Reaktionsgemische nach der Bestrahlung
Im Folgenden werden die Chromatogramme zu den Bestrahlungen der mit den neuen Schutzgruppen gesch¨utzten Nukleoside vorgestellt. Die Substanzen wurden anhand ihrer UV–Spektren charakterisiert. Exemplarisch sind hier die Chromatogramme f¨ur die Belich-tung bei 366 nm in stickstoffges¨attigtem Methanol dargestellt. Die Produktverteilungen bei den entsprechenden Bestrahlungen in luftges¨attigtem Methanol und bei 405 nm wa-ren sehr ¨ahnlich. Die Peaks sind teilweise verbreitert oder sogar aufgespalten. Soweit nicht anders erw¨ahnt, handelt es sich dabei jedoch um eine einzige Substanz, was aus identi-schen UV–Spektren ¨uber den gesamten Bereich des verbreiterten bzw. aufgespaltenen Peak geschlossen werden kann.
NO2
O O
O R1
NO O
O R1
OH
Nitroso-Produkt geschütztes Nukleosid
O Nukleosid
Nukleosid R2
R3
R2
R3 NO2
R1
Styrol-Produkt R2
R3 HO Nukleosid +
Nukleosid
Abbildung 5.1: Bisher bekannte Reaktionswege f¨ur die Entsch¨utzung der NPPOC–Schutz-gruppe.
Um dem Leser eine Hilfe bei den folgenden Beschreibungen der Reaktionsprodukte zu geben, sind in Abbildung 5.1 die bekannten Reaktionswege wiedergegeben, nach denen die untersuchten Substanzen vorwiegend reagieren. Eine ausf¨uhrliche Diskussion erfolgt in Abschnitt 5.10.
5.4 Bestrahlung der Oligomethylen–verbr¨ uckten Schutzgruppen T7Cn
Die in Abbildung 5.2 dargestellten Bestrahlungen von Verbindung T7C2-T zeigen den Verlauf der Photoreaktion anhand der Abnahme der gesch¨utzten Verbindung, die in der HPLC bei einer Retentionszeit von 15.3 min erscheint. Synchron zu dem Verschwinden des Edukts wird die Entstehung eines Produkts bei einer Retentionszeit von 6.2 min be-obachtet, das aufgrund seines UV–Spektrums und seiner Retentionszeit dem entsch¨utz-ten Thymidin zugeordnet werden kann. Außerdem entstehen drei weitere Produkte, die bei Retentionszeiten von 14.6 min, 18.7 min und 21.8 min erscheinen. Aus den UV–
Absorptionsspektren geht hervor, dass alle drei Produkte einen Thioxanthon–Chromophor mit seinen charakteristischen Absorptionmaxima bei 260 nm und 380 nm enthalten. Bei
Thymidin T7C2-T
200 250 300 350 400
0.00
200 250 300 350 400
0.00
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02 0.03
200 250 300 350 400
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08
200 250 300 350 400
0.0
Abbildung 5.2: HPLC von T7C2-T in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschiedlichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T7C2-T] = 0.082 mM;I0 = 1.86·10−8 Einsteincm2s
der nach 14.6 min eluierten Substanz handelt es sich um das Nitroso–Produkt. Das Pro-dukt bei 18.7 min, das bisher jedoch strukturell nicht zugeordnet werden konnte, weist im UV–Spektrum eine Bande mit einem Maximum bei ca. 315 nm auf. Der Peak bei 21.8 min verschwindet bei l¨angerer Bestrahlungszeit wieder. Dieses Verhalten k¨onnte das Styrol-derivat zeigen. Nach seiner Entstehung k¨onnte es photochemisch an der Doppelbindung reagieren, was in Abschnitt 5.10.2 genauer diskutiert wird.
Auch bei der Bestrahlung von T7C3-T (vgl. Abbildung 5.3) ist mit zunehmender Bestrahlungsdauer zu erkennen, dass die Anfangsverbindung abgebaut wird. Im gleichen Maße ist ein Anstieg der Konzentration an freiem Thymidin (tR = 7.6 min) zu verzeich-nen. Ebenso entsteht ein Produkt (tR = 20.4 min), das einer Nitroso–Spezies zugeordnet werden kann (vgl. Kapitel 5.10.4). Weitere Produkte besitzen Elutionszeiten von 16.4 min, 18.8 min und 23.1 min. Alle weisen Absorptionsmaxima bei 260 und 380 nm auf, die typisch f¨ur Thioxanthon sind. Die bei 16.4 min eluierte Substanz ist vermutlich eine Nitroso–Form. Die Substanz bei 23.1 min verschwindet mit zunehmender Bestrahlungs-dauer wieder. Es liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei der Substanz um das entspre-chende Styrolderivat handelt, das wie in Abschnitt 5.10.2 beschrieben weiter reagiert.
Abbildung 5.4 zeigt die Entsch¨utzung von T7C4-T in Methanol. Sein Abbau mit zu-nehmender Belichtungsdauer kann bei einer Retentionszeit von 17.3 min verfolgt werden.
Zugleich entstehen bei 6.6 min freies Thymidin und zwei weitere Produkte bei 20.8 min und 23.8 min. Beide Produkte weisen im UV–Spektrum eine f¨ur Thioxanthon typische Bande mit Maximum bei ca. 380 nm auf. Die UV–Spektren ¨ahneln denjenigen bei der Bestrahlung von T7C3-T (siehe oben). Es handelt sich vermutlich um die entsprechenden Produkte, n¨amlich eine Nitrosoform und das Styrolderivat. Letzteres reagiert nach seiner Entstehung mit zunehmender Belichtungszeit weiter zu einem nicht detektierten Produkt.
Um einen m¨oglichen Einfluss des L¨osungsmittels zu untersuchen, wurde Verbindung T7C4-T außerdem auch in Acetonitril bestrahlt (Abbildung 5.5). Hierbei reagiert das bei 17.4 min eluierte T7C4-T fast ausschließlich zu einem einzigen Produkt, das bei 16.4 min beobachtet werden kann. Es handelt sich dabei um eine Nitroso–Form von T7C4-T, deren
200 250 300 350 400
200 250 300 350 400
0.00
200 250 300 350 400
0.00
200 250 300 350 400
0.000
200 250 300 350 400
0.000
Abbildung 5.3: HPLC von T7C3-T in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschiedlichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T7C3-T] = 0.091 mM;I0 = 1.20·10−8 Einsteincm2s
Thymidin T7C4-T
200 250 300 350 400
0.00
200 250 300 350 400
0.00 0.03 0.06 0.09 0.12
200 250 300 350 400
0.00
200 250 300 350 400
0.000
Abbildung 5.4: HPLC von T7C4-T in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschiedlichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T7C4-T] = 0.117 mM;I0 = 1.75·10−8 Einstein
cm2s
200 250 300 350 400 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
200 250 300 350 400
0.00 0.04 0.08 0.12 0.16
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
0 8 16 24
0.0 0.1 0.2 0.3
300 s 130 s 80 s 0 s 40 s
A270nm
tR/ min l/ nm
A
16.4 Min
l/ nm
A
17.4 Min
l/ nm
A
19.6 Min T7C4-T
Abbildung 5.5: HPLC von T7C4-T in stickstoffges¨attigtem Acetonitril nach unterschiedlichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T7C4-T] = 0.099 mM;I0 = 1.67·10−8 Einstein
cm2s
Struktur in Abschnitt 5.10.3 diskutiert wird. Im Gegensatz zu der Bestrahlung in Metha-nol wird die Bildung von freiem Thymidin und die Entstehung des Peaks bei 20.8 min kaum beobachtet.
5.5 Bestrahlung der Schutzgruppe T7P4 mit Doppelbindung in Konjugation zum
Thioxanthon–Chromophor
Thymidin T7P4-T
200 250 300 350 400
0.00 0.02 0.04 0.06
200 250 300 350 400
0.00
200 250 300 350 400
0.00 0.02 0.04 0.06
200 250 300 350 400
0.0
Abbildung 5.6: HPLC von T7P4-T in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschiedlichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T7P4-T] = 0.074 mM; I0 = 3.08·10−8 Einstein
cm2s
Abbildung 5.7: M¨ogliche Produkte der Photoreaktion von T7P4-T, die dem Peak bei einer Retentionszeit von 17.6 min zugeordnet werden k¨onnten.
Bei der Belichtung der Verbindung T7P4-T mit einer Doppelbindung in Konjuga-tion zum Thioxanthon–Chromophor ist simultan mit ihrem Abbau die Entstehung von drei Produkten zu erkennen (vgl. Abbildung 5.6). Bei 6.3 min handelt es sich um den Thymidin–Peak, der aber selbst nach vollst¨andiger Photoreaktion relativ niedrig ist. Die Thymidinausbeute in stickstoffges¨attigtem Methanol betr¨agt etwa 30% (vgl. Tabellen 5.1, 5.2 und 5.3). Das außer Thymidin einzige detektierbare Endprodukt ist bei 17.6 min zu
sehen. Geht man davon aus, dass es ¨ahnliche Absorptionskoeffizienten wie das Edukt be-sitzt, so liegt seine Ausbeute bei ca. 20%, was in etwa der Thymidinausbeute entspricht.
Bei dem Produkt k¨onnte es sich sich um das Styrolderivat 113 handeln (vgl. Abbildung 5.7). Allerdings ist insbesondere die Absorptionsbande bei 324 nm f¨ur ein solches Produkt nicht typisch. Durch eine Isomerisierung zu der Verbindung 114 mit einer Konjugation zwischen Thioxanthon– und Nitrophenyl–Teil k¨onnte mit dem entstandenen neuen Ge-samtchromophor die Bande allerdings erkl¨art werden. Es w¨are aber auch m¨oglich, dass es sich um eine Nitrosoform wie z.B. die rechts in Abbildung 5.7 gezeigte Verbindung 115 handelt. Anhand der verf¨ugbaren Daten kann nicht entschieden werden, ob an der mit dem Thioxanthon konjugierten Doppelbindung eine cis– oder eine trans–Konfiguration vorliegt.
Abbildung 5.8: trans–cis–Isomerisierung von T7P4-T
Trans Cis
0 1000 2000 3000 4000 5000
0
0 1000 2000 3000 4000 5000
0
Abbildung 5.9: Kinetik-Schema und beobachtete Kinetiken f¨ur die Schutzgruppenverbin-dung T7P4-T mit einem Linker mit DoppelbinSchutzgruppenverbin-dung zwischen Thioxanthon– und Nitrophenyl–
Chromophor.
Bei einer Retentionszeit von 18.9 min entsteht intermedi¨ar eine Substanz, die nach l¨angerer Bestrahlungsdauer wieder verschwindet. Dabei handelt es sich um dascis–Isomer 116 (vgl. Abbildung 5.8) von Verbindung T7P4-T. Nach seiner Synthese liegt T7P4-T zun¨achst alstrans–Isomer vor, wie durch die NMR–Spektren best¨atigt werden konnte. Bei Bestrahlung kann es neben der Schutzgruppenabspaltung jedoch sehr leicht auch zu einer trans–cis–Isomerisierung kommen. Ebenso, wie z.B. bei dem als Aktinometer verwendeten Azobenzol, stellt sich auch hier mit der Zeit ein photostation¨arer Zustand zwischen cis– und trans–Form ein. Wie in dem Reaktionsschema in Abbildung 5.9 (links) dargestellt, kommt eine photochemische Schutzgruppenabspaltung aus beiden Isomeren in Frage. F¨ur
dieses Kinetikschema lassen sich in linearer N¨aherung des Lambert–Beerschen Geset-zes1 folgende Diffentialgleichungen aufstellen:
d[trans]
dEhν
= −kT[trans]−kTC[trans] +kCT[cis]
= k1[Trans] +kCT[Cis] (5.9)
d[cis]
dEhν
= kTC[trans]−kCT[cis]−kC[cis]
= kTC[trans] +k2[cis] (5.10)
d[Thymidin]
dEhν
= kT[trans] +kC[cis]
·ηThymidin (5.11)
mit
k1 = −kT−kTC (5.12)
k2 = −kC−kCT (5.13)
Die ersten beiden Gleichungen reichen bereits aus, um die gesuchten Geschwindigkeits-konstanten zu erhalten, mit der dritten Gleichung kann dann nachgepr¨uft werden, ob die Bildungskinetik des Produkts sich entsprechend dieser Geschwindigkeitskonstanten verh¨alt.
Die Diffentialgleichungen k¨onnen mit den folgenden Exponentialans¨atzen f¨ur die Kon-zentrationen des cis- und trans-Isomers gel¨ost werden:
[Trans](Ehν) = A·eλ1Ehν +B·eλ2Ehν (5.14) [Cis](Ehν) = C·(eλ1Ehν−eλ2Ehν) (5.15) Die Werte f¨ur A, B, C,λ1 und λ2 k¨onnen durch eine Anpassung an die Konzentrationen der trans– bzw. der cis–Form gewonnen werden. Sie h¨angen mit den
Geschwindigkeits-1Allgemein gilt
d[trans]
dt =−I0· F
V ·1−10−A
A ·ǫtrans·[trans]·d·φT+... (5.5) F¨urA→0 folgt daraus:
d[trans]
dt ≈ −I0·F·d
V ·ln10·ǫtrans·[trans]·φT+... (5.6) Woraus sich z.B. die Bedeutung der ”Ratenkonstanten”kTentnehmen l¨asst:
d[trans]
I0dt =−F·d
V ·ln10·ǫtrans·φT
| {z }
kT
·[trans] +... (5.7)
Bei den hier gew¨ahlten Bestrahlungsbedingungen gilt F·dV = 13. Damit ergibt sich zwischen kT und dem Produktǫtrans·φT, das als Maß f¨ur die Lichtempfindlichkeit destrans–Isomers dient, der folgende Zusammenhang:
kT= 0.7675·ǫtrans·φT (5.8)
Dieser Zusammenhang l¨asst sich entsprechend auch auf die Gr¨oßenkC,kTC undkCT ubertragen.¨
konstanten ¨uber die folgenden Beziehungen zusammen2: λ1 = 1
2 k1+k2+√ D
(5.16) λ2 = 1
2 k1+k2−√ D
(5.17) D = k12−2k1k2+k22+ 4kTCkCT (5.18)
A = 1 2
k1−k2+√
√ D
D (5.19)
B = −1 2
k1−k2−√
√ D
D (5.20)
C = kTC
√D (5.21)
Dabei ergeben sich aus den Gleichungen 5.19 und 5.20 bzw. 5.16 und 5.17 folgende weitere Zusammenh¨ange:
A+B = 1 (5.22)
λ1−λ2 = √
D (5.23)
F¨ur die Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten mit den oben genannten Glei-chungen muss der Konzentrationsverlauf dercis–Form bekannt sein. Zu seiner Absch¨atzung wurden die Peakfl¨achen des HPLC–Laufs einer unbestrahlten L¨osung mit demjenigen ei-ner f¨ur 40 s bestrahlten L¨osung verglichen. Nach dieser Bestrahlungsdauer waren ca. 14%
der insgesamt entstehenden Thymidinkonzentration gebildet. Geht man davon aus, dass die Gesamtkonzentration beider Isomere zu diesem Zeitpunkt ebenfalls um 14% abgenom-men hat, verbleibt daf¨ur ein Wert von 74µM·0.86 = 64µM. F¨ur das trans–Isomer kann man aus der Abnahme des Ausgangspeaks zum fraglichen Zeitpunkt eine Konzentration von 48 µM feststellen. Somit verbleibt f¨ur das cis–Isomer eine Konzentration von 16µM.
Mit diesem Wert l¨asst sich der gesamte Konzentrationsverlauf dercis–Form skalieren (vgl.
Abbildung 5.9). Außerdem kann damit das Verh¨altnis ǫtransǫcis der Absorptionskoeffizienten von trans– und cis–Isomer bei 270 nm (HPLC–Detektion) bestimmt werden. Sein Wert liegt bei 1.2.
Mit den Konzentrationsverl¨aufen des trans– und cis–Isomers konnte die Anpassung der einzelnen kinetischen Parameter folgendermaßen durchgef¨uhrt werden. Zun¨achst wur-de dietrans–Kinetik durch eine biexponentielle Funktion gefittet, und somit die Parameter A, B,λ1 und λ2 bestimmt. Mit diesen Werten f¨ur λ1 und λ2 wurde unter Anpassung des Wertes von C die Kinetik der cis–Form nach Gleichung 5.15 simuliert. Das Gleichungs-system f¨ur die kinetischen Konstanten bestehend aus Gleichung 5.16, 5.17 und 5.20 (bzw.
gleichbedeutend 5.19) wurde gel¨ost, umk1,k2 und√
Dzu erhalten. Daraufhin konnte mit Gleichung 5.21 die Konstante kTC und ¨uber Gleichung 5.18 schließlich der Wert von kCT
bestimmt werden.
Die erhaltenen Werte3 betragen 189 ·103 cmmol2 f¨ur kT, 33 ·103 cmmol2 f¨ur kC, 395 ·103 cmmol2 f¨ur kTC und 602 ·103 cmmol2 f¨ur kCT. Damit ergeben sich ǫ· φ–Werte von 246 M−1cm−1 bzw. 55 M−1cm−1 f¨ur die Photoreaktion aus dem trans– bzw. cis–Isomer. Die h¨ohere
2Die allgemeine Form dieses kinetischen Problems ist in der Reaktionskinetik h¨aufig anzutreffen. Exem-plarisch gel¨ost und ausgewertet wird es z.B. im Zusammenhang mit der zeitaufgel¨osten Untersuchung der Eximeren– und Exciplex–Fluoreszenz [166].
3Insbesondere die Werte vonkTundkCsind mit einem Fehler von ca.±10% behaftet.
Lichtempfindlichkeit des trans–Isomers ist vermutlich darauf zur¨uck zu f¨uhren, dass es leichter Konformationen einnehmen kann, in denen eine f¨ur den Energietransfer g¨unsti-ge ¨Uberlappung der entsprechenden Orbitale m¨oglich ist. Die Quantenausbeuten f¨ur die trans–cis– und cis–trans–Isomerisierung k¨onnen mit den entsprechenden Absorptionsko-effizienten berechnet werden. Legt man f¨ur die AbsorptionskoAbsorptionsko-effizienten beider Isomere bei 366 nm einen Wert von 3100 M−1cm−1 zugrunde, so erh¨alt man Quantenausbeuten von 12% bzw. 19%. Eine unterschiedliche Quantenausbeute f¨ur die trans–cis– und cis–
trans–Isomerisierung wurde z.B. auch bei Azobenzol beobachtet, wo die entsprechenden Werte 15% und 30% betragen [167].