Es wurden 15 Bodenproben im April 2015 von verschiedenen, häufig genutzten Standorten, darunter Sand-Paddocks, Treibgängen und Weiden entnommen.
Davon wurden drei Proben (20%) positiv auf R. equi getestet. Alle drei Proben wiesen einen geringgradigen Keimgehalt auf (siehe Tab. 15 im Anhang).
52 4.3 Übersicht über die externen Proben
Insgesamt wurden 109 externe Proben (siehe Tab. 16-Tab. 22 im Anhang), bei denen bereits R. equi nachgewiesen wurde, untersucht. Vier der Proben stammten aus dem Institut für Mikrobiologie, der Stiftung Tierärztliche Hochschule (Hannover), 16 Isolate von Laboklin (Bad Kissingen), neun Isolate von Idexx (Ludwigsburg), 63 Proben vom Institut für Mikrobiologie der Justus-Liebig Universität (Gießen) und 17 Isolate aus dem Labor Böse (Harsum) (Tab. 5).
Tab. 5 Übersicht über Herkunft und Anzahl der externen Proben
Herkunft Proben Anzahl [n]
TiHo Hannover 4
Laboklin ( Bad Kissing) 16
Idexx (Ludwigsburg) 9
JLU Gießen 63
Labor Böse (Harsum) 17
Ingesamt 109
53
Unter den externen Proben befanden sich 75 Isolate von Pferden, sieben Isolate von Katzen, 16 von Hunden, drei von Rindern, ein Isolat vom Vogel, drei von Reptilien und vier Isolate waren unbekanntem Ursprungs (Abb. 7).
75
7
16
3 1 3 4
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Pferd Katze Hund Rind Vögel Reptilien kA
[n] Isolate
Tierart
Abb. 7 Verteilung der externen Proben [N=109] nach Tierarten.
Neben Isolaten von Säugetieren wurden auch Proben von Vögel und Reptilien von unterschiedlichen deutschen Laboren für diese Studie bereitgestellt. Bei vier Isolaten konnten keine Angabe (kA) zu der Tierart gemacht werden.
54
Die Proben wurden von verschiedenen Organen und Körperteilen entnommen. Eine Übersicht zeigt hier die Abb. 8. Die Mehrheit der Proben (47 Stück) stammt aus dem Atmungstrakt (Nase, Trachea, Lunge). Weitere vier Isolate kamen aus dem Mund- und Pharynxbereich, neun Isolate aus Kotproben und acht Isolate von Haut, Haaren, Ohren und Augen (äußere Organe). Bei 29 Isolaten ist die Entnahme Lokalisation unbekannt. Es waren keine weiteren klinischen Daten zu diesen Tieren in Erfahrung zu bringen.
Abb. 8 Verteilung der Entnahme Orte der externen eingesendeten Proben [N= 109]. Die Höhe des Balkens entspricht der Menge der gewonnen Isolate pro Körperregion. Bei 29 Proben konnten keine weiteren Angaben (kA) gemacht werden.
Atmungsorgane äußere Organe Abszesse/ Wunden Lymphknoten Mund/Rachenraum Gelenke Knochenmark Kot innere Organe kA
[n] Isolate
Lokalisation der Entnahme
55
Die ältesten externen Proben stammen, soweit bekannt, aus dem Jahr 1995, die jüngsten Proben wurden im Jahr 2015 isoliert (Abb. 9). Mit Ausnahme von 1996 bis 1998 und das Jahr 2000 liegen Isolate aus allen Jahren in diesem Zeitraum vor.
Abb. 9 Gewinnungszeitraum und Anzahl der externen Proben [N=109].
Die Höhe des Balkens entspricht der Anzahl der Isolate pro Jahr. Die Abbildung zeigt die Anzahl der externen Isolate die pro Jahr gewonnen wurden. Die Abkürzung kA steht für keine Angaben in diesem Fall ist das Isolationsjahr unbekannt.
1995 1999 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 kA
[n] Isolate
Probenisolations Jahr
56 4.4 Ergebnis der Plasmidisolierung
Insgesamt wurde bei 136 der R. equi-Isolate eine Plasmidisolierung durchgeführt. Im Anschluss an die Isolierung wurde, das Isolat unverdaut auf ein Agarosegel aufgetragen und der Größe nach aufgetrennt. Von den 136 untersuchten Isolate waren 24 gestütsintern, drei der Isolate aus Bodenproben und 109 externe Isolate.
Bei 23 (95,8%) der 24 gestütsinternen Isolate, bei allen Bodenisolaten (100%) und bei 82 (75,2%) der 109 externen Isolate wurden Plasmide nachgewiesen (Tab. 6).
Insgesamt wurde das Plasmid bei 108 R. equi-Isolaten nachgewiesen.
Tab. 6 Anzahl der R. equi-Isolate und den Anteil der Plasmid positiven Isolate.
Isolatursprung Gesamtzahl der Isolate [N]
Isolate mit positivem
Plasmidnachweis Prozentangaben gestütsinterne
Isolate 24 23 95,8%
externe Isolate 109 82 75,2%
Bodenisolate 3 3 100%
57
Von den 75 externen Pferde-Isolaten wurden 65 (86,7%) positiv auf einen Plasmid getestet. Bei den sieben Isolaten aus Katzen waren drei (42,9%) positiv. Bei den 16 Isolaten, die vom Hund stammten, wurde bei sieben Tieren (43,8%) ein Plasmid nachgewiesen. Die Isolate vom Rind waren zu 66,7% positiv, das entspricht einem Plasmidnachweis bei zwei der drei Isolate. Bei den Isolaten der drei Repitilien wurde ein Tier positiv auf einen Plasmid getestet. Bei der einzelnen Probe vom Vogel wurde kein Plasmid nachgewiesen (Abb. 10). Insgesamt wurden 99 Proben vom Pferd auf das Vorkommen eines Plasmids untersucht, davon wurde bei 88 Proben (88%) Plasmide nachgewiesen.
Abb. 10 Erweiterung von Abb. 7. Für jede Tierart der extern eingesendeten Proben [N=109] ist die Anzahl der Isolate (dunkelgrauer Balken),
sowie die davon Plasmid tragenden Proben (hellgrauer Balken) dargestellt.
Bei vier Isolaten konnte keine Angabe (kA) zu der Tierart gemacht werden.
75
Anzahl der Isolate positiver Plasmidnachweis
58
4.5 Ergebnis des VapA- und VapB-Nachweis
Es wurden 24 gestütsinternen R. equi-Isolate auf das Vorkommen des VapA-Gens untersucht. Diese Untersuchung wurde mittels einer PCR durchgeführt. Das VapA-Gen wurde bei 23 der 24 untersuchten Isolate anhand eines 500bp großem PCR-Produkt nachgewiesen. Bei 70 der externen Isolate wurde das VapA-Gen isoliert (Tab. 7). Bei zwei Isolaten (Nr. 212 und 214) war die VapA-PCR positiv, obwohl kein Plasmid isoliert wurde. Von den drei R. equi positiven Bodenproben, welche einen Plasmid tragen, konnte nur bei einer Probe das VapA- Gen nachgewiesen werden.
VapB wurde bei keiner Probe nachgewiesen.
Tab. 7 Gesamtzahl der Isolate und die quantitative Angabe der VapA positiven Isolate.
Probenursprung Gesamtzahl der
Isolate [N] VapA positive Isolate Prozentangaben gestütsinterne
Proben 24 23 95,8%
externe Proben 109 70 64,2%
Bodenproben 3 1 33%
Der VapA-Nachweis gelang bei den externen Proben nur bei Isolaten von Pferden und Katzen. Zusätzlich waren drei der Isolate, ohne weitere Angaben, VapA positiv.
Bei den restlichen 39 Proben wurde das VapA-Gen nicht nachgewiesen (Abb. 11).
Bei 65 der 75 externen Isolate vom Pferd konnte VapA nachgewiesen werden, folglich können 86,7% der externen Proben vom Pferd als virulent eingestuft werden.
Bei den Isolaten von Katzen wurde bei zwei Proben VapA nachgewiesen.
Insgesamt wurden in der Studie vom Pferd 99 R. equi positive Isolate untersucht, davon waren 88 (88,9%) VapA positiv.
59
Abb. 11 Erweiterung von Abb. 10. Für jede Tierart der extern eingesendeten Proben [N=109] ist die Anzahl der Isolate (dunkelgrauer Balken), sowie die davon Plasmid tragenden Proben (hellgrauer Balken) dargestellt. Die Proben bei denen ein Plasmid nachgewiesen werden konnte, wurden mittels PCR auf das VapA Gen überprüft (mittelgrauer Balken). Die Abkürzung kA steht für keine Angaben in diesem Fall ist die Tierart unbekannt.
4.6 Nachweis kryptischer Plasmide bei den externen Proben und den Bodenproben
Bei 14 der externen Proben konnten zwar Plasmide nachgewiesen werden, allerdings gelang der Nachweis von VapA und VapB bei diesen Proben nicht.
Deshalb handelt es sich hier um kryptische Plasmide. Sieben dieser Proben stammten vom Hund (43,8% aller Proben vom Hund), zwei jeweils vom Pferd (2,7%
aller externen Proben vom Pferd) und Rind (66,7% aller Proben vom Rind). Jeweils ein Isolat von den insgesamt sieben Katzen- und ein Isolat der drei Reptilien-Proben (14,3% aller Proben von Reptilien) wiesen ein kryptisches Plasmid auf.
Ebenso das Isolat vom Klinik-Fußboden der Uni Gießen. Auch von den drei positiven
75
Anzahl der Isolate positiver Plasmidnachweis VapA positiv
60
Bodenproben vom Gestüt konnten bei zwei Proben Plasmide mit unbekannter Funktion nachgewiesen werden.
4.7 Bestimmung des Genotyps der R. equi-Isolate
Bei den 23 internen Proben, die zuvor sowohl einen Plasmid wie auch das VapA-Gen aufwiesen, wurde bei 20 Proben der VapA-Genotyp 85kbⅠfestgestellt. Drei der Proben (Proben-Nr.: 8, 91, 99) zeigten das Schnittmuster eines 87kb TypⅠPlasmids.
Die Abb. 12 zeigt das Ethidiumbromid gefärbte Agarosegelbild einer elektrophoretischen Auftrennung des Restriktionsverdaus durch EcoRⅠ. Darauf sind vergleichend die Genotypen 85Ⅰ und 87Ⅰ dargestellt. Die Proben-Nummern sind im oberen Bildbereich angegeben, der Genotyp im unteren Bildbereich.
Abb. 12 Ergebnisbild eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels des Restriktionsverdaus der Proben-Nr. pos,15, 16, 18, 118, 119, 135 durch EcoRⅠ. Anhand des Schnittmusters erfolgte die Genotypisierung (unten im Bild). Bei der mit pos. gekennzeichnet Probe handelt es sich um die
Positivkontrolle (ATCC33701 mit einem 85kb Typ ⅠPlasmid). Als
Negativkontrolle (neg) wurde statt DNS H2O mit dem Mastermix inkubiert.
Der Größenstandard wurde mittels Positivkontrolle ermittelt. Die Fragmentgrößen sind in bp angegeben.
pos. 135 15 16 18 118 119 neg.
Proben-Nr.:
27,454bp
85Ⅰ 85Ⅰ 85Ⅰ 85Ⅰ 85Ⅰ 87Ⅰ 85Ⅰ
10,108bp 7,648bp
5,213bp 15,382bp
6,735bp
4,920bp
61
70 der externen Proben wurden mittels eines Restriktionsverdaus mit EcoRⅠuntersucht. Dabei konnten 57 Proben dem Genotyp 85Ⅰ zugeordnet werden. Weitere neun Proben (Proben-Nr.: 118, 120, 123, 137, 141, 142, 167, 168, 215) wurden dem Genotyp 87Ⅰzugeordnet. Zusätzlich konnten bei den externen Proben zwei neue Genotypen definiert werden. Bei Isolat Nr. 130 wurde das Plasmid mit der Größe 85kb mit einem neuen Schnittmustertyp Ⅵ ermittelt. Bei diesem Isolat handelt es sich um eine Probe vom Pferd, wobei keine weiteren Angaben bezüglich Erkrankung oder Entnahme Lokalisation bekannt sind. Bei Isolat Nr. 200 wurde der Genotyp 85kb TypⅦ bestimmt. Diese Probe stammt ebenfalls vom Pferd und wurde aus einem Tracheobronchialsekret gewonnen. Zur Kontrolle wurde eine Auswahl an Isolaten einer PCR-Genotypisierung (Ergebnisse siehe Kapitel 4.8) unterzogen.
Bei zwei Proben (Nr. 212 und 214), bei denen ein VapA-Nachweis gelang, jedoch zuvor der Plasmid Nachweis negativ ausfiel konnte kein Genotyp nachgewiesen werden. Deshalb schieden diese zwei Isolate aus dem weiteren Verlauf der Studie aus.
62
Insgesamt wurden 91 Proben über einen Restriktionsverdau charakterisiert.
Davon wiesen 77 Isolate (84,6%) den 85kb TypⅠGenotyp auf. 12 Isolate (13,1%) der Proben, die mittels Restriktionsverdau untersucht wurden, wiesen einen 87kb TypⅠ Plasmid auf. Bei zwei der untersuchten Proben konnten neue Genotypen identifiziert werden (Abb. 13).
Abb. 13 Prozentualer Anteil der nachgewiesenen Genotypen [N=91].
Insgesamt wurden 91 Isolate untersucht, davon wiesen 84,6% der Isolate den Genotyp 85Ⅰauf, der Genotyp 87Ⅰ konnte bei 13,1% der Isolate nachgewiesen werden. Die beiden Genotypen 85Ⅵ und 85Ⅶ konnten bei 1,1% der Isolate festgestellt werden.
84,6%
13,1%
1,1% 1,1%
85Ⅰ 87Ⅰ 85Ⅵ 85Ⅶ Genotypen:
63
Der Genotyp 85Ⅰwurde aus den externen Proben beim Pferd 53mal, bei der Katze einmal und bei Proben ohne weitere Angaben dreimal nachgewiesen. Der Genotyp 87Ⅰ wurde beim Pferd acht- und bei der Katze einmal isoliert (Abb. 14).
Abb. 14 Diagramm zur Übersicht der Ergebnisse der externen Isolate. Für jede Tierart der extern eingesendeten Proben [N=109] ist die Anzahl der Isolate (horizontal gestreifter Balken), sowie die davon Plasmid tragenden Proben (vertikal gestreifter Balken) dargestellt. Die Proben bei denen ein Plasmid nachgewiesen werden konnte, wurden mittels PCR auf das VapA Gen überprüft (hellgrauer Balken). Alle virulenten (VapA- tragenden) Isolate wurden mittels Restriktionsverdau auf ihren Genotypen untersucht. Die am häufigsten vorkommenden Genotypen waren 85Ⅰ(dunkelgrauer Balken) und 87Ⅰ(mittelgrauer Balken). Die Abkürzung kA steht für keine Angaben in diesem Fall ist die Tierart unbekannt.
75
Anzahl der Isolate positiver Plasmidnachweis
VapA positiv 85Ⅰ
87Ⅰ
64 4.8 Ergebnis der PCR-Genotypisierung
Um die Ergebnisse des Restriktionsverdaus zu überprüfen wurde eine PCR- Genotypisierung durchgeführt. Dazu wurden zehn Isolate ausgewählt, die anhand des Restriktionsverdaus nicht eindeutig einem Genotyp zugeordnet werden konnten.
Proben-Nr. 8, 28, 117, 118, 119, 128, 129, 130, 133, 142. In der ersten PCR mit den Primern FR9 waren alle untersuchten Proben positiv. In der nächsten PCR mit den Primern FR7-9 waren die Proben-Nr. 8, 118 und 142 negativ, d.h. es konnte kein PCR Ergebnis nachgewiesen werden (siehe Abb. 15). Deshalb können diese Proben aufgrund der PCR dem Genotyp 87Ⅰ oder 87Ⅲ zugeordnet werden. Mit Hilfe des Schnittmusters aus dem Restriktionsverdau konnte der Genotyp 87Ⅲ ausgeschlossen werden. Aus diesem Grund sind die drei Proben dem Genotyp 87Ⅰzuzuordnen.
Abb. 15 Ergebnisbild eines mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegels der PCR Genotypisierung mit dem Primer FR7-9. Es wurden die Proben 28, 128, 129, 130, 133, 118, 119, 142, pos untersucht. Bei der Probe pos handelt es sich um den Positivkontroll-Stamm ATCC33701 mit einem 85kb Typ ⅠPlasmid, diese Bande wurde als Größenstandard (500bp) verwendet. Das positive (+) oder negative (-) Ergebnis der PCR ist für jede Probe aufgeführt. Als Negativkontrolle (neg) wurde statt DNS H2O mit dem Mastermix inkubiert.
Proben-Nr.:
128 129 130 133 118 119 28 142 pos. neg.
+ + + + - + + - + - +
500bp
65
Die verbleibenden Proben 28, 117, 119, 128, 129, 130 und 133 waren in allen folgenden PCR`s mit den Primern 1-2-3,1-2-4, ORF33, Nfr8-a positiv (siehe Abb. 16) und gehören somit zu den Genotypen 85Ⅰ, 85Ⅲ oder 85Ⅳ.
Da diese drei Genotypen ein unterschiedliches Bild im Restriktionsverdau mit EcoRⅠzeigen konnten alle Proben, bis auf die Probe 130, dem Genotyp 85Ⅰzugeordnet werden. Die Probe 130 zeigt im Restriktionsverdau ein abweichendes Muster, bisher nicht nachgewiesenes Schnittmuster.
Abb. 16 Ergebnisbild eines mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegels der PCR Genotypisierung mit dem Primer Nrf8-a. Es wurden die Proben 117, 128, 129, 130, 133, 118, 119, 28, pos untersucht. Bei der Probe pos.
handelt es sich um den Positivkontroll-Stamm ATCC33701 mit einem 85kb Typ ⅠPlasmid, diese Bande wurde als Größenstandard (500bp)
verwendet. Das positive (+) oder negative (-) Ergebnis der PCR ist für jede Probe aufgeführt. Als Negativkontrolle (neg.) wurde statt DNS H2O mit dem Mastermix inkubiert.
28 119
133 130
128 129 117
Proben-Nr.:
pos. neg.
500bp
+ + + + + + + + -
66 4.9 Ergebnis der PFGE
Die 20 internen Isolaten, bei denen ein 85kb TypⅠPlasmid nachgewiesen wurde, konnte in sieben verschiedene Pulsotypen unterteilt werden. Sieben Isolate wiesen einen B1 Pulsotyp auf, weitere vier Isolate einen Pulsotyp C. Jeweils zwei Proben wiesen einen Pulsotyp A1 und D auf. Insgesamt drei Isolate konnten dem Pulsotyp F1 zugeordnet werden. Nur jeweils eine Probe wies den Pulsotypen A3 und A4 auf.
Die Pulsotypen können in eine der Haupt- und eine Nebengruppe eingeteilt werden, je nach Häufigkeit des Nachweises. Zu der Hauptgruppe zählen die Pulsotypen B1, C und F1. Die kleinere Gruppe mit den weniger häufigen Isolaten beinhaltet die Pulsotypen A1, A3, A4 und D (Abb. 17).
Abb. 17 Pulsotypen der gestütsinternen Isolate mit dem Genotyp 85kb TypⅠ [N=20]. Jeder Balken steht für einen von sieben Pulsotypen (A1, A3, A4, B1, C, D, F1). Die Höhe des Balkens steht für Anzahl der Isolate mit dem
jeweiligen Pulsotyp.
Pulsotypen der internen Isolate (Genotypen 85Ⅰ)
67
Die drei 87kb Typ ⅠIsolate der internen Proben wiesen alle den Pulsotypen B auf.
Die auf dem Gestüt entnommene Bodenprobe wies als einzige Probe den Pulsotyp L1 auf.
Bei den 57 externen Proben mit dem Plasmid 85Ⅰ konnten 22 verschiedene Pulsotypen nachgewiesen werden. Am häufigsten trat der Pulsotyp A1 mit 21 Isolaten auf. Bei fünf Isolaten konnte ein Pulsotyp B2 nachgewiesen werden. Jeweils drei Proben wiesen den Pulsotyp A2 und B3 auf. Nur zwei Isolate wiesen den Pulsotypen A7, B1 und F2 auf. Die verbleibenden 15 Isolate verteilen sich auf 15 Pulsotypen A3, A4, A5, A6, A8, A9, D, E, F1, G, H, I, J, K, L2. Auch hier macht eine Einteilung in eine Hauptgruppe und eine Nebengruppe Sinn. Die Hauptgruppe beinhaltet die Pulsotypen A1, B2, A2 und B3. Die Nebengruppe setzt sich aus A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, B1, D, E, F1, F2, G, H, I, J, K und L2 zusammen (Abb. 18).
68
Abb. 18 Pulsotypen der externen Isolate mit dem Genotypen 85kb TypⅠ[N=57].
Jeder Balken steht für einen von 22 Pulsotypen (A1-A9, B1-B3, D,E, F1-F2, G, H, I, J, K, L2). Die vier Isolate mit der Bezeichnung o.Z. sind ohne
Zuordnung, d.h. sie konnten keinem Pulsotyp zugeordnet werden, da sie mit dem verwendeten Enzym nicht verdaut wurden. Die Höhe des Balkens steht für die Anzahl der Isolate mit dem jeweiligen Pulsotyp.
Vier Proben (Proben-Nr.:116, 128, 150 und 155) konnten trotz Nachweis eines 85kb TypⅠPlasmids nicht mit dem VSPⅠRestriktionsenzym verdaut werden.
Die neun Proben mit einem Plasmid 87 Typ I wiesen fünf verschiedene Pulsotypen auf, bei drei Proben konnte ein Pulsotyp A2, bei jeweils zwei Proben A1 und A3, und jeweils eine Probe wies den Pulsotyp B und C auf (Abb. 19).
32
10
1 1 3
1 1 1 1 1 1
4 0
5 10 15 20 25 30 35
A1-A9 B1-B3 D E F1-F2 G H I J K L2 o.Z.
[n] der Isolate
Pulsotypen der externen Isolate (Genotypen 85Ⅰ)
69
Abb. 19 Verteilung der Pulsotypen der externen Isolate [N=9] mit den Genotyp 87kb Typ Ⅰ.Jeder Balken steht für einen von fünf Pulsotypen (A1, A2, A3, B, C.) Die Höhe des Balkens steht für die Anzahl der Isolate mit dem
jeweiligen Pulsotyp.
2
3
2
1 1
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
A1 A2 A3 B C
[n] der Isolate
Pulsotypen der externen Isolate (Genotyp 87 Ⅰ)
70
5 Diskussion
Ziel der vorliegenden Studie war es, herauszufinden welche Genotypen des Erregers Rhodococcus equi in Deutschland auftreten. Deshalb wurden nicht nur Proben von einem Gestüt in Norddeutschland gesammelt, sondern es wurden zusätzlich Proben aus ganz Deutschland in die Studie mit einbezogen. Durch die externen Proben, unter denen sich auch Isolate von anderen Tierarten befanden, konnte zusätzlich gezeigt werden welche Genotypen bei diesen Tierarten vorkommen.
5.1 Gestütsinterne Probanden
Die Probenentnahme erfolgte im Zeitraum von Mai 2014 bis Mai 2015, sodass das Jahresspektrum der R. equi Genotypen abgedeckt wird. Die Fohlen wurden im Lauf des Jahres 2014 und 2015 geboren und wuchsen alle unter den gleichen Bedingungen auf. Für die Studie wurden 24 Fohlen ausgesucht, bei denen aufgrund klinischer, hämatologischer und ultrasonographischer Befunde eine Pneumonie diagnostiziert wurden.
Die Probanden in dieser Studie waren zwischen 34 Tage und 93 Tage alt. Dies deckt sich mit den üblichen Angaben, dass die Fohlen im Alter von 1-6 Monaten an einer R. equi-Pneumonie erkranken (GIGUÈRE u.PRESCOTT 1997, MUSCATELLO et al. 2006).
5.2 Probenentnahme
Die Probenentnahme erfolgte über den ventralen Nasengang (Meatus nasi ventralis) mit Hilfe eines flexiblen Endoskops. In das Endoskop wurde ein steriler Katheter eingebracht, der um Tier zu Tier Kontaminationen zu vermeiden nach jeder Probenentnahme gewechselt wurde. Zusätzlich wurden Endoskop und Arbeitskanal gereinigt und desinfiziert. Diese Art der Entnahme wurde gewählt, da hierbei die Trachea, die Bifurcation sowie die Menge und Viskosität des Mucus visuell beurteilt werden konnten. Zusätzlich ist diese Methode wenig invasiv und gut umsetzbar. Die Alternative zu dieser Methode stellt die transtracheale Punktion dar. Jedoch birgt diese Methode die Gefahr, der Infektion der Punktionsstelle (HASHIKURA et al. 2000).
Zusätzlich kann keine visuelle Beurteilung der Trachea und des Mucus stattfinden.
Als Vorteil der transtrachealen Punktion wird eine geringere Kontamination mit der nasalen Keimflora angesehen. Allerdings wurde im Vergleich der beiden
71
Entnahmemethoden kein signifikanter Unterschied in der Zusammensetzung der mikrobiellen Flora der entnommenen Proben festgestellt (HASHIKURA et al. 2000).
5.3 Ergebnisse
5.3.1 Nachweisrate von R. equi bei den gestütsinternen Proben
Von den insgesamt 100 endoskopierten gestütseigenen Fohlen, die an einer Pneumonie erkrankt waren, konnten nur bei 24 Tieren R. equi aus dem Tracheobronchialsekret isoliert werden. Dabei ist die Nachweisrate von R. equi aus TBS in dieser Studie deutlich geringer, als bei anderen Studien. Meist wurde von einer Nachweisrate von 61%-64% berichtet (HILLIDGE 1987, SWEENEY et al. 1987). In diesen Berichten war das Krankheitsstadium allerdings deutlich weiter fortgeschritten als in der vorliegenden Untersuchung bei der die Fohlen höchstens geringe klinische Symptome einer Atemwegserkrankung aufwiesen. Wenn größere Lungenbereiche verändert sind ist anzunehmen, dass der Erreger in den Atemwegen mehr vertreten ist und deshalb auch eher nachgewiesen wird. Wobei diese Hypothese noch nicht bestätigt wurde. Selbst in einer Studie, die auf dem gleichen Gestüt stattfand, wurden bei 54% der untersuchten und klinisch gering erkrankten Fohlen R. equi aus dem TBS isoliert (MEYER-HAMME 2004). Eine Ursache für die niedrige Nachweisrate der vorliegenden Untersuchung könnte in der Desinfektion des Endoskops liegen, eventuell wurde das Desinfektionsmittel im Arbeitskanal zu wenig ausgespült und hemmt so das Wachstum von R. equi. Ein weiteres Problem könnte auch die Begleitflora sein, die R. equi aufgrund unzureichend schneller Kühlung überwuchert und somit den Nachweis deutlich erschwert. Eine weitere Ursache könnte in der kulturellen Anzucht liegen, da hierfür kein selektives Medium eingesetzt wurde.
Studien konnten belegen, dass der Einsatz eines selektiv Mediums für die kulturelle Anzucht von R. equi hilfreich ist (WOOLCOCK et al. 1979,MAKRAI et al. 2005a). Allem voran konnte dem NANAT-Medium eine stark selektive Wirkung nachgewiesen werden (MAKRAI et al. 2005a), weshalb dieses Medium gerne bei stark kontaminierten Proben eingesetzt wird. Trotz des Einsatzes von Selektivmedien gelingt der kulturelle Nachweis von R. equi nicht immer. Deshalb kann aufgrund eines negativen R. equi Ergebnis nicht automatisch eine R. equi-Pneumonie ausgeschlossen werden. Auch in anderen Studien gelang trotz klinischer Anzeichen und dem röntgenologische oder ultrasonographischen Nachweis
72
einer Lungenerkrankung die kulturelle Anzucht von R. equi nicht (MARTENS et al. 1982, HILLIDGE 1987, SWEENEYet al. 1987).
Die meisten R. equi-Isolate wurden in der aktuellen Studie in den Monaten April, Mai, Juni, Juli und August, wenige oder keine Isolate konnten in den Monaten September, Oktober und November gewonnen werden. Zu einem liegt dies am Alter der Tiere, da Fohlen typischerweise im Alter von 31-60 Tagen erkranken (MUSCATELLO et al.
2006). Die meisten Fohlen sind gegen Ende des Jahres bereits deutlich über 60 Tage alt und erkranken seltener an einer R. equi-Pneumonie. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Keimbelastung der Luft stark von Umwelt- und Managementfaktoren abhängt (MUSCATELLO et al. 2006). Die Verunreinigung der Luft mit R. equi ist im Stall deutlich höher als zum Beispiel auf einem Paddock (MUSCATELLO et al. 2006). Weiterhin konnte in einer Studie aus Japan gezeigt werden, dass die Belastung des Erdbodens mit R. equi im Frühjahr (April und Mai) am größten ist und im weiteren Verlauf des Jahres abnimmt (TAKAI et al. 1986a).
Somit liegt die Vermutung nahe, dass die meisten Fohlen in der Zeit mit der höchsten R. equi Belastung geboren werden und dies eine Infektion mit R. equi begünstigt und somit auch den Nachweis des Erregers. Leider gibt es aktuell keine Studien aus Deutschland, bei der die Keimbelastung des Erdbodens über einen längeren Zeitraum untersucht wurde. In einer Untersuchung auf einem Gestüt in Norddeutschland wurde Stichprobenhaft die Belastung des Erdbodens im März und Juli bestimmt. Dabei konnte im März bei 56 von 64 Proben und im Juli 17 von 25 Proben positiv auf R. equi getestet werden (VENNER et al. 2007b).
5.3.1.1 Nachweisrate von R. equi von den Bodenproben
Es wurden im April 15 Bodenproben von häufig, durch Fohlen genutzten Stellen entnommen. Dazu wurde mit einem sauberen Teelöffel ca. 20g Erde in einen sterilen Becher überführt. Dabei gelang der Nachweis von R. equi bei 20% der Proben. Auch in diesem Fall liegt die Nachweisrate deutlich unter den publizierten Werten. In einer Studie vom gleichen Gestüt wurden 88 Proben nach dem gleichen Verfahren entnommen und anschließend untersucht, dabei konnte R. equi aus 86% der Proben isoliert werden. Ein vielleicht gravierender Unterschied lag in der Kultivierung der Proben, denn diese wurden mit dem NANAT-Medium kultiviert (MEYER-HAMME 2004).
In der aktuellen Studie wurden keine selektiven Nährmedien eingesetzt. Als einen
73
weiteren Grund für die geringe Nachweisrate von R. equi im Erdboden kann man den
weiteren Grund für die geringe Nachweisrate von R. equi im Erdboden kann man den