Diskussion von Material und Methode

Um in dieser Arbeit die Vergleichbarkeit des Patientenmaterials und die Aussagekraft der Untersuchungen zu gewährleisten, wurden Gruppengrößen von je 36 Fohlen gewählt. Da alle Tiere auf demselben Betrieb in der Zeit von Juni bis Juli 2005 geboren und zusammen mit ihren Mutterstuten unter den gleichen Bedingungen gehalten und gefüttert wurden, ist eine Beeinflussung der Ergebnisse durch diese Faktoren auszuschließen. Die Geschlechterverteilung von 46 Stut- und 62 Hengstfohlen kann als repräsentativ für die Gesamtpopulation angesehen werden.

Damit sich jahreszeitliche Bedingungen nicht auf die Ergebnisse der Studie auswirken konnten, erfolgte eine randomisierte Einteilung der Gruppen. Der Beobachtungszeitraum wurde bis zur 17. bzw. 18. Lebenswoche festgelegt, da in dieser Zeit die meisten Fohlen klinische Symptome äußern (GIGUÈRE u.

PRESCOTT 1997). Es lagen somit homogene Bedingungen vor, wie sie bisher in anderen Impfstudien im Zusammenhang mit R. equi mit dieser Probandenzahl und über diesen Untersuchungszeitraum nicht beschrieben wurden.

CHIRINO-TREJO et al. (1987) untersuchten sechs Fohlen, die bei der ersten Impfung zwischen einer und drei Wochen alt waren, und drei gleichaltrige Kontrolltiere. Die Untersuchungen endeten sechs Wochen nach der ersten Immunisierung. VARGA et al. (1997) untersuchten insgesamt 74 gleichaltrige Fohlen, die auf drei endemisch mit R. equi betroffenen Gestüten gehalten wurden, wobei sie nur auf zwei Betrieben für den Vergleich der Wirksamkeit mit den immunisierten

Tieren ungeimpfte Fohlen als Kontrolltiere ließen. Die Wirksamkeit des verabreichten Totimpfstoffs wurde bei allen Tieren in Bezug auf eine Feldinfektion in Verbindung mit der Impfung der Mutterstuten untersucht und nach neun Wochen beendet.

PRESCOTT et al. (1997b) impften ebenfalls Stuten und Fohlen und wählten acht Impf- und sechs Kontrollpaare. Die Fohlen wurden im Alter von drei und fünf Wochen geimpft und über den Untersuchungszeitraum von 16 Wochen in Hinblick auf einen Schutz gegen eine Feldinfektion beobachtet. LOPEZ et al. (2003) standen fünf Fohlen, die bei der ersten Impfung acht bis fünfzehn Tage alt waren, und fünf Kontrolltiere im gleichen Alter zur Verfügung. Die Impfwirkung wurde bis zum 45.

Lebenstag nicht hinsichtlich eines erzeugten Schutzes gegenüber einer Infektion mit R. equi, sondern in Bezug auf die Antikörper- und Zytokinantwort untersucht.

HOOPER-McGREVY et al. (2005) wählten für ihre Untersuchung gleichaltrige Fohlen, von denen vier den Impfstoff erhielten und drei als Kontrolltiere blieben und die alle im Alter von fünf Wochen euthanasiert wurden, um anschließend eine Sektion durchzuführen.

5.1.2 Impfprotokoll

In der vorliegenden Studie wurde die erste Impfung acht bis zehn Stunden post natum durchgeführt, nachdem durch Messung des Gehalts an IgG im Blut und eine klinische Untersuchung eine Störung des Allgemeinbefindens auszuschließen war.

Somit wurde ein früherer Termin gewählt als in einer Studie mit einer für das virulenz-assoziierte Protein A (VapA) codierenden DNA-Vakzine, in der die Fohlen das erste Mal im Alter von acht bis fünfzehn Tagen immunisiert wurden (LOPEZ et al. 2003). Jedoch wurde die gleiche Absicht verfolgt, indem möglichst vor dem ersten Erregerkontakt eine Immunität aufgebaut und durch die intranasale Applikation eventuelle Einflüsse von maternalen Antikörpern umgangen werden sollten.

Letzteres konnten LOPEZ et al. (2003) bei einigen Fohlen durch den Nachweis von VapA-spezifischen Antikörpern in der BALF nachweisen. Aus den gleichen Gründen wurde in einer nach Beginn der vorliegenden Studie veröffentlichten Untersuchung der zweite Lebenstag für eine orale Immunisierung mit einem attenuierten Lebendimpfstoff gewählt, wodurch in den Fohlen eine Immunität entwickelt wurde, die einer experimentellen Infektion standhielt (HOOPER-McGREVY et al. 2005). Für

die zweite Impfung wurde in der vorliegenden Studie der 20. bis 22. Tag gewählt, da Erkrankungen regelmäßig bis zum Alter von drei Wochen auftreten (ZINK et al.

1986). Hinsichtlich der Häufigkeit und der Zeitpunkte der Wiederholungsimpfungen sind in der Literatur sehr unterschiedliche Angaben zu finden. LOPEZ et al. (2003) applizierten die DNA-Vakzine ein zeites Mal intranasal und intradermal im Alter von 22 bis 29 Tagen und anschließend das Protein VapA über die gleichen Applikationswege 30 Tage nach der ersten Impfung. HOOPER-McGREVY et al.

(2005) wiederholten die oralen Impfungen im Alter von einer und drei Wochen.

CHIRINO-TREJO et al. (1987) wählten für die erste orale Applikation das Alter von ein bis drei Wochen, wiederholten die Impfung zwei, drei und vier Wochen später und boten damit den Fohlen einen Schutz, der eine experimentelle Infektion abwehrte. VARGA et al. (1997) impften intramuskulär auf dem ersten Gestüt 24 Fohlen gegen R. equi und EHV-2 im Alter von drei, fünf und sieben Wochen, auf dem zweiten Gestüt 14 Fohlen gegen R. equi und EHV-2 im Alter von drei und fünf Wochen und auf dem dritten Gestüt 15 Fohlen nur gegen R. equi mit fünf und sieben Wochen. PRESCOTT et al. (1997b) impften die Probanden ebenfalls intramuskulär und im Alter von drei und fünf Wochen.

Bei der vorliegenden Studie handelt es sich um die erste klinische Erprobung, bei der ein CpG-Motiv als Impfstoff-Adjuvans beim Fohlen eingesetzt wird. Das CpG-Motiv XXXX wurde ausgewählt, da es im Vergleich zu anderen auf equine Leukozyten in vitro eine stärkere stimulierende Wirkung zeigt, was sich in einer erhöhten Proliferationsrate dieser Zellen widerspiegelt (RANKIN et al. 2001). Da beim Pferd bisher keine Erkenntnisse hinsichtlich einer geeigneten Dosierung als Impfstoff-Adjuvans vorliegen, wurden 500 μg des CpG XXXX mit 10⁹ R. equi pro ml als vielversprechende Impfstoffformulierung bei der Verabreichung von 1 ml pro Nüster gewählt. Die Entscheidung für diese Dosierung berücksichtigt Ergebnisse, die mit Dosen von 500 μg an Primaten bei intradermaler (VERTHELYI et al. 2003) und mit 100 μg im Mäusemodell bei subkutaner Verabreichung (DAVILA u. CELIS 2000) erzielt wurden. Da die intramuskuläre Verabreichung von bis zu 10 mg eines CpG-Motivs beim Kalb (RANKIN et al. 2002) beschrieben wurden ohne unerwünschte Nebenwirkungen zu beobachten, waren in dieser Studie unerwünschte Reaktionen

als unwahrscheinlich zu betrachten. Wie in der vorliegenden Studie setzten auch VARGA et al. (1997) einen formalininaktivierten R.equi-Impfstoff ein, fügten als Adjuvans jedoch eine Aluminiumverbindung hinzu. PRESCOTT et al. (1997b) setzten das virulenz-assoziierte Protein A (VapA) zur Immunisierung ein, konnten jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe keinen Schutz aufbauen, sondern es erkrankten von den geimpften Probanden im Verhältnis mehr als von den Kontrolltieren. CHIRINO-TREJO et al. (1987) und HOOPER-McGREVY et al. (2005) verwendeten attenuierten R. equi-Lebendimpfstoffe und konnten damit erfolgreich eine schützende Immunität aufbauen. Die intradermale und intranasale Verabreichung einer DNA-Vakzine und des aufgereinigten Proteins VapA durch LOPEZ et al. (2003) brachte Erkenntnisse hinsichtlich des Applikationsweges, der Impfstoff wurde jedoch nicht im Hinblick auf eine Infektion überprüft. Die Verwendung von CpG-Motiven als Adjuvantien bei intranasaler Applikation wird vielfach in der Literatur am Mäusemodell beschrieben, um die notwendige Aktivierung des Immunsystems für die Bildung von Gedächtniszellen zu gewährleisten (McCLUSKIE et al. 2002, JIANG et al. 2003).

5.1.3 Untersuchungen der Fohlen

Um die Wirksamkeit der eingesetzten Impfstoffformulierungen und den Schweregrad der Erkrankung zu beurteilen, wurden die klinischen Symptome, die Leukozytenzahl im Blut sowie die Anzahl und der Durchmesser der im Ultraschall darstellbaren Abszesse verglichen. Diese Parameter wurden im Rahmen eines Überwachungsprogramms zur Früherkennung einer R. equi-Pneumonie erfasst, das an Vorschläge von COHEN et al. (2000) für endemisch betroffene Betriebe angelehnt ist. In den bisher veröffentlichten R. equi-Impfstudien spielt die klinische Untersuchung eine zentrale Rolle. Für die endgültige Diagnose wurde vor allem der kulturelle Erregernachweis durchgeführt, zum Teil im Rahmen einer Sektion.

CHIRINO-TREJO et al. (1987) wählten als Parameter für die Auswertung die klinische Untersuchung und führten drei Wochen nach der letzten Immunisierung über den Zeitraum einer Woche eine viermalige experimentelle Infektion durch Inhalation und zehn bzw. 14 Tage nach der ersten Exposition die Sektion aller in die Studie involvierten Fohlen mit histologischer und mikrobiologischer Untersuchung.

VARGA et al. (1997) wählten für die Kontrolle des Impfschutzes gegenüber einer Feldinfektion die klinische Beobachtung, die serologische Untersuchung in Form der indirekten Hämagglutination und die kulturelle Untersuchung von Nasentupfern der erkrankten bzw. von Proben aus der Sektion der verendeten Probanden.

PRESCOTT et al. (1997b) kombinierten die klinische Beobachtung mit der kulturellen Untersuchung klinisch auffälliger Fohlen. LOPEZ et al. (2003) richteten ihre Aufmerksamkeit auf den Nachweis von VapA-spezifischen IgG-Isotypen sowohl in der BALF als auch im Serum. Darüber hinaus wurde in der BALF mit Hilfe einer PCR ein erhöhtes Vorkommen von IFN γ- oder IL-4-sezernierenden Zellen überprüft. In der Studie von HOOPER-McGREVY et al. (2005) wurden neben den Parametern der klinischen Untersuchung, die Konzentrationen von Leukozyten, Fibrinogen und VapA-spezifischen Isotypen im Blut bzw. Serum bestimmt. Kurz nach der letzten Impfung im Alter von drei Wochen wurden alle Fohlen intratracheal infiziert und 14 Tage später euthanasiert, um eine Sektion einschließlich mikrobiologischer Untersuchung durchzuführen.

Da die sonographische Untersuchung in der Literatur für die Diagnose einer R. equi-Pneumonie für ebenso geeignet beschrieben wird wie die radiologische Untersuchung (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997, RAMIREZ et al. 2004), keine Strahlenbelastung verursacht und sich außerdem auf dem Gestüt in der Früherkennung der Rhodokokkose als zuverlässig gezeigt hat (ALTHAUS 2004), wurde in der vorliegenden Studie die Sonographie als Diagnostikum einer R. equi-Pneumonie verwendet. Obwohl Lungenabszesse ebenfalls durch andere Erreger wie Streptococcus equi ssp. zooepidemicus hervorgerufen werden können (LAVOIE et al. 1994, RAMIREZ et al. 2004), sprechen nachfolgende Punkte für eine Beteiligung von R. equi als Ursache der sonographischen Befunde. Auf dem Gestüt wurde in den letzten drei Jahren im Tracheobronchialsekret von Fohlen mit sonographisch darstellbaren Lungenabszessen wiederholt R. equi nachgewiesen, zuletzt am 10.10.2005 (ROTHHAAR 2006, persönliche Mitteilung). Zusätzlich zeigte eine im Jahr 2003 auf dem Gestüt durchgeführte Studie sowohl in den Stallungen als auch auf den Weiden eine ubiquitäre Verbreitung von R. equi, wobei aus 80 % der Bodenproben von den Weiden der Erreger kulturell isoliert werden konnte

(MEYER-HAMME 2004). Schließlich liefert die vorliegende Studie einen indirekten Erregernachweis, da alle involvierten Fohlen im Serum einen Anstieg des Antikörpergehalts im ELISA nach HIETALA et al. (1985) zeigten.

Ein direkter Erregernachweis wurde in der vorliegenden Arbeit nicht durchgeführt, da sowohl die Kultur als auch die PCR nur über eine geringe Sensitivität und Spezifität verfügen (MEYER-HAMME 2004, HEYERS 2005).