6.2 Ergebnisse der Chipexperimente
6.2.3 Zusammenfassung der Chipexperimente
Die Chipexperimente mit den beiden Schutzgruppenverbindungen T7C4 und T5D0 ver-liefen hoffnungsvoll und geben Grund zu Optimismus. Um vergleichbare Ergebnisse wie mit unsensibilisierten NPPOC–Schutzgruppen zu erzielen, waren die ben¨otigten Bestrah-lungsdauern pro Zyklus um etwa einen Faktor 10 k¨urzer. F¨ur die Entsch¨utzungsreaktion der beiden untersuchten Schutzgruppenverbindungen konnten Ausbeuten an freien OH–
Gruppen zwischen 85% und 91% bestimmt werden. Dies scheint im Widerspruch zu den kontinuierlichen Bestrahlungen von T5D0–T in L¨osung zu stehen, die mit ca. 60% we-sentlich schlechtere Ausbeuten aufwiesen. Die Verbesserung k¨onnte durch die optimierten Bedingungen bei der Chipherstellung erreicht worden sein. Im Gegensatz zu den Abspal-tungen in homogener, methanolischer L¨osung bewirken die verwendeten L¨osungsmittel-zus¨atze wahrscheinlich eine Unterdr¨uckung der Entstehung solcher Nebenprodukte, die keine Verl¨angerung der Oligonukleotid–Kette mehr erlauben.
In jedem Fall w¨are es interessant, Chips herzustellen, bei denen die Bestrahlungs-dauern pro Zyklus in kleinen Schritten variiert werden. Damit k¨onnte man genauer un-tersuchen, ob sich die Fluoreszenzintensit¨aten bei Variation von p wie in Gleichung 6.6 verhalten, und ob die gemachten Annahmen zutreffend sind.
F¨ur genauere Untersuchungen und eine genaue Bestimmung der optimalen Bestrah-lungszeiten und Entsch¨utzungsausbeuten m¨ussten Oligonukleotide mit allen vier verschie-denen Basen aufgebaut, und mit diesen Hybridisierungsexperimente durchgef¨uhrt werden.
Dies h¨atte jedoch den Rahmen dieser Arbeit gesprengt.
7 Zusammenfassung
Photolabile Schutzgruppen finden vielfach Verwendung in der chemischen Synthese und einer Reihe von wissenschaftlich–technischen Anwendungen. Hierzu geh¨ort vor allem die photolithographische Synthese vonHigh–Density–DNA–Chips, f¨ur die photolabile Schutz-gruppen mit hoher Lichtempfindlichkeit und hohen Nukleosidausbeuten ben¨otigt werden.
Die 2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonyl–Schutzgruppe (NPPOC) erf¨ullt die letzte Voraus-setzung sehr gut. Bei den f¨ur die Bestrahlungen bevorzugten Wellenl¨angen oberhalb 350 nm besitzt dero–Nitrophenylchromophor jedoch nur einen kleinen Absorptionskoeffizien-ten (< 400 M−1cm−1). Somit ergibt sich trotz der guten Quantenausbeute von 0.4 eine geringe Lichtempfindlichkeit, f¨ur die es auf einen m¨oglichst hohen Wert des Produktsǫ·φ ankommt.
In meiner Diplomarbeit wurde bereits gezeigt, dass Thioxanthone sowohl in homo-gener L¨osung als auch auf der Chipoberfl¨ache geeignete Sensibilisatoren f¨ur NPPOC sind [34]. Bei den intermolekularen Sensibilisierungen stellt die Diffusion den limitierenden Schritt der Schutzgruppenabspaltung dar. Als Strategie zur Umgehung dieses geschwindig-keitsbestimmenden Prozesses schien es aussichtsreich, Thioxanthon kovalent ¨uber einen Linker mit der NPPOC–Schutzgruppe zu verkn¨upfen. In solchen Schutzgruppen neuen Typs, die in Form des angekn¨upften Sensibilisators gewissermaßen eine eingebaute Anten-ne besitzen, sollte die Schutzgruppenabspaltung durch die jetzt intramolekular erfolgende Energie¨ubertragung wesentlich schneller und effizienter ablaufen (vgl. Abbildung 7.1).
NO2 O S
O
1.Lichtabsorption und Inter-System-Crossing
2. Energie- übertragung
kovalente Verknüpfung
4. β-Eliminierung & Fragmentierung 3. H-Transfer OR
O
CO2
+ + ROH
NO2 S
O
Abbildung 7.1: Reaktionsweise einer intramolekular sensibilisierten Schutzgruppe.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Reihe neuer Schutzgruppen mit einer solchen kovalenten Verkn¨upfung von Sensibilisator und NPPOC-Schutzgruppe synthetisiert (vgl.
Abbildung 7.2). Dabei wurden durch klassische organische Syntheseschritte, kombiniert mit Palladium–katalysierten C–C–Kupplungsreaktionen, Linker zwischen der Methylgrup-pe oder dem aromatischen Ring von NPPOC und der 2–Position von Thioxanthon ein-gef¨uhrt. Als Linker wurden ges¨attigte und unges¨attigte Kohlenwasserstoffketten unter-schiedlicher L¨ange bzw. eine Estergruppe gew¨ahlt. Außerdem wurde eine Schutzgruppe, in der die aromatischen Systeme der beiden Chromophore Thioxanthon und NPPOC direkt miteinander verkn¨upft sind, hergestellt. Die meisten dieser neuen Schutzgruppen wurden ¨uber eine Kohlens¨aurediesterbr¨ucke mit Thymidin als Modellnukleosid verkn¨upft, um dessen Freisetzung bei Bestrahlung verfolgen zu k¨onnen.
NO2
Abbildung 7.2: Ubersicht ¨¨ uber die neuen Schutzgruppen.
Die neuen Schutzgruppen besitzen auf Grund ihres Thioxanthonteils bei 366 nm einen etwa 15-fach, Verbindung 6 sogar einen ca. 35-fach h¨oheren Wert f¨ur den Absorptions-koeffizienten als die NPPOC–Schutzgruppe. Bei 405 nm konnte eine Erh¨ohung des Ab-sorptionskoeffizienten um einen Faktor von bis zu 140 erreicht werden. Der Nachweis der intramolekularen L¨oschung des Thioxanthon–Triplettzustands in den neuen Verbindun-gen wurde mittels Laserblitzspektroskopie erbracht. Die verwendete Laserblitzapparatur erfuhr im Rahmen dieser Arbeit durch den Einbau einer intensivierten CCD–Kamera und eine neue Steuer– und Datenerfassungs–Software wichtige Verbesserungen. Das neue Pro-gramm Toskana (=Transientenspektroskopie mit Oszilloskop und CCD–Kamera im Nanosekundenbereich) wurde mit Hilfe der Programmier–Umgebung LabView 7.1 Pro-fessional entwickelt. Besonderes Augenmerk wurde auf die einfache und selbsterkl¨arende Bedienbarkeit als auch auf die Automatisierungsm¨oglichkeit von Messreihen gelegt.
Mit den Laserblitzmessungen konnte f¨ur alle Thioxanthon–NPPOC–Konjugate eine effiziente L¨oschung des Thioxanthontripletts im ns– bis µs–Bereich festgestellt werden.
Die L¨oschgeschwindigkeit h¨angt stark von den verwendeten Linkern und deren Dynamik ab, wie weiter unten bei der Besprechung der Oligomethylen–verkn¨upften Verbindungen noch genauer diskutiert wird.
Die Lichtempfindlichkeit, die Produktspektren sowie die Ausbeuten wurden in konti-nuierlichen Bestrahlungsexperimenten mit quantitativer HPLC–Analyse untersucht. Al-le Verbindungen zeigen eine stark verbesserte Lichtempfindlichkeit, die im VergAl-leich zu NPPOC bis zu einem Faktor von 20 bei 366 nm und bis zu 140 bei 405 nm gesteigert ist.
Bei den meisten Verbindungen findet dabei die gew¨unschte Entsch¨utzung in guten bis sehr guten chemischen Ausbeuten statt. Die Produktzusammensetzung h¨angt kaum davon ab, bei welcher der beiden untersuchten Wellenl¨angen bestrahlt wird, oder ob Sauerstoff in der L¨osung vorhanden ist.
Im Folgenden wird auf die vom Strukturtyp abh¨angigen Besonderheiten der neuen
1
D
* 1A
Acinitro-Form
3
D
* 1A
1
D
3A
*2
D
2A
1,3
kR,T kTT
kISC kELT
1
D
1A
NRO
S O
n NO2
RO
S O
n
HO O
Abbildung 7.3: Hauptreaktionspfade der Photoreaktion von Schutzgruppen, bei de-nen der Thioxanthon–Chromophor (=D) und der NPPOC–Chromophor (=A) ¨uber einen Oligomethylen–Linker verkn¨upft sind. Die rein physikalischen Desaktivierungswege wie z.B.
Fluoreszenz oder strahlungslose Desaktivierung sind zur Vereinfachung weggelassen.
Schutzgruppen eingegangen.
Bei den Schutzgruppen T7Cn mit einem Oligomethylen–Linker, die Verbindungsklas-se, die mit 6 Vertretern am systematischsten repr¨asentiert ist, konnte durch quantitativen Vergleich von Triplett–Triplett–Absorptionsspektren, Fluoreszenzspektren und photoche-mischen Quantenausbeuten bei der kontinuierlichen Bestrahlung gezeigt werden, dass nach Anregung in den Thioxanthon–Singulett zwei in Abbildung 7.3 dargestellte Re-aktionsm¨oglichkeiten zur Entstehung der Acinitro–Form am NPPOC–Teil f¨uhren. Zum einen ist dies ein Intersystem Crossing Prozess in den Thioxanthon–Triplett (Ratenkon-stante kISC im ns–Bereich). Daran kann sich eine Triplett–Triplett–Energie¨ubertragung (Ratenkonstante kTT) auf den NPPOC–Chromophor anschließen, die nach einem Dex-ter–Mechanismus abl¨auft. Die Wasserstoff–Wanderung von der benzylischen Position von NPPOC zur Nitrogruppe (Ratenkonstante kR,T) f¨uhrt schließlich zur Acinitro–Form. Als zweiter Weg wurde postuliert und plausibel gemacht, dass eine Elektronen¨ubertragung vom NPPOC–Teil auf das Singulett–angeregte Thioxanthon stattfindet (Ratenkonstan-te kELT). In dem dabei entstehenden Radikalionenpaar kann die Wasserstoffwanderung vermutlich ebenfalls erfolgen, und es entsteht ¨uber eine im Detail nicht aufgekl¨arte Reak-tionsfolge ebenfalls die Acinitro–Form von NPPOC.
Bei den Prozessen mit den RatenkonstantenkISCundkR,Thandelt es sich um Vorg¨ange innerhalb des Thioxanthon– bzw. des NPPOC–Chromophors. Deshalb h¨angen ihre Ge-schwindigkeiten nicht von der L¨ange des Linkers zwischen den beiden Chromophoren ab.
Anders verh¨alt es sich bei der intramolekularen Energie– bzw. Elektronen– ¨Ubertragung, deren Ratenkonstanten kTT bzw. kELT von der gegenseitigen Orientierung der beiden Chromophore im Molek¨ul abh¨angen. Diese Orientierung ist bei flexiblen Linkern jedoch nicht fest, sondern ver¨andert sich durch die Kettendiffusion dynamisch. Bei l¨angeren Lin-kern ist die H¨aufigkeit geringer, mit der sich Konformationen ergeben, in welchen die Elektronensysteme der beiden Chromophore gut ¨uberlappen. Die Geschwindigkeit von Prozessen, bei denen diese ¨Uberlappung eine Rolle spielt, muss mit zunehmender Lin-kerl¨ange also abnehmen. Genau dies wurde sowohl beim Triplett–Triplett–Energietransfer als auch bei der Elektronen¨ubertragung beobachtet. Die Ratenkonstanten der entspre-chenden Prozesse korrelieren sehr gut miteinander. Allerdings ist die Geschwindigkeit der Elektronen¨ubertragung mit Werten im Bereich von 109 s−1 etwa 42 mal schneller als diejenige der Triplett–Triplett–Energie¨ubertragung mit Werten im Bereich von 107 s−1. Ein Vergleich mit in der Literatur publizierten Daten zur Kettendynamik belegt, dass im Falle des angeregten Thioxanthon–Singuletts fast jede Begegnung mit dem NPPOC–
Chromophor zu einer Elektronen¨ubertragung f¨uhrt, w¨ahrend nur etwas mehr als jede 100. Begegnung zwischen einem Thioxanthon–Triplett und einem NPPOC–Chromophor einen Triplett–Triplett–Energietransfer bewirkt. Da nach Anregung des Thioxanthon–
Chromophors in seinen Singulettzustand die Linker–abh¨angige Elektronen¨ubertragung in Konkurrenz zum Linker–unabh¨angigen Intersystem Crossing in den Triplett steht, ist der Anteil der Acinitro–Form–Bildung ¨uber eine Elektronen¨ubertragung bei k¨urzeren Linkern gr¨oßer (h¨ohere Quantenausbeute).
Die Verbindungen, bei denen Thymidin mit einer Oligomethylen–verkn¨upften Schutz-gruppe der Linkerl¨ange 2, 3 bzw. 4 gesch¨utzt war, wurden kontinuierlich belichtet. Die Quantenausbeuten f¨ur die Entsch¨utzung besitzen Werte zwischen 0.09 und 0.21 und sind damit etwa halb so groß wie NPPOC-T. Durch den verbesserten Absorptionskoeffizienten resultiert jedoch trotz dieser geringeren Quantenausbeute eine Steigerung der Lichtemp-findlichkeit um knapp eine Gr¨oßenordnung. Die chemischen Ausbeuten der Freisetzung des Thymidins liegen zwischen 60% und 86%.
Bei der Schutzgruppe T7P4, die eine zum Thioxanthon–Chromophor konjugierte
Dop-pelbindung enth¨alt, konnte festgestellt werden, dass die Anregung des Thioxanthonchro-mophors gr¨oßtenteils zu einertrans–cis–Isomerisierung der Doppelbindung f¨uhrt. Ein Tri-plettsignal wurde nicht beobachtet. Entsprechend verringerte sich auch die Quantenaus-beute der intramolekular sensibilisierten Photoreaktion auf Werte unterhalb von 10%.
Mittels HPLC–Auftrennung der Substanzgemische und Bestimmung der relativen Kon-zentrationen der Produkte nach unterschiedlichen Bestrahlungszeiten konnte diese Isome-risierung kinetisch im Detail analysiert werden.
Die Schutzgruppe T7R4, die eine zum Thioxanthon–Chromophor konjugierte Drei-fachbindung enth¨alt, zeigt aufgrund der durch die eingeschr¨ankte Kettenbeweglichkeit schlechteren ¨Uberlappungsm¨oglichkeiten von Thioxanthon– und NPPOC–Chromophor eine im Vergleich zu den Schutzgruppen mit ges¨attigtem Linker deutlich langsamere in-tramolekulare Energie¨ubertragung im µs–Bereich. Dennoch ist die Quantenausbeute f¨ur das Verschwinden des Edukts sehr hoch. Der bevorzugte Reaktionsweg dieser Schutz-gruppe ist allerdings nicht die gew¨unschte Wasserstoffwanderung, sondern eine [2+2]–
Cycloaddition der N=O–Doppelbindung mit der C≡C–Dreifachbindung, gefolgt von einer [2+2]–Cycloreversion, die ein Konstitutionsisomer des Edukts entstehen l¨asst, das nicht mehr zu einer Entsch¨utzung des Substrats f¨uhrt. Damit ist die chemische Ausbeute an entsch¨utztem Thymidin mit ca. 20% verh¨altnism¨aßig gering.
Bei der Schutzgruppe T5D0 sind die aromatischen Ringe von Thioxanthon– und Ni-trophenylchromophor direkt miteinander verkn¨upft. Dies hat zur Folge, dass die bei-den elektronischen Systeme nicht mehr als unabh¨angig voneinander betrachtet werbei-den k¨onnen. Die Kopplung zwischen den beiden Chromophoren zeigt sich bereits im Ab-sorptionsspektrum, das im Vergleich zu den anderen untersuchten Verbindungen nicht der Summe der Absorptionsspektren von Thioxanthon– und NPPOC–Chromophor ent-spricht. Ebenso zeigen die Transientenspektren nicht die typischen Absorptionssignale des Thioxanthon–Triplettzustands. Stattdessen konnte eine breite Absorptionsbande ¨uber den gesamten betrachteten Wellenl¨angenbereich beobachtet werden. Die Photoreaktion ¨uber diesen Transienten f¨uhrt gr¨oßtenteils dennoch zu der entsprechenden Acinitro–Form, wie anhand der Laserblitzspektren nachgewiesen werden konnte. Unter kontinuierlicher Be-strahlung bei 366 nm findet man eine Entsch¨utzung des Substrats in m¨aßigen Ausbeuten von ca. 60%, die sich jedoch auf 89% steigern l¨asst, wenn man bei 405 nm bestrahlt.
Insgesamt verk¨orpert T5D0 die Schutzgruppe mit der h¨ochsten Lichtempfindlichkeit bei den beiden verwendeten Wellenl¨angen. Dies liegt vor allem an dem im Vergleich zu den anderen Schutzgruppen hohen Absorptionskoeffizienten.
Außer dem T5D0–gesch¨utzten Thymidin wurden auch die anderen T5D0–gesch¨utzten Nukleoside kontinuierlich bestrahlt. Dabei zeigte sich, dass mit Ausnahme des Guanosins die Lichtempfindlichkeit nicht vom Nukleosid abh¨angt. Bei Anregung des Thioxanthon–
Chromophors bei T5D0–gesch¨utztem Guanosin kann eine Elektronen¨ubertragung von Guanosin, dem Nukleosid mit dem niedrigsten Oxidationspotential, auf den angeregten Thioxanthon–Chromophor stattfinden, und letzteren l¨oschen. Nach der L¨oschung erfolgt innerhalb von ca. 40 µs der R¨uckelektronentransfer unter Regenerierung des Grundzu-stands der beiden Chromophore. Da die Energie in diesem Fall nicht ¨ubertragen wird, verringert sich die Quantenausbeute f¨ur die Entsch¨utzung bei dem T5D0–gesch¨utzten Guanosin um etwa einen Faktor 3 gegen¨uber den anderen T5D0–gesch¨utzten Nukleosi-den.
Die T4E2–Schutzgruppe mit einer Esterverkn¨upfung der beiden Chromophore zeigt mit ca. 4µs die langsamste Energietransferrate der neuen Schutzgruppen. Dies wurde auf eine ung¨unstige ¨Uberlappung der beiden Chromophore zur¨uckgef¨uhrt. Die Entsch¨utzungs-reaktion ¨uber das im Transientenspektrum beobachtete Acinitro–Intermediat verl¨auft
je-doch in sehr hohen chemischen Ausbeuten. Kontinuierliche Bestrahlungen zeigten, dass diese bis zu 95% betragen k¨onnen. Die Schutzgruppe T4E2 reagiert also chemisch am besten, besitzt jedoch nur relativ geringe Quantenausbeuten von bis zu 10% und in stick-stoffges¨attigtem Methanol im Vergleich zu NPPOC eine nur etwa 4-fache Lichtempfind-lichkeit.
Neben den Untersuchungen in stickstoffges¨attigter L¨osung wurden teilweise auch Ex-perimente in luftges¨attigter L¨osung durchgef¨uhrt. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind insbesondere im Hinblick auf den Einsatz bei der DNA–Chip–Synthese n¨utzlich, da ein sauerstofffreies Arbeiten hier mit einem zus¨atzlichen experimentellen Aufwand verbun-den w¨are. Es stellte sich heraus, dass in verbun-den meisten F¨allen Sauerstoff keinen Einfluss auf die Produktzusammensetzungen zeigt. Allerdings verkleinert die Anwesenheit von Sau-erstoff die Quantenausbeuten der Photoreaktionen, weil molekularer SauSau-erstoff den Tri-plettzustand l¨oschen kann. Diese Konkurrenzreaktion zum gew¨unschten Energietransfer erlangt umso mehr Bedeutung, je langsamer die Energie¨ubertragung auf den NPPOC–
Chromophor ist. Bei den Verbindungen mit einer Ratenkonstante kET der Energie¨ubert-ragung von ¨uber 5·106s−1 ist der konkurrierende Energietransfer auf Sauerstoff so gering, dass kaum eine Einbuße der Quantenausbeute zu beobachten ist.
R1
Abbildung 7.4: Reaktionsschema der photochemischen Freisetzung gesch¨utzter Nukleoside.
Dass auch durch eine Weiterreaktion des Nitroso–Produkts infolge einer zyklischen Umesterung Nukleosid freigesetzt wird, konnte in dieser Arbeit erstmals aufgekl¨art werden.
Einige der bei der Bestrahlung der neuen Schutzgruppen gefundenen Produkte ließen sich nur zum Teil mit dem bereits bekannten Mechanismus erkl¨aren. Die nicht quanti-tativen chemischen Ausbeuten der Entsch¨utzungen konnten z.T. auf die Bildung eines Nitrosoalkohols als Produkt zur¨uckgef¨uhrt werden. Dessen Entstehung konnte unter den hier nicht optimierten Bedingungen1nicht vermieden werden. Die Reaktionsm¨oglichkeiten dieses Nitrosoalkohols wurden bisher nicht beachtet. Durch eine Bestrahlung von T7C4-T und anschließender Trennung der Produkte mit pr¨aparativer HPLC konnte nun gezeigt werden, dass der Nitrosoalkohol durch eine intramolekulare Umesterung unter Freisetzung des Thymidins weiter reagieren kann. Das Reaktionsschema der Entsch¨utzung muss somit um diese neue M¨oglichkeit (vgl. Abbildung 7.4) erweitert werden, sofern das Substrat ¨uber einen Kohlens¨aurediester mit der Schutzgruppe verkn¨upft ist. Das Einschlagen des ”Nitro-sopfads” muss also keineswegs bedeuten, dass eine Entsch¨utzung nicht mehr m¨oglich ist.
Die Geschwindigkeit der intramolekularen Umesterung h¨angt dabei von dem verwendeten L¨osungsmittel ab. Es konnte gezeigt werden, dass diese Reaktion in Acetonitril wesentlich langsamer abl¨auft als in Methanol.
Um zu belegen, dass der Aufbau von DNA–Chips mit Hilfe der neuen Schutzgrup-pen m¨oglich ist, wurden mit den Phosphoramiditen der beiden effektivsten Verbindungen T7C4-T und T5D0-T unter den ¨ublichen Produktionsbedingungen Chips mit Oligonukleo-tiden der Kettenl¨ange 1 bis 12 aufgebaut. Im Rahmen der eingeschr¨ankten Aussagekraft dieses Tests konnte gezeigt werden, dass die Qualit¨at dieser Chips mit der Qualit¨at der Chips, die unter Verwendung der NPPOC-Schutzgruppe hergestellt wurden, vergleichbar ist. Im Gegensatz zu den Bestrahlungen in L¨osung lagen vermutlich aufgrund der opti-mierteren Bedingungen die Ausbeuten bei diesen Experimenten zwischen 85% und 91%.
Die Belichtungszeit konnte jedoch im Vergleich zu NPPOC aufgrund der Sensibilisierung um einen Faktor von ca. 10 verringert werden.
Mit den durchgef¨uhrten Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass die neuen intramolekular sensibilisierten Schutzgruppen eine hohe Lichtempfindlichkeit besitzen und gr¨oßtenteils zu der gew¨unschten Reaktion f¨uhren. Mit ihnen ist eine erhebliche Verk¨urzung der photolithographischen Herstellungszeit von High-Density-DNA-Chips m¨oglich. Ihr Einsatz in der Chip–Herstellung wird jedoch nicht nur von ihrer Leistungsf¨ahigkeit son-dern auch von ihrer Verf¨ugbarkeit und wirtschaftlichen Faktoren abh¨angen und bleibt ab-zuwarten. Es soll jedoch abschließend betont werden, dass die neuen Verbindungen, ¨uber den vordergr¨undigen, praktischen Anwendungszweck f¨ur die DNA–Chip–Herstellung hin-aus, faszinierende Studien von grunds¨atzlichem wissenschaftlichen Interesse erm¨oglichten und eine Reihe wertvoller neuer Erkenntnisse ¨uber Mechanismen und Bedingungen der intramolekularen Sensibilisierung von Photoreaktionen lieferten.
1Hierzu z¨ahlt insbesondere das verwendete L¨osungsmittel.