Gereinigte Antigene sind allein selten immunogen und erfordern den Zusatz von Adjuvantien, die als Substanzen definiert sind, welche die Immunogenität von Antigenen erhöhen (JANEWAY u. TRAVERS 2002). Adjuvantien können die Immunogenität der Proteine auf zwei Weisen verstärken: Erstens können sie lösliche Proteinantigene in partikuläres Material umwandeln, das die antigenpräsentierenden Zellen schneller aufnehmen. Dies geschieht etwa durch Anlagern der Antigene an Aluminiumpartikel oder durch Emulsion in mineralischem Öl. Die Umwandlung löslicher Proteine in unlösliche Partikel erhöht die Immunogenität in einem gewissen Grad, Adjuvantien wirken jedoch verhältnismäßig schwach, wenn sie nicht Bakterien oder deren Produkte enthalten, die als zweiter Faktor eines Adjuvans zur Erhöhung der Immunogenität beitragen. Das vollständige Freundsche Adjuvans ist eine Öl- und Wasseremulsion, die abgetötete Mykobakterien enthält. Andere bakterielle Adjuvantien sind abgetötete Bordetella pertussis-Bakterien, bakterielle Polysaccharide, bakterielle Hitzeschockproteine und bakterielle DNA. Die Wirkungen zeichnen sich durch eine verzögerte Antigenfreisetzung, verstärkte Aufnahme durch Makrophagen, Induktion von Costimulatoren in den Makrophagen (JANEWAY u.
TRAVERS 2002) aus. Bakterielle Zellwandbestandteile oder abgetötete Bakterien weisen den Nachteil auf, dass sie selbst als Antigene erkannt werden und damit zu ungewollten Immunantworten führen können. Moderne Adjuvantien, wie CpG-Motive,
rufen solche unerwünschten Reaktionen aufgrund der geringen Molekülgröße und der Erkennung durch spezifische Rezeptoren nicht hervor.
2.3.1 CpG-Motive
Die Fähigkeit bakterieller DNA, das Immunsystem von Säugetieren zu stimulieren, ist seit den Achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt. Die tumorunterdrückende Wirkung einzelsträngiger DNA wird durch die erhöhte Produktion der Interferone (IFN) α, β, γ und die gesteigerte Vermehrung der natürlichen Killerzellen (NK)-Zellen erklärt (TOKUNAGA et al. 1988). Als entscheidende Strukturelemente für die immunstimulierende Wirkung dieser Oligodeoxynukleotide wurde ein zentraler Cytosin-Guanosin-Kern erkannt (KRIEG et al. 1995). Die so genannten CpG-Motive sind einzelsträngige DNA-Sequenzen, die in 5’-3’-Richtung ein Cytosin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotid (CpG-Dinukleotid) besitzen, wobei am C5-Atom des Cytosins keine Methylgruppe gebunden ist. Die Inversion zu Guanosin-Cytosin oder die Methylierung der Oligodeoxynukleotide hebt die immunstimulierende Wirkung auf (HAECKER et al. 2002). Letzteres ist der Grund, warum die DNA von Wirbeltieren diese Wirkung nicht besitzt, da sie in der Regel methyliert vorliegt. Aus Bakterien, Viren oder Parasiten gewonnene natürliche DNA enthält ein Phosphodiester (PD)-Grundgerüst, während synthetisierte entweder ein PD-Rückgrat haben, das dem natürlichen nachempfunden ist, oder ein Phosphothioat (PT)-Rückgrat. Letzteres hemmt den schnellen Abbau durch ubiquitär vorkommende Nukleasen und bewirkt eine schnellere Aufnahme in Makrophagen (SESTER et al. 2000). Es bestehen Speziesunterschiede bezüglich der optimalen Sequenz der zwei flankierenden Nukleinsäuren sowohl in 3’-Richtung als auch in 5’-Richtung und sie haben entscheidenden Einfluss auf die Immunantwort. So wurde bislang für folgende Spezies die entsprechende „beste“ Sequenz bestimmt (HARTMANN et al. 2000, BAUER et al. 2001, KAMSTRUP et al. 2001, RANKIN et al.
2001):
Maus: GACGTT
Mensch/Rind/Katze/Hund/Pferd: GTCGTT Schwein: ATCGAT.
Daneben bewirkt auch eine zunehmende Länge der Sequenz, d.h. die Anzahl der CG-Dinukleotide, eine Verstärkung der Immunantwort, so dass die aktuell eingesetzten synthetischen Sequenzen zum Teil aus über zwanzig Nukleotiden bestehen (HAECKER et al. 2002). Außerdem wurde festgestellt, dass die flankierenden Basen, aufgrund ihrer Wirkung in stimulatorische und immun-neutralisierende Sequenzen eingeteilt werden können. Im Vertebratengenom überwiegen die immun-neutralisierenden Sequenzen. Dies erklärt zusätzlich, warum vor allem bakterielle DNA Einfluss auf das Immunsystem hat (KRIEG et al. 1998a).
Zu den in der Humanmedizin beobachteten Effekten synthetischer CpG-Motive zählen in vitro sowohl die B-Zell-Proliferation, die Aktivierung dendritischer Zellen, Makrophagen und Monozyten als auch die verstärkte Aktivität der natürlichen Killerzellen (KRIEG 2002). In vivo verstärken CpG-Motive die CD4+T-Zell-Antwort, die in Th1-Richtung abläuft (KRIEG 2002).
In einer in vitro Studie konnte gezeigt werden, dass equine Leukozyten auf die Stimulierung durch synthetische CpG-Motive mit der Sezernierung von sowohl IFN-α und IFN-β als auch IL-6 und IL-12 reagieren (WATTRANG et al. 2005). Die Qualität der Zytokinantwort variierte je nach Sequenz der Oligodeoxynukleotide, insbesondere in Bezug auf die Anzahl der vorhandenen CpG-Dinukleotide. Des Weiteren unterschied sich die Antwort equiner Leukozyten auf die eingesetzten Oligodeoxynukleotide von der humaner, muriner oder porciner Zellen aus vorherigen Studien.
2.3.1.1 CpG-Motive als Impfstoff-Adjuvantien
Die Verwendung von CpG-Motive als Adjuvantien zeigt im Mäusemodell bereits nach der ersten Immunisierung eine 66-fache Steigerung der antigen-spezifischen Immunantwort im Vergleich zu Aluminiumverbindungen (HARTMANN et al. 2000).
VLEUGELS et al. (2002) berichten bei der Vakzinierung von Hühnern über eine lang anhaltende Ig und IgG-Antwort durch den Zusatz von CpG-Motiven. Die Höhe des Gesamtimmunglobulingehalts nach einmaliger Anwendung entsprach dabei dem, der sonst nach einer Boosterimpfung gemessen wird. Porcine Blutmonozyten reagieren in vitro auf die Zugabe von CpG-Motiven mit Proliferation und Sekretion von 6,
IL-12 und TNF-α (KAMSTRUP et al. 2001). Darüber hinaus erzeugten sowohl CpG- als auch GpC-Motive, die einem Schweineimpfstoff zugesetzt wurden, nach einmaliger intramuskulärer Applikation neben einer gesteigerten systemischen Immunantwort auch einen signifikant erhöhten IgA-Spiegel (VAN DER STEDE et al. 2002). Über die Wirkung auf canine und feline Zellen wurde bisher aus in vitro Studien berichtet, dass verschiedene CpG-Motive in diesen Tierarten ebenfalls eine Aktivierung der Lymphozyten induzieren (WERNETTE et al. 2002). RANKIN et al. (2001) wiesen in einer übergreifenden Studie die Proliferation induzierende Potenz verschiedener CpG-Motive bei allen untersuchten Spezies (Huhn, Hund, Katze, Kaninchen, Maus, Pferd, Schaf, Schwein und Ziege) nach.
Die Vorteile im Einsatz von CpG-Motiven liegen nicht nur in der insgesamt stärkeren Immunantwort, sondern auch in der gesteigerten zellulären Abwehrreaktion. Im Rahmen einer Impfung gegen das bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) bewirkte der Einsatz von CpG-Motiven die Änderung einer Th2-polarisierten in eine ausgeglichene Th2:Th1-Antwort (RANKIN et al. 2002). Auch im Vergleich zu anderen TLR-Liganden erzeugen CpG-Motive einen besseren Schutz, der unter anderem auf der signifikant gesteigerten Aktivität der spezifischen zytotoxischen T-Zellen beruht, die im Zusammenhang mit intrazellulären Erregern von entscheidender Bedeutung sind (SCHWARZ et al. 2003). In adulten Mäusen wurden durch eine Booster-Impfung mit CpG-Motiven die antigenpräsentierenden Zellen aktiviert, so dass sowohl Th1-Zytokine als auch IgG2a und IgM vermehrt gebildet wurden (KOVARIK et al. 1999).
Dagegen reagierten die antigenpräsentierenden Zellen juveniler Mäuse zwar in vitro auf CpG-Motive mit der Sekretion von IL-12, in vivo aber konnte der bei den Adulten beobachtete Effekt nicht im gleichen Maße wiederholt werden, da die Immunantwort zwar von Th1-Zytokinen geprägt war, jedoch keine eindeutige Polarisierung erreichte. Im Gegensatz zu Aluminiumverbindungen besitzen CpG-Motive den Vorteil, dass sie wenig bis gar keine Gewebsirritationen erzeugen (RANKIN et al.
2002, VLEUGELS et al. 2002). Darüber hinaus konnten HORNER et al. (2000) zeigen, dass CpG-Motive nach mukosaler Gabe sowohl eine Steigerung der lokalen als auch der systemischen Immunantwort induzieren.
Der alleinige Einsatz von CpG-Motiven als Adjuvantien wird von manchen Autoren wegen nicht ausreichender Wirkung kritisch diskutiert. Die Verwendung von Aluminiumverbindungen führte im Rahmen einer intramuskulären Impfung gegen das bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) zu einer stärkeren Immunantwort, aber auch dosisabhängig zu lokalen Gewebsreizungen (RANKIN et al. 2002). Ebenso zeigt beim Schaf die subcutane Verabreichung der Kombination von CpG-Motiven mit Adjuvantien auf Basis von Mineralöl eine gute Depotwirkung, so dass im Vergleich zum alleinigen Zusatz von MineralölAdjuvantien die Konzentration und damit die Nebenwirkungen deutlich reduziert werden können (IOANNOU et al. 2002).
Im Mäusemodell zeigen CpG-Motive in hohen Dosierungen von 50 bis 100 μg pro Tier Nebenwirkungen wie Splenomegalie oder Lymphadenopathien (JOSEPH et al.
2002, STORNI et al. 2004). Eine weitere kritische Beobachtung ist die Zersetzung der CpG-Motive durch DNAsen des Körpers, womit die von manchen Autoren beobachtete kurze Wirkungsdauer erklärt werden kann. Um diesen Nachteilen aus dem Wege zu gehen, wurde eine einfache und schnell durchzuführende Möglichkeit getestet, um CpG-Motive zusammen mit dem Antigen in Vesikel zu verpacken (JOSEPH et al. 2002). Diese Formulierung löste in Mäusen mit niedriger Dosierung schon nach einmaliger sowohl intramuskulärer als auch intranasaler Applikation die gleiche Th1-Antwort aus wie die 50-fache Menge des löslichen CpG-Motivs. Zu ähnlichen Ergebnissen führt die Applikation von CpG-Motiven, die in so genannten virus-like particles (VLPs) aus dem Bakteriophagen Qβ untergebracht wurden (STORNI et al. 2004). Die gleichzeitige Verpackung von CpG-Motiven und dem Antigen, gegen das immunisiert werden soll, in ein solches Vesikel, wies im Mäusemodell keinerlei Nebenwirkungen auf und konnte sogar eine T-Zell-Antwort erzeugen, die mit der eines Lebendimpfstoffs vergleichbar ist.
2.3.1.2 CpG-Motive in der Therapie
Neben dem Anwendungsgebiet als Impfstoffzusatz wird auch der Einsatz von CpG-Motiven in der Therapie in der Literatur beschrieben. Adulte Mäuse, die experimentell mit dem intrazellulären Erreger Listeria monozytogenes infiziert waren, konnten sich erst nach Gabe von CpG-Motiven erfolgreich von ihm befreien (KRIEG et al. 1998b).
Der positive Einfluss von CpG-Motiven auf die Eliminierung von Leishmania major wird im Wesentlichen auf drei Mechanismen zurückgeführt (DITTMER u. OLBRICH (2003). Zum einen wird die Bildung von MHC-1 und MHC-2 in spezifischen antigenpräsentierenden Zellen wie den dendritischen Zellen gesteigert, was entscheidend ist, damit das Antigen den T-Zellen präsentiert wird. In den dendritischen Zellen wird darüber hinaus die Bildung von IL-12 gesteigert, was die IFN-γ-Produktion und damit die T-Zell-Antwort steigert. Als drittes induzieren CpG-Motive die Bildung von IL-6 über TLR-9, was den hemmenden Effekt von regulierenden T-Zellen blockt, also eine Hemmung der T-Zellen aufhebt. Im Zusammenhang mit der Tumortherapie zeigte sich die Wirkung von CpG-Motiven im Mäusemodell in der vermehrten Aktivierung der dendritischen Zellen und der zytotoxischen T-Zellen, wodurch der Tumor erfolgreich bekämpft wurde (DAVILA u.
CELIS 2000).