Nachweis VapA-Gen

Für die VapA-PCR wurde eine R. equi Kolonie von dem festen Nährboden gepickt, in 50µl Aqua dest. resuspendiert und für 3min bei >100°C gekocht. Anschließend wurden die Suspension 3min bei 15.000rpm zentrifugiert (TOMY MX-307, Japan).

Alle folgenden Zentrifugationsschritte erfolgten soweit nicht anders angegeben mit dieser Zentrifuge (TOMY MX-307, Japan). Durch den Kochschritt wird die Zellwand zerstört und die folgende Zentrifugation sorgt dafür, dass sich die schweren Zellbestandteile am Boden des Reagenzgefäßes sammeln. Die DNA befindet sich im flüssigen Überstand der Probe. Anschließend erfolgte mit der DNA aus dem Überstand der zuvor gekochten Proben eine PCR. Der Mastermix für 10 Proben bestand aus 347,5µl Aqua dest, 50µl 10x Puffer (Biotech International), 40µl dNTP´s (Jena Bioscience), jeweils 10µl der Primer (Fasmac VapA F und VapA R), 30µl MgCl2 (Biotech International) und 2,5µl Polymerase (Biotech International Lot 111.381). Von jeder Probe wurde 1µl DNA mit 49µl Mastermix vermengt. Der Ansatz lief über 35 Zyklen bei einer Anlagerungs- Temperatur von 57°C über 30sec. Am Ende wurden alle Proben über ein 0,8%iges Agarosegel (GE Healthcare Bio-Science Lot 17-0554-02), das bereits 5µl Ethidiumbromid (900µg/ml) (Nacalai tesque Lot.

MOH 6164, Japan) enthielt, elektrophoretisch für 15-30min bei 100V getrennt (Gelkammer, Mupid 2 plus submarine electrophoresis system, Advance, Japan).

Am Ende wurde das Gel unter Einstrahlung von UV-Licht ausgewertet.

Dabei wurde das Vorhandensein einer fluoreszierenden Bande mit einer Größe von 587bp kontrolliert. Diese Bande enthält die vervielfältigte DNS, die für das VapA-Gen kodiert, damit wurde überprüft, ob es sich um virulente R. equi-Isolate handelt.

Zusätzlich lief ein Isolat des Referenzstammes ATCC33701 mit.

37 3.5.2 Nachweis VapB-Gen

Alle Proben wurden nach dem am Department für Tierhygiene der Kitasato Universität für Veterinärmedizin üblichen ELISA Verfahren mit einem monoklonalen Antikörper auf das Vorliegen des VapB Proteins untersucht (TAKAI et al. 1995b, 1996b).

3.5.3 Plasmidisolierung

Im Anschluss erfolgte eine Plasmidisolierung. Dabei wurde untersucht, welche R.

equi-Isolate Plasmide enthalten. Dies erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (BIRNBOIM u. DOLY 1979). Von den in Flüssigmedium angereicherten Bakterien wurden je 1ml in ein 1,5ml Eppendorf Röhrchen (Eppendorf Micro Test Tube 3810 1,5ml; Hamburg; Deutschland) überführt und für 3min bei 12.000rpm zentrifugiert.

Im Folgenden wurden die Zellen in 1ml TE-Puffer (siehe Anhang) gelöst, um die Bakterien von dem Anzuchtmedium zu separieren. Es folgte eine weitere Zentrifugation über 3min bei 12000rpm. Anschließend wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 200µl Lösung I (siehe Anhang) gelöst. Im Anschluss wurde der Ansatz für 2h bei 37°C im Wasserbad (TAITEC Personal-11, Japan) inkubiert.

Nach 120 Minuten erfolgte die Zugabe von 400µl Lösung II (siehe Anhang) und 300µl Lösung III (siehe Anhang) zu dem zuvor inkubierten Versuchsansatz. Der Ansatz wurde anschließend über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurde die Suspension für 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf Gefäß (Eppendorf Micro Test Tube 3810 1,5ml) überführt und es wurden 500µl Phenol-Chloroform Lösung (siehe Anhang) hinzu gegeben. Der Ansatz wurde durch wiederholtes invertieren gemischt und danach 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Überstand in ein neues Gefäß überführt und 500µl Isopropanol hinzugegeben. Anschließend wurde für 30min bei –80°C inkubiert und danach erneut für 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und das Pellet mit 1ml 70%igem Ethanol (Kanto Chemical, Japan) gewaschen und für 15min bei 15.000rpm zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Überstand abpipettiert und das Pellet in einer vakuumerzeugenden Zentrifuge (EYELA centrifugal vaporizer CVE-100, Japan) für 7min bei 45°C und 15.000rpm getrocknet.

38

Zum Schluss wurde die DNA in 30µl destilliertem Wasser aufgenommen und anschließend für 1h bei -20°C gelagert.

Zur Auswertung des Versuches wurde das Plasmid unverdaut auf ein Agarosegel aufgetragen. Dazu wurde ein 0,7%iges Agarosegel aus 0,35g Agarose (GE Healthcare Bio-Science Lot 17-0554-02) und 50ml 1x TAE Puffer (siehe Anhang) hergestellt. Der Ansatz wurde in einer Mikrowelle (Corona, lillte chef microwave oven) erwärmt, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat und dann in ein Gel-Schiffchen gegossen und 30min bis zum vollständigen erstarren abgekühlt. Im weiteren Verlauf wurden dann 8µl der Probe mit 2µl 6x Ladepuffer (siehe Anhang) vermengt und auf das Gel geladen. Die Laufzeit für das Gel betrug 45min bei 80V, 100mA, 8W (Gelelektrophese ATTO Model AE-8750). Nach 45 Minuten wurde das Gel in eine Lösung aus 1ml einer 30µg/ml Ethidiumbromid-Lösung (Nacalai tesque Lot. MOH 6164, Japan) und 150ml destilliertem Wasser für 15min unter leichtem Schwenken (TAITEC Personal-11, Japan) gelegt. Im Anschluss wurde das Gel unter fließendem Wasser gewaschen und unter der Einstrahlung von UV-Licht fotografiert.

Die Auswertung erfolgte Anhand der Positivkontrolle (ATCC33701). Jedes Isolat wurde mit der Positivkontrolle verglichen, wenn das Bandenmuster identisch war, wurde die Probe als Plasmid tragend eingestuft.

3.5.4 Restriktionsverdau des Plasmids

Anschließend an die Plasmidisolierung erfolgte zur Genotypisierung der Proben ein Restriktionsverdau. Dazu wurden 10µl des Plasmids mit 1µl EcoRⅠ (TakaRa Lot K2404AA) und 1,22µl 10x Puffer (TakaRa Lot 12801A) kombiniert. Der Ansatz inkubierte für 3h bei 37°C (Advantec Incubator CI-612, Japan). Nach den 3h wurde die verdaute DNA auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen. Dazu wurden 0,5g Agarose (GE Healthcare Bio-Science Lot 17-0554-02) und 50 ml 1x TAE Puffer (siehe Anhang) verwendet. Durch die Gelelektrophereseapparatur (Gelelektrophese ATTO Model AE-8750, Japan) wurde eine Spannung von 80V, ein Widerstand von 100mA und eine Leistung von 8W über einen Zeitraum von 120min generiert. Im Anschluss wurde das Gel nach dem gleichen Verfahren wie bei der Plasmidisolierung angefärbt. Auch hier wurden das Bandenmuster der Isolate zur Auswertung mit dem Bandenmuster der Positivkontrollen ATCC33701 (85kb Typ Ⅰ) und 222 (87kb Typ Ⅰ) verglichen.

39 3.5.5 PCR Genotypisierung

Um unsere Ergebnisse des Restiriktionsverdaus zu überprüfen und Proben, die nicht eindeutig zu identifizieren waren, einzuordnen, wurden verschiedene PCR-Ansätze durchgeführt. Dazu wurde eine Auswahl an Proben getroffen. Die Abfolge der PCR Genotypisierung ist in Abb. 1 dargestellt. Alle Proben wurden 1:100 mit Aqua dest verdünnt. Der verwendete Mastermix entsprach dem im Abschnitt 3.5.1 VapA-PCR beschriebenem Ansatz. Alle folgenden PCR`s liefen über 35 Zyklen. Die Auswertung erfolgte wie bei der VapA-PCR anhand einer elektrophoretischen Auftrennung mit einem 0,8%igem Agarosegels. Die erste PCR wurde mit den Primern Fr 9 F (Fasmac, P 14A070473, 5´-CGAACCGCTCGGCTTTACGT-3´) und Fr 9 R (Fasmac, P14A070474, 5´-ACGGAATCGCCGTACACA-3´) bei einer annealing Temperatur von 54°C über 30 sec. durchgeführt. Es wurde ein PCR-Produkt mit der Größe von 500bp erwarten. Danach wurde mit allen in der FR 9 PCR positiven Proben, eine PCR mit den Primern Fr 7-9 F (Fasmac, P14B190460, 5´-TCGAGAGAATCGCACCCAT-3´) und Fr 7-9 R (Fasmac, P14B190461, 5´-CAGCTCGTAGCGCTGTTGAC-3´) bei einer annealing Temperatur von 54°C durchgeführt. Das erwartete PCR-Produkt ist hier ebenfalls 500bp groß. Als nächstes wurde mit den Proben, die hier wiederum positiv ausfielen, zwei weitere PCR-Ansätze vorgenommen, zum einen mit den Primern 1-2-3F (Fasmac, P14D220089 5´-ACCGAGACCGCGTAGGAATC-3´) und 1-2-3R (Fasmac, P 14D220090, 5´-ATCTGCCGAGGTAGGCGGAA-3´), zum anderen mit den Primern 1-2-4F (Fasmac,P14D220091 5´-ATGTCGCCCTCGACCTACTC-3´) und 1-2-3R (Fasmac, P14D220092, 5´-GGGTTTGTCGGCGGTCGATT-3´). Beide PCR´s liefen bei einer annealing Temperatur von 54°C. Bei der PCR mit den Primern 1-2-3 wurde ein PCR-Produkt mit 465bp, bei der PCR mit den Primern 1-2-4 ein Produkt mit der Größe 417bp erwartet. Die positiven Proben wurden weiter mittels der Primern ORF 33F (Fasmac, P 14D280124 5´-TCGCCGTTGTTGACGATGTA-3´), ORF 33R (Fasmay, P 14D280125 5´-ATGGTCAAGTTCGCTGTCGA-3´) bei einer annealing Temperatur von 50°C untersucht. Hier sollte das PCR-Produkt 350bp groß sein. Die letzte PCR wurde mit den Primern Nr8-aF (Fasmac, P14B150053 5´-TGCGTGCGCCGACGAAGATG-3´) und Nr8-aR (Fasmac, P14B100351 5´-TGTGGTCGACGCAGTAGTTC-3´) bei einer annealing Temperatur von 55°C durchgeführt. Hier wurde ein PCR-Produkt mit 500bp erwartet.

40 3.5.6 Pulsfeldgelelektrophorese

Zu Beginn der Pulsfeldgelelektrophorese, wurden die Proben in 10ml Nährmedium angezüchtet. Das Nährmedium bestand aus 3,7g Brain Heart Infusion Broth (BD LOT 3044209, USA), 0,4g Glucose (Kanto Chemical, Cat. No.10017-00, Tokyo, Japan), 1ml Glycerin (Kanto Chemical Cat. No.01194-00, Tokyo, Japan) und 0,2ml Tween 80 (Kanto Chemical Cat. No. 40353-02, Tokyo, Japan). Anschließend wurde mit Aqua dest. auf 100ml aufgefüllt. Im Anschluss wurde die Lösung in 50ml Zentrifugen-Röhrchen (Greiner 227261, Kremsmüster, Österreich) zu je 10ml aliquotiert und dann autoklaviert (Autoklav TOMY LSX-700, high pressure steam sterilizer, Japan).

Danach wurde das Medium mit 100µl der Isolate beimpft und über 36h bei 37°C und leichtem Schütteln (Inkubator Advantec CI-612, Japan) inkubiert.

Nach 36h wurden die Kulturen für 15min bei 3000rpm und 4°C zentrifugiert (Beckman Caulter Allegra X 30R Centrifuge, USA). Nach Beendigung der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen. Im Anschluss folgte ein Waschschritt.

Dazu löste man die Zellpellets durch vortexen in 10ml Wasch-Puffer (siehe Anhang) (Scientific Industries Vortex Genie 2, USA) und zentrifugierte (Beckman Caulter Allegra X 30R Centrifuge, USA) danach für 15min bei 3000rpm und 4°C. Im Anschluss wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 1ml Wasch-Puffer aufgenommen und sorgfältig resuspendiert.

Im nächsten Schritt wurde die optische Dichte (OD) photometrisch bestimmt. Dazu wurden die resuspendierten Bakterienzellen mittels Zugabe von Wasch-Puffer auf eine OD zwischen 0,6-0,8 OD eingestellt.

Im Anschluss wurde 1ml der verdünnten Probe mit 1ml eines bereits vorbereiteten geschmolzenen 1,5%igen Agarosegels gemischt und in Gelkammern (Bio-Rad Plug Mold, München, Deutschland) gefüllt. Diese Gelkammern wurden zuvor mit 70%igen Ethanol (Kanto Chemical, Tokyo, Japan) gereinigten. Nachdem die Gele erstarrt waren, wurden sie in ein 5ml Röhrchen (Greiner bio one Lot 1117Q132, Kremsmünster, Österreich) mit 2ml Pufferlösung (siehe Anhang) überführt.

Anschließend gab man 700µl Lysozym (Sigma Lot 061M1329, St. Gallen, Schweiz) zu und füllte das Röhrchen auf 4ml mit Pufferlösung (siehe Anhang) auf.

Der Ansatz wurde dann für 18h-21h bei 37°C im Wasserbad

41

(Taitec Personal 1, wenn nicht anders beschrieben wurde im Weiteren dieses Wasserbad verwendet) bei leichtem schütteln inkubiert.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Lösung vorsichtig abgegossen und 3ml ES-Lösung (siehe Anhang) zugefügt. Der Ansatz wurde durch vorsichtiges Invertieren gemischt und anschließend für 10min bei 37°C im Wasserbad inkubiert.

Diesen Schritt wiederholte man insgesamt dreimal. Danach wurden 4ml ES-Lösung und 30µl Proteinase K Lösung (siehe Anhang) hinzugefügt. Der Ansatz wurde sorgfältig gemischt und dann für weitere 24h bei 50°C im Wasserbad bebrütet.

Nach Ablauf der 24h wurde die Lösung verworfen und die Trägergele unter Zugabe von 3ml ES Puffer für 10min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Diesen Schritt wiederholte man dreimal. Im Anschluss erfolgte ein weiterer Waschschritt. Dazu legte man 2ml TE-Puffer (siehe Anhang) in ein neues Röhrchen vor und überführte ein Trägergel in den TE-Puffer. Das Gel wurde durch invertieren gewaschen und bei 37°C, 10min bebrütet. Anschließend wurde die Lösung verworfen. Dieser Vorgang wurde siebenmal wiederholt.

Im Weiteren folgte ein Restriktionsverdau. Der Mastermix für 10 Proben bestand aus 12µl VSPⅠ Enzym (Thermo Scientific Lot 00099656, USA) mit 120µl 10x Puffer (Thermo Scientific Lot 00099706, USA) und 868µl Aqua dest. Anschließend wurden je 100µl Mastermix vorgelegt und ein Trägergel hinzugefügt. Danach wurde der Ansatz bestehend aus Gel und Mastermix für 2h auf Eis und im Anschluss bei 37°C über Nacht (Advantec Incubator CI-612, Japan) inkubiert.

Als nächsten Schritt wurden 3g Agarose (GE Healthcare Bio-Science Lot 17-0554-02) mit 200ml 0,5x TBE Puffer (siehe Anhang) gemischt und in der Mikrowelle geschmolzen. Anschließend wurde damit ein Gelschiffchen (Bio Rad, München, Deutschland) befüllt und bis zum Erstarren ruhen gelassen.

Für die Auswertung der Proben wurde der DNA Marker von Bio Rad Cat 170-3635

42

Gelkammer (Bio Rad Gel Electrophoresis Cell 275BR15348, München Deutschland) gefüllt und im Anschluss das Gel eingesetzt. Danach ließ man das Gel für 30h im Pulsfeld (Bio Rad CHEF Mapper Power modul, 804BR1615, München, Deutschland) wandern. Das Pulsfeld wurde nach der sogenannten “CHEF-Methode”: -Contour clamped homogeneous electric field- erzeugt.

Im Anschluss wurde das Gel für 10min in 5ml verdünnter 30µg/ml Ethidiumbromid- Lösung (Nacalai tesque Lot. MOH 6164, Japan) und 300ml Aqua dest gefärbt. Zum Schluss wurde es zweimal 15min in Aqua dest gewaschen und dann unter UV-Licht fotografiert (Kamera, Mamiya RB 67 Pro SD, Japan).

Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des DNA Markers, anhand dessen konnte die Größe der Banden bestimmt werden. Desweitern wurden die Referenzstämme ATCC3701 und 222 eingesetzt. Die Bandenmuster der Referenzstämme wurden mit dem Bandenmuster der zu untersuchenden Isolate verglichen. Zusätzlich wurden weitere Bandenmuster von Proben aus dem Fundus der Kitasato Universität, Japan zum Vergleich eingesetzt.

43 Abb. 1 Fließdiagramm der Probenanalyse

44

Abb. 1 Nach Bakterienanzucht wurde für jede Probe der Virulenznachweis mittels VapA PCR durchgeführt. Außerdem wurden alle Proben mittels

EcoRⅠVerdau genotypisiert, sowie durch Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) pulsotypisiert. Die Proben, welche im EcoRⅠVerdau wegen einem unklaren Schnittmuster nicht sicher genotypisiert werden konnten, wurden über PCR genotypisiert. Die verwendeten Primer, sowie die sich daraus ergebenden Genotypen sind detailliert aufgeführt.

45

4 Ergebnisse

Es wurden in dieser Studie 136 Proben untersucht. 24 Proben davon stammten von Fohlen, die alle auf einem Gestüt aufgezogen wurden. Diese Fohlen wurden alle klinisch, hämatologisch und ultrasonographisch untersucht. Falls von der physiologischen Norm abweichende Befunde in der ultrasonographischen Untersuchung festgestellt wurden, fand anschließend eine Endoskopie, mit Entnahme von Tracheobronchialsekret (TBS) statt. Ursprünglich wurden 100 Fohlen endoskopiert, da nur bei 24 Proben R. equi isoliert wurde, werden im weiteren Verlauf nur Angaben zu den R. equi positiven Isolaten gemacht.

Zusätzlich wurden 3 Bodenproben von häufig durch Fohlen genutzte Flächen vom selben Gestüt entnommen. Des Weiteren wurden 109 Proben von Laboren aus ganz Deutschland zur Verfügung gestellt.

4.1 Ergebnis der Untersuchung der gestütsinternen Proben

4.1.1 Allgemeine Angaben zu den Probanden

In diese Studie wurden 24 Fohlen von einem Gestüt eingeschlossen, bei denen in der ultrasonographischen Untersuchung Abweichungen von der physiologischen Norm festgestellt wurden. Darunter befanden sich 16 männliche und 8 weibliche Tiere (siehe Tab. 9-Tab. 13 im Anhang). Im Anschluss an die ultrasonographische Untersuchung erfolgte die Entnahme von Tracheobronchialsekret (TBS). Das entnommene TBS wurde in Kohlemedium verbracht und zur kulturellen Untersuchung an das Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover geschickt. Die Probenentnahme erfolgte von Mai 2014 bis Mai 2015.

Das Alter der Studientiere lag im Schnitt bei 60 Tagen. Das jüngste endoskopierte Fohlen war 34 Tage, das älteste war 93 Tage alt (Abb. 2).

46

Abb. 2 Übersicht über Alter und Anzahl der untersuchten Fohlen [N=24]

(Angabe in Tagen). Die Fohlen wurden in Altersklassen zusammengefasst.

Ein Intervall von 10 Tagen bildete dabei eine Altersklasse. Die jüngste Gruppe war zwischen 31-40 Tage alt, die Älteste 91-100. Die meisten der untersuchten Fohlen [n=8] waren zwischen 41 und 50 Tage alt.

4.1.2 Ergebnis der klinischen-, hämatologischen- und sonographischen Untersuchung der gestütseigenen Fohlen

4.1.2.1 Befunde der Allgemeinuntersuchung

Die Befunde der klinischen Untersuchung wurden anhand des klinischen Scores modifiziert nach Ohnesorge et. al. (1998) eingeteilt. Mit Hilfe dieses Scores ist es möglich die Lungenerkrankung nach dem Schweregrad der Veränderung einzustufen. Alle 24 Fohlen lagen im Bereich von 1-4, wobei 0-1 als lungengesund, 2-3 als geringgradig und 4-5 als mittelgradig erkrankt eingestuft wird.

Insgesamt 6 der untersuchten Fohlen, wurden anhand der klinischen Untersuchung als lungengesund eingestuft. 14 der Fohlen waren geringgradig und 4 mittelgradig erkrankt (siehe Abb. 3).

3

31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100

[n] Fohlen

Alter in Tagen

47

Abb. 3 Anzahl der untersuchten Fohlen [N=24] mit Einteilung in den klinischen Score (Beurteilung nach OHNESORGE et al.1998) von eins bis vier am Tag der Diagnosestellung Pneumonie. Je höher der Score, desto

ausgeprägter der Schweregrad der respiratorischen Symptome.

Der Median für den klinischen Score liegt bei einem Wert von 2.

Zusätzlich zur Erfassung des klinischen Scores wurde die Körpertemperatur rektal bestimmt. Die mittlere Körpertemperatur lag bei 38,4°C. Die höchste gemessene Körpertemperatur lag bei 40,1°C und die niedrigste 37,8°C. Die Einzelwerte sind den Tab. 9 bis Tab. 13 im Anhang zu entnehmen.

4.1.2.2 Befunde der hämatologischen Untersuchung

Mit Hilfe des entnommenen venösen Blutes wurde der Leukozytengehalt in Zellen/µl Blut bestimmt. Der höchste gemessene Wert der Leukozytenzahl lag bei 24.800 Zellen/µl Blut. Der niedrigste bestimmte Wert lag bei 6.800 Zellen/µl Blut. Der Mittelwert der Blutleukozytenzahl betrug 13.192  4.305 Zellen/µL Blut.

6

48

4.1.2.3 Befunde der ultrasonographischen Untersuchung

Die im Anschluss an die klinische Untersuchung erfolgende ultrasonographische Untersuchung diente der Bestimmung des Abszess-Scores. Dieser wurde aus der Summe der Größe aller Abszesse in cm bestimmt. Bei den 24 Fohlen wurde im Median ein Abszess-score von 6cm nachgewiesen. Der größte Abszess-score lag bei 11,5 cm, der kleinste 1,5 cm (Abb. 4).

Abb. 4 Angabe über das Ausmaß des Abszess-Scores (in cm) der untersuchten Fohlen [N=24] zum Zeitpunkt der Diagnosestellung Pneumonie.

Der Abszess-Score setzt sich aus der Summe der einzelnen

ultrasonographisch nachgewiesenen und vermessenen Abszesse in cm zusammen. Zur besseren Übersicht über die Verteilung wurden Abszess-Score Gruppen gebildet. Jede Gruppe hat einen Umfang von 1cm.

2

1,1-2 2,1-3 3,1-4 4,1-5 5,1-6 6,1-7 8,1-9 9,1-10 10,1-11 11,1-12

[n] Fohlen

Abszess-Score in cm

49

4.1.3 Nachweis von R. equi aus Tracheobronchialsekret der gestütsinternen Proben

Von den ursprünglich 100 untersuchten Fohlen konnte bei 24 Tieren (24%) R. equi nachgewiesen werden (siehe Tab. 14 im Anhang). Bei sieben Fohlen (7%) wurde ein geringgradiger (ggr), bei neun Fohlen (9%) ein mittelgradiger (mgr) und bei acht Fohlen (8%) ein hochgradiger (hgr) Keimgehalt festgestellt (Abb. 5). Bei 76% der ursprünglich untersuchten Proben fiel der Nachweis auf R. equi negativ aus.

Abb. 5 Keimgehalt im Tracheobronchialsekret der gestütseigenen Fohlen [N=100]. Negativ bedeutet es konnte kein R. equi nachgewiesen werden, dies war bei 76 Isolaten der Fall. Bei den restlichen 24 Isolaten konnte R.

equi in einem unterschiedlichem Keimgehalt nachgewiesen werden.

76

7 9 8

0 10 20 30 40 50 60 70 80

negativ geringgradig mittelgradig hochgradig

[n] Fohlen

nachgewiesener Keimgehalt an R. equi

50

Die Probenentnahme erfolgte im Mai, Juni, Juli, August, September, Oktober und November 2014, sowie im März, April und Mai 2015. Die meisten R. equi positiven Proben wurden in Juni, Juli, August 2014 und im April und Mai 2015 entnommen. Die Mehrheit der R. equi negativen Tiere wurde im September, Oktober und November 2014 beprobt (Abb. 6).

Abb. 6 Numerische Auflistung (positive/negative) der R. equi Nachweise aus dem Tracheobronchialsekret (TBS) der gestütseigenen Fohlen [N=100]

in Abhängigkeit des Entnahme-Monats. Die Höhe der Balken entspricht der gesamt Probenanzahl pro Monat. Das Ergebnis des mikrobiologischen R.

equi Nachweises ist über die verschiedenen grauen Bereiche definiert.

Hellgrau entspricht einem negativen mikrobiologische Nachweis, dunkelgrau einem positiven R. equi Nachweis.

0 5 10 15 20 25

Mai 2014 Juni 2014 Juli 2014 August 2014 September 2014 Oktober 2014 November 2014 März 2015 April 2015 Mai 2015

[n] Proben

Monat der Entnahme

Negativ Positiv

51

Im Vergleich der Tiere mit positiven und negativen R. equi Nachweis konnte kein Unterschied in der klinischen, hämatologischen oder ultrasonographischen Untersuchung festgestellt werden (Tab. 4).

Tab. 4 Vergleich der R. equi positiven und negativen Fohlen im Bezug auf die klinische, hämatologische und ultrasonographische Untersuchung

Positiver Rhodococcus equi Befund

Negativer Rhodococcus equi Befund

Anzahl der Tiere [n] 24 76

Median klinischer Score 2 2

Mittelwert Leukozytenzahl

[Zellen/µl Blut] 13.192 14.242

Median Abszessscore [cm] 6 6

4.2 Nachweis von R. equi aus Bodenproben

Es wurden 15 Bodenproben im April 2015 von verschiedenen, häufig genutzten Standorten, darunter Sand-Paddocks, Treibgängen und Weiden entnommen.

Davon wurden drei Proben (20%) positiv auf R. equi getestet. Alle drei Proben wiesen einen geringgradigen Keimgehalt auf (siehe Tab. 15 im Anhang).

52 4.3 Übersicht über die externen Proben

Insgesamt wurden 109 externe Proben (siehe Tab. 16-Tab. 22 im Anhang), bei denen bereits R. equi nachgewiesen wurde, untersucht. Vier der Proben stammten aus dem Institut für Mikrobiologie, der Stiftung Tierärztliche Hochschule (Hannover), 16 Isolate von Laboklin (Bad Kissingen), neun Isolate von Idexx (Ludwigsburg), 63 Proben vom Institut für Mikrobiologie der Justus-Liebig Universität (Gießen) und 17 Isolate aus dem Labor Böse (Harsum) (Tab. 5).

Tab. 5 Übersicht über Herkunft und Anzahl der externen Proben

Herkunft Proben Anzahl [n]

TiHo Hannover 4

Laboklin ( Bad Kissing) 16

Idexx (Ludwigsburg) 9

JLU Gießen 63

Labor Böse (Harsum) 17

Ingesamt 109

53

Unter den externen Proben befanden sich 75 Isolate von Pferden, sieben Isolate von Katzen, 16 von Hunden, drei von Rindern, ein Isolat vom Vogel, drei von Reptilien und vier Isolate waren unbekanntem Ursprungs (Abb. 7).

75

7

16

3 1 3 4

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Pferd Katze Hund Rind Vögel Reptilien kA

[n] Isolate

Tierart

Abb. 7 Verteilung der externen Proben [N=109] nach Tierarten.

Neben Isolaten von Säugetieren wurden auch Proben von Vögel und Reptilien von unterschiedlichen deutschen Laboren für diese Studie bereitgestellt. Bei vier Isolaten konnten keine Angabe (kA) zu der Tierart gemacht werden.

54

Die Proben wurden von verschiedenen Organen und Körperteilen entnommen. Eine Übersicht zeigt hier die Abb. 8. Die Mehrheit der Proben (47 Stück) stammt aus dem Atmungstrakt (Nase, Trachea, Lunge). Weitere vier Isolate kamen aus dem Mund- und Pharynxbereich, neun Isolate aus Kotproben und acht Isolate von Haut, Haaren, Ohren und Augen (äußere Organe). Bei 29 Isolaten ist die Entnahme Lokalisation unbekannt. Es waren keine weiteren klinischen Daten zu diesen Tieren in Erfahrung zu bringen.

Abb. 8 Verteilung der Entnahme Orte der externen eingesendeten Proben [N= 109]. Die Höhe des Balkens entspricht der Menge der gewonnen Isolate pro Körperregion. Bei 29 Proben konnten keine weiteren Angaben (kA) gemacht werden.

Atmungsorgane äußere Organe Abszesse/ Wunden Lymphknoten Mund/Rachenraum Gelenke Knochenmark Kot innere Organe kA

[n] Isolate

Lokalisation der Entnahme

55

Die ältesten externen Proben stammen, soweit bekannt, aus dem Jahr 1995, die jüngsten Proben wurden im Jahr 2015 isoliert (Abb. 9). Mit Ausnahme von 1996 bis 1998 und das Jahr 2000 liegen Isolate aus allen Jahren in diesem Zeitraum vor.

Abb. 9 Gewinnungszeitraum und Anzahl der externen Proben [N=109].

Die Höhe des Balkens entspricht der Anzahl der Isolate pro Jahr. Die Abbildung zeigt die Anzahl der externen Isolate die pro Jahr gewonnen wurden. Die Abkürzung kA steht für keine Angaben in diesem Fall ist das Isolationsjahr unbekannt.

1995 1999 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 kA

[n] Isolate

Probenisolations Jahr

56 4.4 Ergebnis der Plasmidisolierung

Insgesamt wurde bei 136 der R. equi-Isolate eine Plasmidisolierung durchgeführt. Im Anschluss an die Isolierung wurde, das Isolat unverdaut auf ein Agarosegel aufgetragen und der Größe nach aufgetrennt. Von den 136 untersuchten Isolate waren 24 gestütsintern, drei der Isolate aus Bodenproben und 109 externe Isolate.

Bei 23 (95,8%) der 24 gestütsinternen Isolate, bei allen Bodenisolaten (100%) und bei 82 (75,2%) der 109 externen Isolate wurden Plasmide nachgewiesen (Tab. 6).

Insgesamt wurde das Plasmid bei 108 R. equi-Isolaten nachgewiesen.

Tab. 6 Anzahl der R. equi-Isolate und den Anteil der Plasmid positiven Isolate.

Isolatursprung Gesamtzahl der Isolate [N]

Isolate mit positivem

Plasmidnachweis Prozentangaben gestütsinterne

Isolate 24 23 95,8%

externe Isolate 109 82 75,2%

Bodenisolate 3 3 100%

57

Von den 75 externen Pferde-Isolaten wurden 65 (86,7%) positiv auf einen Plasmid getestet. Bei den sieben Isolaten aus Katzen waren drei (42,9%) positiv. Bei den 16 Isolaten, die vom Hund stammten, wurde bei sieben Tieren (43,8%) ein Plasmid nachgewiesen. Die Isolate vom Rind waren zu 66,7% positiv, das entspricht einem

Von den 75 externen Pferde-Isolaten wurden 65 (86,7%) positiv auf einen Plasmid getestet. Bei den sieben Isolaten aus Katzen waren drei (42,9%) positiv. Bei den 16 Isolaten, die vom Hund stammten, wurde bei sieben Tieren (43,8%) ein Plasmid nachgewiesen. Die Isolate vom Rind waren zu 66,7% positiv, das entspricht einem

Im Dokument Genotypisierung von Rhodococcus equi Stämmen aus Deutschland, isoliert bei Fohlen und anderen Tierarten (Seite 36-0)