60 Tagen, in einer Studie war das jüngste erkrankte Fohlen 16 Tage alt, das Älteste 158 Tage (MUSCATELLO et al. 2006).

Das Bakterium R. equi verursacht häufig pyogranulomatöse Pneumonien und seltener ulzerative Enterokolitis, mesenteriale Lymphadenopathien, immunvermittelte Synovitis, Uveitis, Osteomyelitis und septische Arthritis (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Erwachsene Pferde erkranken selten an einer R. equi Infektion (ZINK et al. 1986, GIGUÈRE 2001).

Doch nicht nur beim Fohlen kann R. equi nachgewiesen werden. Das Bakterium konnte auch mehrfach beim Hausschwein (Sus scrofa domestica) isoliert werden (TAKAI et al. 1996b). Da in den bisher durchgeführten Studien R. equi bei gesunden, frisch geschlachteten Schweinen isoliert werden konnte, ist für diese Tierart noch kein Krankheitszusammenhang bekannt (TAKAI et al. 1996b, MAKRAI et al. 2005b). In Japan wurden 1.823 submandibular Lymphknoten von Schweinen untersucht. Bei 3,1% konnte R. equi isoliert werden (TAKAI et al. 1996b). In Ungarn wurden ebenfalls 1.173 gesunde, frisch geschlachtete Schweine untersucht. Bei 164 (14%) der untersuchten Tiere wurden Rhodokokken nachgewiesen (M^AKRAI et al. 2005b).

In weiteren verschiedenen Studien wurde das Vorkommen von R. equi auch bei Wildtieren belegt (M^AKRAI et al. 2008, S^AKAI et al. 2012, R^ZEWUSKA et al. 2014, WITKOWSKI et al. 2015). Kürzlich wurde eine Arbeit aus Polen veröffentlicht (RZEWUSKA et al. 2014), bei der 936 Lymphknoten, darunter 452 von Wildschweinen (Sus scrofa), 272 von Rothirschen (Cervus elaphus) und 212 von Rehen (Capreolus capreolus) untersucht wurden. Es konnte im Rahmen dieser Studie insgesamt 27mal R. equi aus Lymphknoten, welche keine pathologischen Veränderungen aufwiesen, isoliert werden. Darunter waren 23 Isolate vom Wildschwein und jeweils zwei Isolate

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von Rothirschen und Rehen. Durch diese Studie konnte die Annahme bestätig werden, dass R. equi auch in Lymphknoten von gesund erscheinenden Wildtieren auftritt (RZEWUSKA et al. 2014, WITKOWSKI et al. 2015).

Seit 1983 steigt die Anzahl an beobachteten Fällen von R. equi Infektionen beim Menschen. Das Bakterium verursacht hier ebenfalls Pneumonien, Enteritiden und regionale Adenitiden mit Abszessbildung. Zusätzlich kann es außerdem zu Wundkontaminationen durch R. equi kommen. Das Bakterium wird vermehrt bei immunsupprimierten Menschen, z.B. nach einer Organtransplantation oder solchen, die mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) infiziert sind, nachgewiesen.

Allerdings gibt es auch Fälle bei immunkompetenten Menschen (VERVILLE et al. 1994). Die Mortalität liegt bei immunkompetenten Menschen bei 11%, bei immunsupprimierten, die mit HIV infiziert sind, bei 50%-55% und bei Menschen, die aus anderen Gründen ein geschwächtes Immunsystem aufweisen, liegt die Mortalität bei 20%-25% (K^EDLAYA et al. 2001).

Auch das Vorkommen von R. equi bei Hunden und Katzen wurde untersucht.

Bei Fleischfressern verursacht R. equi seltener Infektionen der Lunge, häufiger kann der Erreger bei diesen Tieren in Wundinfektionen, subkutanen Abszessen, bei Vaginitis, Hepatitis, Osteomyelitis, Myositis und Arthritis nachgewiesen werden (TAKAI et al. 2003a).

Der Nachweis von R. equi gelang ebenfalls bei Rindern. Für das Rind ist das Bakterium nur von geringer Pathogenität und verursacht Granulome der Lymphknoten. 2001 wurden 3.263.622 Rinder in Irland auf R. equi untersucht. Davon wiesen 6.719 Stück Veränderungen an den Retropharyngeal-, Bronchial- und Mediastinal-Lymphknoten auf. Insgesamt wurden 264 der untersuchten Tiere positiv auf R. equi getestet (FLYNN et al. 2001).

Bei Ziegen gibt es ebenfalls nachgewiesene Fälle von Rhodokokkose (DAVIS et al.

1999, JECKEL et al. 2011). In einer Studie von DAVIS et al. (1999) wurden zwei Ziegen untersucht. Beide Tiere wiesen in der Obduktion Granulome in der Leber auf. Bei einer der Ziegen wurden außerdem zusätzliche Veränderungen in der Lunge und den Lymphknoten festgestellt. Mikroskopisch konnten grampositive Bakterien in den Makrophagen dargestellt werden. Abschließend wurde R. equi kulturell angezüchtet.

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2.1.2 Morphologie und Kultivierung von R. equi

Taxonomisch gehört R. equi zu der Familie der Nocardiaceae, in die Ordnung der Actinomycetales. Bei R. equi handelt es sich um ein Bakterium, welches sich in der Gramfärbung blau anfärbt, und somit den grampositiven Bakterien zugeordnet wird.

Selten kann es vorkommen, dass sich die Bakterien gramlabil verhalten, d.h. sie färben sich nicht wie gewöhnlich blau, sondern wie gramnegative Bakterien rot an.

R. equi gehört zu den partiell säurefesten Bakterien, da ihre Zellwand aus Mykolsäuren besteht. Mykolsäure ist eine langkettige, verzweigte Fettsäure, die dazu führt, dass sich die Zelle stark hydrophob verhält (SELBITZ et al. 2013).

Unter dem Mikroskop stellt sich der Erreger zuerst als ein kokkoides, unbewegliches Stäbchen dar. Später kommt es zur Ausbildung von Filamenten und hyphenartigen Gebilden, die nach einiger Zeit wieder zerfallen (S^ELBITZ et al. 2013). Das Bakterium ist obligat aerob und stellt an sein Nährmedium keine besonderen Ansprüche.

R. equi wächst allerdings im Verhältnis zu anderen Bakterien langsamer und wird deshalb leicht von diesen überwuchert.

R. equi wird aufgrund seiner Fähigkeit ein rotes Pigment zu bilden, als Rhodokokkus (setzt sich aus den griechischen Wörtern rhodon=Rose und kokkus=Beere zusammen) bezeichnet. Dieses Pigment tritt eventuell erst nach 4-7 Tagen der Kultivierung auf und lässt die Kolonien lachsfarben erscheinen. Die typische R. equi Kolonie ist unregelmäßig rund, semitransparent, mucoid, ihre Oberfläche ist glatt und glänzend. R. equi kommt fakultativ intrazellulär vor und vermehrt sich bevorzugt in Makrophagen (HIETALA u. ARDANS 1987, ZINK et al. 1987, HONDALUS u. MOSSER

1994). Das pH-Optimum für diesen Erreger liegt bei pH 7,5. Es kann jedoch auch ein Wachstum im Bereich von einem pH 6-8,5 festgestellt werden (HUGHES u. SULAIMAN 1987, TAKAI et al. 1994b). Der Temperaturbereich, in dem ein Wachstum des Bakteriums möglich ist, reicht von 10°-40°C. Das Optimum liegt bei 30°C (WALSH et al. 1993). Nach Versuchen bei denen Makrophagen mit R. equi infiziert wurden, konnte gezeigt werden, dass es zu einer 6h-12h dauernden Lag-Phase kommt, in der keine Vermehrung der Bakterien stattfindet.

In den nachfolgenden 12h-48h verfünffacht sich die Anzahl der Rhodokokken in den Makrophagen (HONDALUS u. MOSSER 1994).

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2.2 Epidemiologie und Pathogenese der R. equi-Pneumonie

Eine Infektion mit R. equi erfolgt hauptsächlich über Inhalation von infiziertem Staub (G^IGUÈRE u. P^RESCOTT 1997, M^USCATELLO et al. 2006). Es wurde gezeigt, dass das Bakterium in oberflächlichen Erdschichten vermehrt vorkommt und mit zunehmender Tiefe der Bodenprobe die Menge an R. equi abnimmt (T^AKAI et al. 1986a). Außerdem wurde nachgewiesen, dass die Kontamination der Luft mit R. equi an trockenen und windigen Tagen erhöht ist (TAKAI et al. 1987).

R. equi wird aus dem Erdboden und aus Kot von vielen verschiedenen Tierarten isoliert (B^ARTON u. H^UGHES 1981, T^AKAI et al. 1986a). Um R. equi aus Kot zu isolieren wird bevorzugt das NANAT-Medium (Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit) verwendet. Mit diesem Medium gelang der Nachweis von R. equi aus Kot von nicht erkrankten Pferden (WOOLCOCK et al. 1979, MAKRAI et al. 2005a). Allerdings ist das Wachstum von R. equi auf diesem Medium schwächer wie z.B. auf dem Tinsdale Medium, welches wiederum eine schwach selektive Wirkung hat. In einer Studie zum Vergleich verschiedener Wachstumsmedien schnitten das CAZ-NB bestehend aus Ceftazidim, Novobiocin und Cycloheximid und das TCP Medium bestehend aus Trimethoprim, Cefaperazone, Polymyxin B, Cycloheximide und Kaliumtellurit am besten ab. Auf diesen Medien wuchs 62%-72% der R. equi Kolonien aus zuvor künstlich mit R. equi kontaminierten Proben. Zusätzlich war die hemmende Wirkung auf andere Bakterien und Pilze zufriedenstellend (MAKRAI et al. 2005a). Allerdings gelingt die Anzucht von R. equi auch auf klassischen Nährmedien sowohl aus dem Kot, als auch aus dem Tracheobronchialsekret (TBS) von gesunden, erkrankten und auch von Fohlen, welche antibiotisch behandelt werden (L^ÄMMER 2010).

Im Jahr 1986 wurde der Beweis erbracht, dass R. equi fähig ist, sich im Erdboden zu vermehren (T^AKAI et al. 1986a). Diese Erkenntnis brachte die Diskussion über den Lebensraum von R. equi weitgehend zum Erliegen. Ursprünglich wurde darüber diskutiert, ob R. equi ein Bewohner des Erdbodens oder des Intestinaltraktes des Pferdes ist, da das Bakterium sowohl aus dem Kot, wie auch aus dem Erdboden isoliert wurde (NAKAZAWA et al. 1983). Mittlerweile wird davon ausgegangen, dass es beim Pferd durch abschlucken von infiziertem Sputum zu einer Besiedlung des Darms kommt (JOHNSON et al. 1983). Jedoch beginnt die Besiedlung des Intestinaltraktes der Fohlen durch R. equi bereits in der ersten Lebenswoche.

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Die Fohlen nehmen die Bakterien oral aus ihrer Umgebung auf. Bereits in der dritten Lebenswoche ist die Keimbelastung durch R. equi auf 10⁴ Keime/g Kot gestiegen, nach der achten Lebenswoche nimmt der Gehalt an R. equi im Kot wieder ab, bis er dann stagniert (TAKAI et al. 1986b). Zusätzlich wird die Theorie, dass R. equi ein Bewohner des Erdbodens ist, durch eine Studie unterstützt in der nachgewiesen wurde, dass die Keimdichte von R. equi im Erdboden höher ist als im Kot (PRESCOTT et al. 1984).

Aufgrund der Besiedlung des Darms von infizierten Pferden, kommt es zu einer stärkeren Kontamination der Umgebung mit virulenten Stämmen von R. equi. Es wurde festgestellt, dass auf Gestüten mit einem endemischen Rhodokokken Vorkommen, vermehrt virulente R. equi aus dem Erdboden isoliert werden. Im Gegensatz dazu konnten auf Betrieben ohne endemische R. equi-Pneumonie nur geringe Mengen an virulenten Bakterien nachgewiesen werden (TAKAI et al. 1991a). Die Besiedlung des Darms trägt dazu bei, dass R. equi im Erdboden und in der Umgebung von Pferden stark verbreitet ist. Dies veranschaulicht eine Studie bei der aus Spinnweben in einem Stallgebäude R. equi isoliert werden konnte (SMITH u. ROBINSON 1981).

Die Infektion der Fohlen erfolgt über die Inhalation von kontaminiertem Staub und der oralen Aufnahme von R. equi (C^OHEN et al. 2013). Infolge dessen werden die Bakterien durch das körpereigene zelluläre Immunsystem erkannt und phagozytiert.

Dabei besitzt R. equi die Fähigkeit, in Makrophagen zu persistieren und sich zu replizieren (Z^INK et al. 1987). Der Grund dafür liegt darin, dass R. equi die Phagosomen-Lysosomen Fusion in den Makrophagen blockiert (HIETALA u. ARDANS 1987, YAGER 1987, ZINK et al. 1987), dadurch wird der enzymatische Abbau von R. equi verhindert. Makrophagen, die R. equi aufgenommen haben, sind irreversibel geschädigt und geben Bakterien infolge des Zelltodes an ihre Umgebung ab (ZINK et al. 1987).

Aus dem Zelltod der infizierten Makrophagen resultiert eine Gewebsnekrose des umliegenden Gewebes, die zu den für R. equi charakteristischen fokalen granulomatösen Pneumonien führt. Für eine Studie wurden sechs Fohlen intrabronchial mit R. equi infiziert. Bei der später durchgeführten Obduktion waren die Lungenalveolen mit Makrophagen, neutrophilen Ganulozyten und Riesenzellen

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gefüllt. In den meisten der phagozytierenden Abwehrzellen konnte R. equi nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde eine hyperplastische Bronchiolitis, Lungenödem und pyogranulomatöse Lymphadenitis in den bronchialen Lymphknoten festgestellt (JOHNSON et al. 1983). Dieses Bild der pathologischen und histologischen Veränderungen entspricht dem der natürlichen Pneumonie mit R. equi (SMITH u.

ROBINSON 1981,PRESCOTT 1991, WEIMAR 2006).

2.2.1 Diagnose einer R. equi-Pneumonie

Die Früherkennung der R. equi-Pneumonie ist schwierig, da es keine pathognomonischen Anzeichen für eine Erkrankung gibt. Jedoch ist eine frühe Diagnose für die spätere Therapie sehr wichtig. Erste klinische Anzeichen können eine leichte Erhöhung der Atemfrequenz sein, die eventuell mit leichtem Fieber einhergeht. Im weiteren Verlauf äußert sich die Erkrankung mit vermindertem Appetit, leichter Lethargie, Fieber, evtl. zeigen die Tiere eine Tachypnoe, geblähte Nüstern und eine vermehrte abdominale Atmung. Nasenausfluss und Husten werden nicht bei allen betroffenen Fohlen beobachtet (G^IGUÈRE u. P^RESCOTT 1997). Diese klinischen Anzeichen sind wenig spezifisch und werden bei vielen bakteriellen und viralen Infektionen beobachtet.

2.2.2 Indirekter Nachweis von R. equi 2.2.2.1 Hämatologie

Eine Leukozytose tritt zwar bei Fohlen, die unter einer R. equi-Pneumonie leiden, häufig auf, aber nicht bei allen Patienten, so dass die diagnostische Hilfe als mäßig einzustufen ist (FALCON et al. 1985, SWEENEY et al. 1987, GIGUÈRE et al. 2003a).

Für die Zahl der Blutleukozyten bei einem Cut-off von 13.000 Zellen/µl liegt die Sensitivität bei 95,2% und die Spezifität nur bei 61,2% (GIGUÈRE et al. 2003a).

19 2.2.2.2 Serologie

Für die Diagnose einer R. equi-Pneumonie mit Hilfe von serologischen Parametern stehen drei Tests zur Verfügung. Ein Agargel-Immunodiffusionstest, ein synergistischer Hämolyse Inhibitionstest und Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA). Problematisch bei den serologischen Nachweismethoden ist, dass aufgrund der starken Verbreitung von R. equi bereits Antikörper dem Fohlen über das Kolostrum vermittelt oder Antikörper durch das Fohlen selbst gebildet werden, bevor eine Erkrankung vorliegt. Die Schlussfolgerung einer Studie die mehrere Methoden vergleichend analysiert hat ist, dass die derzeit zur Verfügung stehend Tests nicht zwischen klinisch erkrankten und gesunden Fohlen unterscheiden können (GIGUÈRE et al. 2003b).

2.2.3 Direkter Nachweis von R. equi

2.2.3.1 Zytologische und kulturelle Nachweise

Mikrobiologische Kulturen und zytologische Analysen aus Tracheobronchialaspiraten sind die Standardverfahren zum Nachweis von R. equi. Nachteil der mikrobiologischen Kultur ist, dass 72h vergehen, bis eine genaue Identifikation der Keime durchgeführt werden kann. Aufgrund dessen, ist die Therapie der Fohlen durch den behandelnden Tierarzt bereits eingeleitet, bevor eine genaue Bestimmung der Keime und ein Antibiogramm vorliegen. Ein weiterer Nachteil ist, dass Fohlen die bereits eine Dyspnoe zeigen, die Entnahme des Tracheobronchialsekrets (TBS) schlecht dulden (LECLERE et al. 2011) und dass es je nach Entnahmemethode zu einer Kontamination der Proben durch Bakterien der Nasenschleimhaut kommen kann. Allerdings ist eine Entnahme über einen Endoskop, welches über den ventralen Nasengang eingeführt wird, wenig invasiv und da der Katheter in das Endoskop zurück gezogen werden kann, ist die Kontamination eher gering (HASHIKURA et al. 2000). Wohingegen eine Entnahme über eine perkutane Punktion der Trachea mit einem gewissen Infektionsrisiko der Punktionsstelle behaftet ist (HASHIKURA et al. 2000). Zusätzlich kann bei einer perkutanen Punktion der Trachea nicht das Aussehen der Trachea, der Bifurkation und die Menge des vorhandenen Mucus beurteilt werden. Ein weiteres Problem der kulturellen Diagnose ist, dass nicht in allen entnommenen Proben Rhodokokken nachgewiesen werden können, obwohl im Thorax-Röntgen/-Ultraschall entsprechende Veränderungen darstellbar sind oder

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in einer Obduktion des gleichen Tieres R. equi nachgewiesen wurde (MARTENS et al. 1982, HILLIDGE 1987, SWEENEY et al. 1987). Es gelang der kulturelle Nachweis von R. equi aus TBS bei 64% der untersuchten Fohlen im Alter von 1-4 Monaten mit röntgenologischen Befunden (HILLIDGE 1987). In einer weiteren Studie konnte ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Dabei gelang zytologisch der Nachweis von R. equi bei 61% der entnommenen TBS-Proben von erkrankten Fohlen (SWEENEY et al. 1987). Im Rahmen einer Dissertation wurden 217 Fohlen mit Befunden, in einer Ultraschalluntersuchung des Thorax beprobt. Es wurden von jedem Fohlen sowohl Nasentupfer wie auch Tracheobronchialsekret-Proben entnommen und kulturell untersucht. Dabei konnte R. equi bei 54% der Tracheobronchialsekrete isoliert werden. Wohingegen bei den gleichen Tieren nur 24% der Nasentupfer positiv auf R. equi getestet wurden. Daraus kann man schließen, dass Nasentupfer zur Diagnose von R. equi nicht geeignet sind (M^EYER-H^AMME 2004). Es gibt verschiedene mögliche Ursachen für den nicht 100%igen Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret. Grund dafür ist zum einen, dass R. equi nur intermittierend im Tracheobronchialsekret vorhanden ist und zum anderen, dass der Erreger aufgrund seines langsamen Wachstums von anderen Bakterien überwuchert wird. Aus diesem Grund bietet sich die Verwendung von Selektivmedien an, die das Wachstum der anderen Bakterien hemmen (W^OOLCOCK et al. 1979, M^AKRAI et al. 2005a). Deshalb sollte man nicht nur anhand eines Parameters die Diagnose einer R. equi-Pneumonie stellen, sondern immer eine Kombination einer kulturellen und zytologischen Untersuchung der Tracheobronchialsekretes vornehmen. Zusätzlich sollte man auch Blutlaborparameter und die klinische Untersuchung der Tiere mit einbeziehen.

R. equi wird anschließend an die kulturelle Anzucht charakterisiert über positive Tests auf Katalase, Urease, Lipase und Phosphatase. Tests auf Oxidase, DNA´se, Elastase, Lecithinase und Protease fallen hingegen negativ aus (MUTIMER u. WOOLCOCK 1983). Bei einer mikrobiologischen Kultur geht man von einer Spezifität von 93,8% und einer Sensitivität von 57,1% aus (SELLON et al. 2001, WEIMAR 2006).

21 2.2.3.2 Molekularbiologischer Nachweis

Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ist eine heutzutage gängige in vitro Methode, bei der eine spezifische DNS-Sequenz vermehrt wird. Der Vorteile einer PCR liegt in der Möglichkeit auch bereits tote Bakterien nachzuweisen. Zusätzlich erhält man die Ergebnisse schneller, als bei einem kulturellen Nachweis von R. equi (SELLON et al. 2001). Ein Nachweis von R. equi über eine PCR hat eine Sensitivität von 27% (VapA-PCR) bis hin zu 70% (aceA PCR) (VENNER et al. 2007a).

Die Spezifität liegt zwischen 98%-100%. Dennoch ist die Sensitivität zu niedrig und somit ist der kulturellen Nachweis von R. equi, dem Nachweis mittels PCR vorzuziehen. Ein Problem der PCR ist, dass die Proben mindestens eine Genomäquivalenz von 10³-10⁴ pro Gramm enthalten müssen, damit genügend DNS im PCR Ansatz vorhanden ist. Ein weiteres Problem wird durch das Probenmaterial selbst verursacht, da es eine visköse Probenmatrix aufweist. Ein weiterer Nachteil einer PCR ist, dass es nicht möglich ist eine Aussage über das Resistenzverhalten des Erregers zu treffen (V^ENNER et al. 2007a).

2.2.4 Bildgebende Diagnose einer R. equi-Pneumonie

Das bildgebende Standardverfahren, zur Diagnose einer R. equi-Pneumonie, ist die röntgenologische Untersuchung. Allerdings ist es relativ schwierig, von einem Fohlen, ein gut auswertbares Röntgenbild der Lunge zu erstellen. In einer Studie mit 65 Fohlen mussten 6-10 Röntgenbilder pro Seite angefertigt werden, bis ein auswertbares Bild entstand. Dies ist sehr kosten- und zeitaufwendig (WALTHER 2006). Beim Vergleich der röntgenologischen und ultrasonographischen Untersuchung des Thoraxes von gesunden und an R. equi-Pneumonie erkrankten Fohlen wurde gezeigt, dass die ultrasonographische Untersuchung der Lunge nicht nur eine gute Alternative zur röntgenologischen Untersuchung darstellt, sondern durch eine höhere Nachweißrate von fokalen Verdichtungen (Lungenabszessen) ihr überlegen ist (RAMIREZ et al. 2004, WALTHER 2006, VENNER et al. 2014).

Die Lokalisation der Abszesse kann genauer bestimmt und einer Seite zugeordnet werden (RAMIREZ et al. 2004), was bei einer röntgenologischen Untersuchung im latero-lateralen Strahlengang nicht möglich ist (LESTER u.LESTER 2001). Ein Nachteil der ultrasonographischen Untersuchung allerdings ist, dass nur Pleura nahe Veränderungen festgestellt werden können (G^IGUÈRE u. P^RESCOTT 1997).

22 2.3 Therapie einer R. equi-Pneumonie

Die Therapie der R. equi-Pneumonie ist zeitaufwendig und relative teuer. Darüber hinaus ist eine rechtzeitige Behandlung der Erkrankung essentiell für das Überleben der Tiere. Für die Therapie von R. equi-Pneumonien ist es notwendig ein Antibiotikum einzusetzen, welches eine ausreichende Konzentration im Lungengewebe erreicht und zusätzlich in die verkäsenden Abszesse vordringen und die Bakterien die intrazelluär in den neutrophilen Granulozyten und Makrophagen leben, erreicht. Dazu muss das Antibiotikum lipidlöslich sein.

Deshalb besteht die Standard-Therapie der R. equi-Pneumonie aus der Kombination von lipophilen Wirkstoffen wie Rifampicin mit einem Makrolid-Antibiotikum. Makrolide sind lipidlöslich und reichern sich in Makrophagen und Neutrophilen an (PROKESCH u. HAND 1982). Die Kombination aus Rifampicin und einem Makrolid ist synergistisch wirksam und reduziert die Gefahr einer Resistenzbildung (NORDMANN u. RONCO 1992). Clarithromycin (ein semi-synthetisches Derivat von Erythromycin) und Azithromycin (ein Azalid-Antibiotikum) können beide in Kombination mit Rifampicin eingesetzt werden. Sie zeichnen sich durch eine gute orale Verfügbarkeit, eine lange Halbwertszeit im Körper und eine hohe Konzentration im Gewebe und den phagozytierenden Zellen aus. Aufgrund der langen Halbwertszeit von 20,3h für Azithromycin (JACKS et al. 2001), muss dieses Medikamente nur einmal am Tag verabreicht werden (J^ACKS et al. 2001, D^AVIS et al.1999, 2002, W^OMBLE et al. 2006).

2.4 Pathogenität von R. equi: Die Virulenzfaktoren

Es konnten bisher virulente, schwach-virulente und avirulente R. equi Stämme nachgewiesen werden. Der Unterschied in der Virulenz der drei Stämme liegt im Vorhandensein und der Größe des Plasmids in den Bakterien. Alle virulenten R. equi Stämme beherbergen einen 80kb-90kb großen Plasmid (TAKAI et al. 1991b) und werden hauptsächlich aus Proben von erkrankten Fohlen isoliert. Das 80kb-90kb große Plasmid ist essentiell für ein virulentes Verhalten (TAKAI et al. 1995a), denn es ist maßgeblich an der intrazellulären Replikation und der Überlebensstrategie im Wirt beteiligt. Ohne das Plasmid ist das Überleben in den Makrophagen von Fohlen kaum möglich (H^ONDALUS u. M^OSSER 1994,W^ADA et al. 1997, G^IGUÈRE et al. 1999).

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Darüber hinaus konnten in R. equi-Isolaten kryptische Plasmide von unterschiedlicher Größe nachgewiesen werden. Die Funktion dieser Plasmide ist bisher nicht bekannt. Es wird vermutet, dass es sich dabei um Plasmide handelt, die eine Antibiotikaresistenz beherbergen (TAKAI et al. 1995a).

Das 80kb-90kb große Plasmid der virulenten R. equi Stämme codiert für die Virulenz-assoziierten Proteine (Vap). Eins dieser Vap´s ist das VapA. Dieses codiert für ein thermoreguliertes, auf der Bakterienoberfläche exprimiertes, 15kDa-17kDa großes Protein (TAKAI et al. 1992). Es konnte gezeigt werden, dass nach dem Verlust des Plasmids keine VapA Proteine mehr nachgewiesen werden können. Ebenso zeigte sich ein Rückgang der Virulenz bei Mäusen (TAKAI et al. 1991b).

Des Weiteren veranschaulichten mehrere Studien (TAKAI et al. 1992, 1994b, 1996a), dass die Expression des 15kDa-17kDa großen Antigens durch die Temperatur und den pH-Wert reguliert wird. So zeigte sich, dass bei einer Kultivierungstemperatur unter 32°C kein Antigen gebildet wird. Der Einfluss der Temperatur ist dabei jedoch größer, als der des pH-Wertes. Durch eine Kultivierung von R. equi Stämmen über einen längeren Zeitraum, kann es zum Verlust des Plasmids kommen (C^HIRINO-T^REJO u. P^RESCOTT 1987).

Mittlerweile konnten drei weitere Vap´s nachgewiesen werden (VapC, -D, -E), die nur auf Plasmiden zu finden sind, welche das VapA-Gen tragen. Diese drei Gene sind dem VapA-Gen nachgeschaltet und werden in die gleiche Richtung transkribiert. Sie sind ebenfalls wie das VapA thermo- und pH-reguliert. Beides spricht dafür, dass sie zur Virulenz des Bakteriums beitragen (TAKAI et al. 2000, BYRNE et al. 2001).

Bisher ist deren Funktion jedoch nicht vollständig geklärt. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die Proteine VapC, -D, -E zu 50% homolog zum VapA sind (TAKAI et al. 2000, BYRNE et al. 2001).

Die schwach-virulente R. equi Stämme konnten aus submandibularen Lymphknoten beim Schwein (Sus scrofa domestica) und beim Wildschwein (Sus scrofa) isoliert werden (TAKAI et al. 1996b, MAKRAI et al. 2008). Schwach-virulente R. equi tragen Plasmide, welche eine Größe zwischen 79kb bis 100kb haben. Diese Plasmide codieren für ein Protein das 20kDa schwer ist und als VapB bezeichnet wird.

Die Proteine VapA und VapB sind zu 84% identisch (BYRNE et al. 2001). Eine weitere Studie zeigte, dass Rhodokokken, die das VapA-Gen tragen,

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im Vergleich zu Rhodokokken mit dem VapB-Gen deutlich virulenter sind und eine hohe Zytotoxität aufweisen (LÜHRMANN et al. 2004).

Avirulenten R. equi Stämme besitzen keinen Vap exprimierenden Plasmide und werden hauptsächlich aus dem Erdboden isoliert. Allerdings wurden auch bei avirulenten Stämmen kryptische Plasmide nachgewiesen (TAKAI et al. 1995a).

Eine neue Erkenntnis lieferte eine Untersuchung zur Konjugation von R. equi (TRIPATHI et al. 2012). Unter Konjugation versteht man die Fähigkeit Plasmide oder Teile der genomischen DNS von einem Bakterium auf ein anderes zu übertragen. In der Untersuchung wurde gezeigt, dass virulente R. equi ihre Plasmide an avirulente R. equi und verwandte Organismen übertragen können. Somit kann die Fähigkeit, des intrazellulären Wachstums in Makrophagen weitergereicht werden. Dadurch können avirulente R. equi virulenten Eigenschaften annehmen und Infektionen verursachen. Bisher ist der genaue biologische Ablauf bei gram-positiven Bakterien wenig verstanden sicher ist, dass dafür lebende Zellen und ein direkter Zell zu Zell Kontakt vorhanden sein müssen (T^RIPATHI et al. 2012).

2.4.1 Genotypisierung anhand des Plasmides

Bisher konnten weltweit 14 verschiedene Genotypen des virulenten R. equi Stammes identifiziert werden. Die erste Unterscheidung der verschiedenen Genotypen fand 1993 anhand der Größe der Plasmide statt. Dabei wurden zuerst 85kb und 90kb unterschieden (T^AKAI et al. 1993). Später erfolgte eine detailliertere Unterscheidung anhand des Restriktionsverdaus der Plasmide mittels der Nukleasen EcoRⅠ, EcoT221, HindⅢ und BamHⅠ. Einer der ersten Genotypen, der identifiziert wurde, war der Typ 85kb TypⅠ. Diese Variante wurde anhand des Schnittmusters von EcoRⅠ und HindⅢ differenziert (TAKAI et al. 1993, DE LA PENIA-MOCTEZUMA u.

PRESCOTT 1995). Als zweites wurde von NICHOLSON u. PRESCOTT (1997) der Typ 87kb TypⅠ entdeckt. Bisher wurden weltweit folgende 14 Genotypen des virulenten R. equi Stammes charakterisiert: 85kbⅠ-Ⅴ, 87kbⅠ-Ⅲ und 90kbⅠ-Ⅵ.

Aufgrund zahlreicher Studien konnte ein geographisches Verteilungsmuster der Genotypen festgestellt werden. Dies wird in Tab. 1 zusammenfassend dargestellt.

Das Plasmid mit der Größe 85kb und dem Schnittmuster TypⅠ und der 87kb TypⅠ wurde bisher am häufigsten weltweit isoliert und auch in den meisten Ländern

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(Argentinien, Canada, Europa, Südafrika und Australien) nachgewiesen (TAKAI et al. 2001a, 2001b, MAKRAI et al. 2002). Das 85kb TypⅡ Plasmid wurde anfänglich nur in Frankreich (RAHAL et al. 1999, TAKAI et al. 1999) und später auch aus Isolaten aus Südafrika isoliert (TAKAI et al. 2001a). Der Genotyp 87kbⅡ wurde zuerst in Japan (TAKAI et al. 1999) und danach auch in Südafrika (TAKAI et al. 2001a) nachgewiesen. 2001 wurde in einer Arbeit mit Proben aus Texas, USA zwei weitere Typen publiziert und zwar ein 85kb TypⅢ und 85kb TypⅣ (TAKAI et al. 2001b).

Ebenfalls 2001 wurden in Japan zwei weitere Schnittmuster definiert. Die Isolate stammten von einem Fohlen, das aufgrund einer R. equi-Pneumonie und einer ulzerativen Enteritis verstorben war. Zwei der Isolate wiesen im Verdau mit EcoRⅠ und EcoT221 kein bereits bekannten Schnittmuster auf. Jedoch im Verdau mit HindⅢ und BamHⅠ konnte eine Korrelation zu dem 90kb TypⅠ hergestellt werde.

Deshalb wurden sie als 90kb Typ Ⅲ und Ⅳ definiert (T^AKAI et al. 2001c). In Proben aus Korea wurde 2003 der 90kb TypⅡ isoliert(T^AKAI et al. 2003b), der bis dahin nur bei Pferden nachgewiesen wurde, die ihren ursprünglichen Lebensraum in Japan hatten (TAKAI et al. 2001d, 2003b). Zusätzlich wurde ein neuer Schnitttyp aus den koreanischen Proben charakterisiert. Er wird als 90kb TypⅤ bezeichnet (T^AKAI et al. 2003b). In einer 2005 erschienen Publikation wurden 41 Proben aus Brasilien untersucht. Dabei wurde sechsmal der 85kb TypⅠ und 33mal der 87kb TypⅠ nachgewiesen. Die zwei verbleibenden Proben wurden einem neuen Typ zugeschrieben, da ihr Schnittmuster im Verdau von EcoRⅠ und EcoT221 keinem bisher bekannten Typ zugeordnet werden konnte. Allerdings war das Schnittmuster von BamHⅠ identisch mit dem 87kb TypⅠ, weshalb sie als 87kb Typ

Ⅲ bezeichnet wurden (RIBEIRO et al. 2005).

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Tab. 1 Weltweite Verteilung der Genotypen von R. equi.

Plasmid-Genotyp Länder Referenzen

85kb Typ Ⅰ

Argentinien, Canada, Europa, Südafrika, Australien

Takai et al. 2001a, b, Makrai et al. 2002, Venner et al. 2007b

85kb Typ Ⅱ Frankreich, Südafrika Takai et al. 1999, Rahal et al. 1999; Takai et al. 2001a

85kb Typ Ⅲ Texas Takai et al 2001b

85kb Typ Ⅳ Texas Takai et al 2001b

87kb Typ Ⅰ

Argentinien, Canada, Europa, Südafrika, Australien

Takai et al. 2001a, b, Makrai et al. 2002

87kb Typ Ⅱ Japan, Südafrika Takai et al. 1999, 2001a

87kb Typ Ⅲ Brasilien Ribeiro et al. 2005

90kb Typ Ⅰ Japan Takai et al. 1993

90kb Typ Ⅱ Japan, Korea Takai et al. 2001d, 2003b

90kb Typ Ⅲ Japan Takai et al. 2001c

90kb Typ Ⅳ Japan Takai et al. 2001c

90kb Typ Ⅴ Korea Takai et al 2003b

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Neben der bisher beschriebenen Einteilung nach den Schnittmustern des Plasmids im Restriktionsverdau, kann die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) als eine weitere Möglichkeit zur detaillierteren Untersuchung der R. equi Genotypen heran gezogen werden. Dabei wird im Gegensatz zu der bisher besprochenen Genotypisierung anhand eines Restriktionsverdaus, welcher nur das Plasmid analysierte, mit der PFGE nun die gesamte DNS des Bakteriums untersucht. In einer Studie von VENNER et al. (2007b) wurde diese Methode angewandt. Der Vorteil dieser Methode ist, dass die Proben zusätzlich in Pulsotypen eingeteilt werden können. Von insgesamt 83 deutschen Isolaten trugen 80 Proben einen 85kb TypⅠ und die drei verbleibenden Isolate trugen einen 87kb TypⅠ Plasmid. Für die PFGE wurden die Proben zuvor mit der Restriktionsendonuklease VSPⅠ verdaut. Anschließend erfolgte die Auftrennung der Proben im Pulsfeld. Dadurch konnten die Proben in drei Haupt- und drei Unter-Pulsotypen eingeteilt werden. Somit können Proben, die das gleiche Plasmid tragen, anhand der gesamten DNS der Zelle weiter unterteilt und verglichen werden (VENNER et al. 2007b).

Bei Isolaten von Menschen konnten schwach-virulente R. equi Stämme, die den gleichen Plasmid tragen wie Stämme, die beim Schwein isoliert wurden, nachgewiesen werden (T^AKAI et al. 1996b). Nur etwa 20%-25% der Isolate vom Mensch tragen ein VapA exprimierenden R. equi Stamm (T^AKAI et al. 1994a, 1995b, C^ATERINO-^DE-A^RAUJO et al. 1999). Viele der beim Mensch isolierten Rhodokokken sind VapB positiv oder avirulent. Es wurden 39 Isolate von Menschen, manche davon waren mit HIV infiziert, untersucht. Acht der Isolate trugen einen 85kb großen Plasmid und exprimierten das VapA-Gen. Bei weiteren 19 Isolaten wurden kryptische Plasmide festgestellt. Die restlichen 12 Isolate trugen keinen Plasmid (TAKAI et al. 1994a). In einer weiteren Studie wurde das geographische Vorkommen von R. equi Stämmen und ihren Plasmiden beim Menschen ermittelt. Dabei zeigte sich, dass von vier Isolaten aus Brasilien nur eines das 15Da-17kDa Protein exprimierte und somit zu einem virulenten R. equi Stamm gehört. Während die restlichen drei Isolate das 20kDa Protein exprimierten und zu einem schwach- virulenten R. equi Stamm gehörten. In Italien war bei drei von neun Isolaten ein Plasmid nachweisbar. Ein Plasmid exprimierte VapB und zwei VapA (CATERINO-DE-ARAUJO et al. 1999). Diese Studie zeigte außerdem, dass es beim immunsupprimierten Menschen auch durch avirulente Stämme zu einer Infektion und

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Erkrankung kommen kann (CATERINO-DE-ARAUJO et al. 1999). Der Infektionsweg beim Mensch ist jedoch weiterhin unklar und bietet Raum für Diskussionen. Es gibt Hinweise, dass ein möglicher Infektionsweg, Kontakt mit infiziertem Erdboden ist.

Sowohl in den Bodenproben aus der Umgebung eines Bauernhofs in Thailand, wie auch in den Proben von HIV infizierten Menschen, konnten VapB tragende Rhodokokken nachgewiesen werden. In der Studie wurden sechs Isolate von Menschen untersucht, vier davon waren VapB positiv. Ein Teil der untersuchten Menschen arbeiteten als Tagelöhner und kamen somit mit Erdboden und Exkrementen von Tieren in Kontakt (MAKRAI et al. 2002).

Des Weiteren gab es Untersuchungen zum Vorkommen von R. equi bei verschiedenen Tierarten, sowie eine weitere Zuordnung der Isolate zu verschiedenen Stämmen und Genotypen. Dieser Sachverhalt wird in Tab. 2 dargestellt (DAVIS et al. 1999, FLYNN et al. 2001, MAKRAI et al. 2002, 2005b, 2008 TAKAI et al.

2003a, S^AKAI et al. 2012, R^ZEWUSKA et al. 2014, W^ITKOWSKI et al. 2015). Dazu wurden unter anderem neun Hunden und neun Katzen untersucht. In fünf von neun untersuchten Proben von Katzen und einer von neun Proben vom Hund, wurde VapA festgestellt. Vier davon wiesen einen 85kb großes Plasmid vom TypⅠ und zwei einen 87kb großes Plasmid vom TypⅠ auf (TAKAI et al. 2003a).

Von 1.173 untersuchten Schweinen, aus Ungarn wurde bei keinem der Tiere ein virulenter Stamm nachgewiesen. Allerdings waren 44 Isolaten VapB positiv (MAKRAI et al. 2005b).

In einer Studie, bei der das Vorkommen von R. equi bei Wildtieren in Polen untersucht wurden, konnten bei allen untersuchten Proben nur avirulente Stämme isoliert werden (RZEWUSKA et al. 2014, WITKOWSKI et al. 2015). Bei Wildschweinen aus Ungarn konnte kein VapA, aber bei 26% der 82 Proben VapB nachgewiesen werden (MAKRAI et al. 2008). Bei den weiteren Proben wurde kein Plasmid isoliert.

Somit liegt in Ungarn die Prävalenz von R. equi bei Wildschweine in einem ähnlichen Bereich, wie bei den domestizierten Hausschweinen. 2012 wurden in Japan bei 34 Proben von insgesamt 65 Wildschweinen R. equi nachgewiesen. Darunter befand sich ein VapA und 20 VapB positive Tiere (SAKAI et al. 2012).

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In Irland liefen Untersuchungen zum Vorkommen von R. equi bei Rindern. Der Nachweis gelang bei 264 Rindern. Jedoch konnten durch Immunoblast Test und PCR bei 146 Isolaten kein Hinweis auf das 15kDa-17kDA oder das 20kDa große Protein gefunden werden. Daher wurden die Isolate als eher nicht pathogen eingestuft (FLYNN et al. 2001). Diese Ergebnisse sind allerdings aufgrund der geringen Sensitivität der gewählten Untersuchungsmethoden mit Vorbehalt zu sehen.

Kulturell ließ sich im Rahmen einer Obduktion R. equi aus Proben von erkrankten Ziegen anzüchten. Jedoch konnte kein 15kDa-17kDa Protein nachgewiesen werden.

Nach dem VapB Protein wurde nicht geforscht, somit könnte es sich damit um avirulente oder schwach-virulente Stämme handeln (DAVIS et al. 1999).

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Tab. 2 Überblick über die R. equi-Isolate bei anderen Tierarten.

Tierart Land

Anzahl der untersucht en Proben

Anzahl der R. equi positiven Proben

Nachweis VapA

Nachweis VapB

Plasmid-

typ Referenz

Katze, Hund

Brasilien, Kanada, Neusee- land,USA

18 6 6 0 4x 85kbⅠ

2x 87kbⅠ

Takai et al. 2003a

Schwein Ungarn 1.173 164 0 44 kA Makrai et

al. 2005b

Schwein Japan 1.832 56 1 54 kA Takai et

al. 1996b

Wild-

schwein Polen 452 23 0 16 nU

Rzewuska et al.

2014, Witkowski et al. 2015

Rehe Polen 212 2 0 0 nU

Rzewuska et al.

2014, Witkowski et al. 2015 Rot-

hirsche Polen 272 2 0 0 nU

Rzewuska et al.

2014, Witkowski et al. 2015 Wild-

schwein Ungarn 482 82 0 21 nU Makrai et

al. 2008 Wild-

schwein Japan 65 34 1 20 kA Sakai et

al. 2012

Rinder Irland 3.263.622 264 0 0 nU Flynn et al.

2001

Ziegen USA 2 2 0 kA nU Davis et

al. 1999

Legende 1: kA= keine Angaben; nU= nicht Untersucht

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3 Material und Methoden

Ziel der vorliegenden Studie war es, herauszufinden welche R. equi Genotypen in Deutschland auftreten. Des Weiteren sollte gezeigt werden, welche Genotypen bei einigen anderen Tierarten vorkommen.

Die Probenentnahme erfolgte im Zeitraum von Mai 2014 bis Mai 2015. Die klinischen Untersuchungen der erkrankten Fohlen wurden auf einem Warmblutgestüt in Norddeutschland an 100 Fohlen durchgeführt. Untersucht wurden Fohlen in einem Alter zwischen 1 Monat und 6 Monaten. Zusätzlich wurden, zur Vervollständigung der deutschlandweit vorkommenden R. equi Genotypen weitere 109 Proben von verschiedenen Laboren zur Verfügung gestellt.

3.1 Haltungsbedingungen der Fohlen

Die Stuten mit Fohlen wurden entweder in Laufställen zu 8-14 Tieren oder auf der Weide untergebracht. Regelmäßig erfolgte eine Impfung der Stuten gegen das equine Herpesvirus 1 und 4 (EHV1 und 4), Influenza und Tetanus, sowie die regelmäßige Entwurmung mit unterschiedlichen Wirkstoffklassen. Die Pferde bekamen 2x täglich Gras- und Heusilage gefüttert. Zusätzlich standen jederzeit Heu, Stroh, Wasser und Salzlecksteine zur Verfügung.

3.2 Probanden

3.2.1 Allgemeinuntersuchung

Auf dem Gestüt erfolgte im Rahmen des Gesundheitsprogramms einmal wöchentlich eine klinische Allgemeinuntersuchung der Fohlen mit Beginn des ersten Lebenstages bis hin zum Alter von ca. 6 Monaten. Fohlen mit einer Lungenerkrankung wurden aufgrund der regelmäßigen Untersuchung identifiziert. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden Ernährungszustand, Kotkonsistenz, Habitus und Saugverhalten beurteilt. Zusätzlich wurde die Körperinnentemperatur rektal erfasst und eine Blutprobe aus der Vena jugularis externa entnommen. Dazu wurde die Vene mit einer 1,2x40mm großen Kanüle (Becton, Dickinson an Company) punktiert, das Blut in einem EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Röhrchen (Sarstedt, Lot 4092501) aufgefangen und anschließend die Leukozytenzahl mit Hilfe eines Sysmex KX-21V über eine Widerstandsmessung bestimmt.

32 3.2.2 Spezielle Untersuchung

Bei der speziellen Untersuchung der Atemwege wurde der Nasenausfluss nach Menge und Beschaffenheit beurteilt. Des Weiteren erfolgte eine Palpation der mandibularen Lymphknoten, eine Auskultation der Trachea und der Lunge auf beiden Thoraxseiten an drei verschiedenen Punkten. Die erhobenen Befunde wurden dokumentiert (siehe im Anhang Abb. 20) und anschließend in einen klinischen Score eingeteilt (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998, siehe Tab. 3).

Dazu wird jedem erfassten Befund eine Zahl zugeordnet, wobei normale Befunde eine Null und stark abweichende Befunde eine Drei erhalten. Diese Zahlen werden addiert und ergeben dann den klinischen Score, anhand dessen der Schweregrad der respiratorischen Erkrankung beurteilt wird.

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Tab. 3 Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades respiratorischer Symptome (modifiziert nach OHNESORGE et al.1998).

Merkmale Befunde Punktzahl

nein 0

serös,seromukös 1

purulent 2

nicht auslösbar 0

mehrfach 1

spontan 2

o.b.B 0

vergrößert 1

nein 0

Einsinken der Interkostalräume, Nüsternblähen 3 vesikulär, vesikulär verschärft 0

rasseln knisternm giemen 2

o.b.B 0

rasseln 2

Gesamtpunkte 12

Tracheaauskultation Nasenausfluß

Hustenauslösung

Lnn. Mandibulares

Ruhedyspnoe

Lungenauskulatation

Gradeinteilung der klinischen Befunde:

Klinischer Score von 0-1= lungengesund

Klinischer Score von 2-3= geringgradig erkrankt Klinischer Score von 4-5= mittelgradig erkrankt Klinischer Score von >5= hochgradig erkrankt

34 3.2.3 Ultrasonographische Untersuchung

Eine ultrasonographische Untersuchung der Fohlen wurde dann angeschlossen, wenn aufgrund von veränderten Blutwerten, Fieber (über 39,5°C) oder aufgrund der zuvor erfolgten klinischen Untersuchungen ein Hinweis auf eine Erkrankung des Respirationstrakts vorlag. Aus dem entnommen Blut wurde die Leukozytenzahl bestimmt, als verändert galten Werte ≥13.000 Zellen/µl. Die sonographische Untersuchung erfolgte im Stall, mittels tragbaren, akkubetriebenen Geräten (Tringa Linear, Esaote Piemedical, Maastricht, Niederlande) mit einem 5MHz Linearschallkopf. Dazu wurde das Fohlen durch zwei Helfer an Hals und Hinterhand fixiert. Die Haut im zu untersuchende Bereich wurde mit 99% Isopropyl-Alkohol (ReboPharm, Bocholt, Deutschland) entfettet und Transmissionsgel (Serovosan Lot 140327, Hamburg, Deutschland) aufgetragen. Der Untersuchungsbereich begrenzt sich dorsal durch den M. longissimus dorsi, kranial durch den M. tensor fasciae antebrachii und M. triceps brachii, ventral durch das Sternum und kaudal durch das Zwerchfell. Runde, hypoechogene Bereiche von 1cm Durchmesser und größer, wurden als Abszesse angesprochen. Alle erhobenen Befunde wurden auf einem Ultraschallbefundbogen (siehe Abb. 21 im Anhang) protokolliert. Um den Schweregrad der Lungenveränderung zu beurteilen, wurde der Abszess-Score berechnet. Dieser ergab sich aus der Summe der Abszess-Durchmesser in cm.

3.2.4 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie

Für die Studie wurden Fohlen ausgewählt, die durch eine Leukozytenzahl über 13.000 Zellen/µl auffielen, oder aufgrund des klinisch erhobenen Scores, zur ultrasonographischen Untersuchung anstanden. Des Weiteren musste bei der ultrasonographischen Untersuchung mindestens ein Abszess-Score von eins festgestellt werden, damit die Fohlen in die Studie aufgenommen wurden. Insgesamt wurden 100 Fohlen für diese Studie untersucht.

3.3 Probenentnahme

Für die Probenentnahme wurden die Stute und das Fohlen nebeneinander in einen Untersuchungsstand gestellt und die Fohlen erhielten 4mg Detomidin- Hydrochloridium (Cepesedan, CP-Pharma) intravenös. Anschließend erfolgte die endoskopische Probenentnahme. Dafür wurde das Endoskop über den ventralen

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Nasengang (Meatus nasi ventralis) in die Trachea eingeführt. Die Proben-Entnahme erfolgte durch ansaugen des Sekrets mit einem zuvor in den Arbeitskanal des Endoskops eingebrachten sterilen Katheter. Mit Hilfe einer 20ml Spritze (Braun) erzeugte man einen Unterdruck im Katheter, dadurch zog sich der Mucus in den Katheter ein. Der entnommene Mucus wurde dann aus dem Katheter herausgedrückt und auf einen sterilen Tupfer gegeben, der dann für den Versand in Kohlemedium (Heinz Herenz, Hamburg, Deutschland) eingebracht wurde.

3.3.1 Gewinnung von Bodenproben

Für die Entnahme von Bodenproben wurden 15 verschieden Standorte auf dem Gestüt ausgesucht. Darunter befanden sich sieben Weiden, zwei Treibgänge und sechs Paddocks. Die Probenentnahme erfolgte im April von der oberflächlichen Erdschicht. Dazu wurden ca. 20g Erde mit einem Teelöffel in ein Plastik Gefäß (WDT Urinbecher Artikel Nr. 90151) verbracht und an das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutschland versandt.

3.4 Mikrobiologische Untersuchung der Proben

Der Versand aller Proben erfolgte gekühlt an das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Alle Proben wurden nach den dort üblichen Untersuchungs- und Verfahrensanweisungen kulturell auf das Vorkommen von R. equi untersucht. Die 109 Proben aus den Laboren Idexx (Ludwigsburg), Laboklin (Bad Kissing), Labor Böse (Harsum) und dem Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Justus-Liebig Universität Gießen wurden ebenfalls an das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover versandt und dort auf den Versand nach Japan vorbereitet.

Zusätzlich stellte das Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vier R. equi-Isolate zur Verfügung.

3.5 Genotypisierung der R. equi-Isolate

Die weiteren Untersuchungen der Proben fanden im Department für Tierhygiene der Universität für Veterinärmedizin, Kitasato Universität in Japan unter der Leitung von Prof. Dr. Takai statt. Der gesamte Versuchsablauf wurde bei 60% der Proben von mir eigenhändig im Oktober 2014 durchgeführt. Die restlichen Proben wurden von den

36

Labormitarbeitern von Prof. Takai nach dem gleichen Verfahren bearbeitet. Der Transport der Isolate erfolgte gefriergetrocknet. Nach der Ankunft in Japan wurden die Proben in 2ml Aqua dest. aufgenommen und ein Tropfen dieser Wasser/Bakteriensuspension auf einem festen selektiven Nährboden für R. equi (siehe Anhang) für 48h bei 30°C (Advantes, TVA 46ODA Incubator, Deutschland) angezüchtet. Anschließend wurde eine für R. equi typische, einzelne Kolonie ausgewählt, mittels Bakterienöse in selektives Flüssigmedium (siehe Anhang) überführt und bei leichtem Schütteln für 42h bei 30°C (Thomas Thermostatis shaking Incubator AT 12R, Japan) vermehrt.

3.5.1 Nachweis VapA-Gen

Für die VapA-PCR wurde eine R. equi Kolonie von dem festen Nährboden gepickt, in 50µl Aqua dest. resuspendiert und für 3min bei >100°C gekocht. Anschließend wurden die Suspension 3min bei 15.000rpm zentrifugiert (TOMY MX-307, Japan).

Alle folgenden Zentrifugationsschritte erfolgten soweit nicht anders angegeben mit dieser Zentrifuge (TOMY MX-307, Japan). Durch den Kochschritt wird die Zellwand zerstört und die folgende Zentrifugation sorgt dafür, dass sich die schweren Zellbestandteile am Boden des Reagenzgefäßes sammeln. Die DNA befindet sich im flüssigen Überstand der Probe. Anschließend erfolgte mit der DNA aus dem Überstand der zuvor gekochten Proben eine PCR. Der Mastermix für 10 Proben bestand aus 347,5µl Aqua dest, 50µl 10x Puffer (Biotech International), 40µl dNTP´s (Jena Bioscience), jeweils 10µl der Primer (Fasmac VapA F und VapA R), 30µl MgCl2 (Biotech International) und 2,5µl Polymerase (Biotech International Lot 111.381). Von jeder Probe wurde 1µl DNA mit 49µl Mastermix vermengt. Der Ansatz lief über 35 Zyklen bei einer Anlagerungs- Temperatur von 57°C über 30sec. Am Ende wurden alle Proben über ein 0,8%iges Agarosegel (GE Healthcare Bio-Science Lot 17-0554-02), das bereits 5µl Ethidiumbromid (900µg/ml) (Nacalai tesque Lot.

MOH 6164, Japan) enthielt, elektrophoretisch für 15-30min bei 100V getrennt (Gelkammer, Mupid 2 plus submarine electrophoresis system, Advance, Japan).

Am Ende wurde das Gel unter Einstrahlung von UV-Licht ausgewertet.

Dabei wurde das Vorhandensein einer fluoreszierenden Bande mit einer Größe von 587bp kontrolliert. Diese Bande enthält die vervielfältigte DNS, die für das VapA-Gen kodiert, damit wurde überprüft, ob es sich um virulente R. equi-Isolate handelt.

Zusätzlich lief ein Isolat des Referenzstammes ATCC33701 mit.

37 3.5.2 Nachweis VapB-Gen

Alle Proben wurden nach dem am Department für Tierhygiene der Kitasato Universität für Veterinärmedizin üblichen ELISA Verfahren mit einem monoklonalen Antikörper auf das Vorliegen des VapB Proteins untersucht (TAKAI et al. 1995b, 1996b).

3.5.3 Plasmidisolierung

Im Anschluss erfolgte eine Plasmidisolierung. Dabei wurde untersucht, welche R.

equi-Isolate Plasmide enthalten. Dies erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (BIRNBOIM u. DOLY 1979). Von den in Flüssigmedium angereicherten Bakterien wurden je 1ml in ein 1,5ml Eppendorf Röhrchen (Eppendorf Micro Test Tube 3810 1,5ml; Hamburg; Deutschland) überführt und für 3min bei 12.000rpm zentrifugiert.

Im Folgenden wurden die Zellen in 1ml TE-Puffer (siehe Anhang) gelöst, um die Bakterien von dem Anzuchtmedium zu separieren. Es folgte eine weitere Zentrifugation über 3min bei 12000rpm. Anschließend wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 200µl Lösung I (siehe Anhang) gelöst. Im Anschluss wurde der Ansatz für 2h bei 37°C im Wasserbad (TAITEC Personal-11, Japan) inkubiert.

Nach 120 Minuten erfolgte die Zugabe von 400µl Lösung II (siehe Anhang) und 300µl Lösung III (siehe Anhang) zu dem zuvor inkubierten Versuchsansatz. Der Ansatz wurde anschließend über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurde die Suspension für 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf Gefäß (Eppendorf Micro Test Tube 3810 1,5ml) überführt und es wurden 500µl Phenol-Chloroform Lösung (siehe Anhang) hinzu gegeben. Der Ansatz wurde durch wiederholtes invertieren gemischt und danach 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Überstand in ein neues Gefäß überführt und 500µl Isopropanol hinzugegeben. Anschließend wurde für 30min bei –80°C inkubiert und danach erneut für 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und das Pellet mit 1ml 70%igem Ethanol (Kanto Chemical, Japan) gewaschen und für 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Überstand abpipettiert und das Pellet in einer vakuumerzeugenden Zentrifuge (EYELA centrifugal vaporizer CVE-100, Japan) für 7min bei 45°C und 15.000rpm getrocknet.

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Zum Schluss wurde die DNA in 30µl destilliertem Wasser aufgenommen und anschließend für 1h bei -20°C gelagert.

Zur Auswertung des Versuches wurde das Plasmid unverdaut auf ein Agarosegel aufgetragen. Dazu wurde ein 0,7%iges Agarosegel aus 0,35g Agarose (GE Healthcare Bio-Science Lot 17-0554-02) und 50ml 1x TAE Puffer (siehe Anhang) hergestellt. Der Ansatz wurde in einer Mikrowelle (Corona, lillte chef microwave oven) erwärmt, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat und dann in ein Gel- Schiffchen gegossen und 30min bis zum vollständigen erstarren abgekühlt. Im weiteren Verlauf wurden dann 8µl der Probe mit 2µl 6x Ladepuffer (siehe Anhang) vermengt und auf das Gel geladen. Die Laufzeit für das Gel betrug 45min bei 80V, 100mA, 8W (Gelelektrophese ATTO Model AE-8750). Nach 45 Minuten wurde das Gel in eine Lösung aus 1ml einer 30µg/ml Ethidiumbromid-Lösung (Nacalai tesque Lot. MOH 6164, Japan) und 150ml destilliertem Wasser für 15min unter leichtem Schwenken (TAITEC Personal-11, Japan) gelegt. Im Anschluss wurde das Gel unter fließendem Wasser gewaschen und unter der Einstrahlung von UV-Licht fotografiert.

Die Auswertung erfolgte Anhand der Positivkontrolle (ATCC33701). Jedes Isolat wurde mit der Positivkontrolle verglichen, wenn das Bandenmuster identisch war, wurde die Probe als Plasmid tragend eingestuft.

3.5.4 Restriktionsverdau des Plasmids

Anschließend an die Plasmidisolierung erfolgte zur Genotypisierung der Proben ein Restriktionsverdau. Dazu wurden 10µl des Plasmids mit 1µl EcoRⅠ (TakaRa Lot K2404AA) und 1,22µl 10x Puffer (TakaRa Lot 12801A) kombiniert. Der Ansatz inkubierte für 3h bei 37°C (Advantec Incubator CI-612, Japan). Nach den 3h wurde die verdaute DNA auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen. Dazu wurden 0,5g Agarose (GE Healthcare Bio-Science Lot 17-0554-02) und 50 ml 1x TAE Puffer (siehe Anhang) verwendet. Durch die Gelelektrophereseapparatur (Gelelektrophese ATTO Model AE-8750, Japan) wurde eine Spannung von 80V, ein Widerstand von 100mA und eine Leistung von 8W über einen Zeitraum von 120min generiert. Im Anschluss wurde das Gel nach dem gleichen Verfahren wie bei der Plasmidisolierung angefärbt. Auch hier wurden das Bandenmuster der Isolate zur Auswertung mit dem Bandenmuster der Positivkontrollen ATCC33701 (85kb Typ Ⅰ) und 222 (87kb Typ Ⅰ) verglichen.

39 3.5.5 PCR Genotypisierung

Um unsere Ergebnisse des Restiriktionsverdaus zu überprüfen und Proben, die nicht eindeutig zu identifizieren waren, einzuordnen, wurden verschiedene PCR-Ansätze durchgeführt. Dazu wurde eine Auswahl an Proben getroffen. Die Abfolge der PCR Genotypisierung ist in Abb. 1 dargestellt. Alle Proben wurden 1:100 mit Aqua dest verdünnt. Der verwendete Mastermix entsprach dem im Abschnitt 3.5.1 VapA-PCR beschriebenem Ansatz. Alle folgenden PCR`s liefen über 35 Zyklen. Die Auswertung erfolgte wie bei der VapA-PCR anhand einer elektrophoretischen Auftrennung mit einem 0,8%igem Agarosegels. Die erste PCR wurde mit den Primern Fr 9 F (Fasmac, P 14A070473, 5´-CGAACCGCTCGGCTTTACGT-3´) und Fr 9 R (Fasmac, P14A070474, 5´-ACGGAATCGCCGTACACA-3´) bei einer annealing Temperatur von 54°C über 30 sec. durchgeführt. Es wurde ein PCR-Produkt mit der Größe von 500bp erwarten. Danach wurde mit allen in der FR 9 PCR positiven Proben, eine PCR mit den Primern Fr 7-9 F (Fasmac, P14B190460, 5´-TCGAGAGAATCGCACCCAT-3´) und Fr 7-9 R (Fasmac, P14B190461, 5´-CAGCTCGTAGCGCTGTTGAC-3´) bei einer annealing Temperatur von 54°C durchgeführt. Das erwartete PCR-Produkt ist hier ebenfalls 500bp groß. Als nächstes wurde mit den Proben, die hier wiederum positiv ausfielen, zwei weitere PCR-Ansätze vorgenommen, zum einen mit den Primern 1-2-3F (Fasmac, P14D220089 5´-ACCGAGACCGCGTAGGAATC-3´) und 1-2-3R (Fasmac, P 14D220090, 5´-ATCTGCCGAGGTAGGCGGAA-3´), zum anderen mit den Primern 1-2-4F (Fasmac,P14D220091 5´-ATGTCGCCCTCGACCTACTC-3´) und 1-2-3R (Fasmac, P14D220092, 5´-GGGTTTGTCGGCGGTCGATT-3´). Beide PCR´s liefen bei einer annealing Temperatur von 54°C. Bei der PCR mit den Primern 1-2-3 wurde ein PCR-Produkt mit 465bp, bei der PCR mit den Primern 1-2-4 ein Produkt mit der Größe 417bp erwartet. Die positiven Proben wurden weiter mittels der Primern ORF 33F (Fasmac, P 14D280124 5´-TCGCCGTTGTTGACGATGTA-3´), ORF 33R (Fasmay, P 14D280125 5´-ATGGTCAAGTTCGCTGTCGA-3´) bei einer annealing Temperatur von 50°C untersucht. Hier sollte das PCR-Produkt 350bp groß sein. Die letzte PCR wurde mit den Primern Nr8-aF (Fasmac, P14B150053 5´-TGCGTGCGCCGACGAAGATG-3´) und Nr8-aR (Fasmac, P14B100351 5´-TGTGGTCGACGCAGTAGTTC-3´) bei einer annealing Temperatur von 55°C durchgeführt. Hier wurde ein PCR-Produkt mit 500bp erwartet.