1.3.1 Sequencing by Hybridization (SBH)
Die routinem¨aßig verwendeten Verfahren sind heute die Methoden nachMaxam–Gilbert und Sanger [7, 8]. Diese Verfahren sind optimal ausgereift, beinhalten aber gel– bzw.
kapillarelektrophoretische Trennungen, welche eine Grenze f¨ur eine weitere Beschleuni-gung dieser Methoden darstellen. Deshalb wurde das Sequencing by Hybridization auf DNA–Chips vorgeschlagen [9, 10]. Das Funktionsprinzip dieser Methode ist in Abbildung 1.4 dargestellt. Eine L¨osung mit dem Oligo– bzw. Polynukleotid (Target), dessen Se-quenz man analysieren m¨ochte, wird auf den Chip gegeben und bindet nun an die Pro-be–Oligonukleotide, deren komplement¨are Sequenzen in dem Target enthalten sind. Aus den Orten der Bindung kann man die enthaltenen Teil–Sequenzen ermitteln, und durch geeignete Aneinanderreihung der Teil–Sequenzen auf die Gesamt–Sequenz des Targets schließen (vgl. Abbildung 1.5). Auf dem Chip m¨ussen somit alle 4n m¨oglichen Kombina-tionen an Basensequenzen vorhanden sein. Bei Nonameren (n= 9) w¨aren dies 262144, bei Decameren (n = 10) bereits 1048576 Spots. Diese Methode erscheint recht leistungsstark und wurde bereits mit einem Array aus 256 verschiedenen Oktanukleotiden erfolgreich getestet [11]. Dennoch ist das Sequencing by Hybridization aber noch nicht soweit ausge-reift, dass es die klassischen Methoden der Sequenzierung ersetzen kann. Dies hat meh-rere Gr¨unde. Zun¨achst kann diese Methode keine Sequenzwiederholungen erkennen [9]
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Abbildung 1.4:Schematische Darstellung desSequencing by Hybridization. Von den Bindungs-orten kann auf die Sequenz der Probe geschlossen werden. Von den Millionen von Probes auf einem Spot ist jeweils nur eine dargestellt.
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Abbildung 1.5: Ermittlung der Basensequenz aus den Teilsequenzen beim Sequencing by Hy-bridization.
wie sie insbesondere bei h¨oheren Organismen h¨aufig vorkommen. Außerdem sind die Se-lektivit¨at und Sensitivit¨at noch nicht so optimiert, dass man ohne jegliche Zweifel in allen F¨allen ein Bindungs– von einem Nichtbindungs–Ereignis unterscheiden kann. Die Verbesserung dieser Schwachstellen und die Verwendung von bioinformatischen und kom-binatorischen Methoden zur weiteren Absicherung der Ergebnisse k¨onnen aber hoffentlich bald zur Durchsetzung dieser Methode beitragen.
1.3.2 Genotyping Analysis
Nach der k¨urzlich erfolgten Aufkl¨arung einer repr¨asentativen Sequenz des menschlichen Erbguts, ist es interessant zu wissen, inwieweit sich Individuen von dieser Sequenz unter-scheiden. Meistens handelt es sich bei diesen Ver¨anderungen um Mutationen von nur einer Base in der Sequenz des interessierenden Gens, so genannten Single Nucleotide Polymor-phisms (SNPs), denen die aktuelle Genomforschung besondere Aufmerksamkeit schenkt.
F¨ur ihre schnelle Aufkl¨arung sind DNA–Chips geradezu ideal [12].
Die Schwierigkeit besteht darin, ein Perfect Match–Bindungsereignis zwischen Probe und Target von einem Bindungsereignis mit einer Fehlpaarung, einem Mismatch Pair zu unterscheiden. Denn auch bei einer Fehlpaarung, je nachdem an welcher Stelle sie auftritt und welchen Anteil an Adenin–Thymin–Sequenzen im Vergleich zu stabileren Guanin–
Cytosin–Sequenzen der gebildete Duplex besitzt, kann man normalerweise ein Bindungs-signal detektieren. Ohne ein ReferenzBindungs-signal ist es daher schwierig zu entscheiden, ob es sich um einen Perfect Match handelt. Zur L¨osung dieses Problems werden pro interessie-rendem SNP alle vier m¨oglichen Basenvariationen dieser Stelle auf den Chip immobilisiert (vgl. Abbildung 1.6). DieTarget–DNA–St¨ucke der zu analysierenden Sequenz binden nun bevorzugter an die komplement¨aren St¨ucke der immobilisiertenProbes als an eine der drei nicht–komplement¨aren Probes. Das st¨arkste Signal unter den vier Variationen zeigt also
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Abbildung 1.6: Schematische Darstellung der Verwendung von DNA–Chips zur Genotyping Analysis. Die vier Spots enthalten bis auf eine Base, die durchpermutiert wird und in der Dar-stellung fett markiert ist, identische Oligonukleotidsequenzen. Das Target bindet bevorzugt an den Spot mit komplement¨arer Sequenz, wodurch bei der Detektion an dieser Stelle die h¨ochste Fluoreszenz zu beobachten ist.
die Perfect Match Bindungsstelle auf.
Mit dieser Methode kann man DNA–Chips so konzipieren, dass man parallel Infor-mationen ¨uber s¨amtliche SNPs bekommt. Diese M¨oglichkeit birgt ein großes Potential f¨ur Fortschritte in Medizin und Biologie.
1.3.3 Gene Expression Profiling
Die Genexpressionsanalyse ist eine Momentaufnahme der in der Zelle vorhandenen mRNA.
Viele biochemische Vorg¨ange, die u.a. das Auftreten gewisser Krankheiten und die Wir-kungsweise von Medikamenten erkl¨aren, k¨onnen auf Ver¨anderungen in der Genexpression zur¨uck verfolgt werden. DNA–Chips k¨onnen Einblicke in die gewebe– und entwicklungs-spezifische Genexpression und die Auswirkungen ¨außerer Einfl¨usse auf die Genexpression geben. So besitzen z.B. sowohl Raupe als auch Schmetterling das gleiche Genom, und den-noch zeigen sie aufgrund ihrer unterschiedlichen Genexpression unterschiedliche Ph¨ano-typen, d.h. Erscheinungsformen. Der große Vorteil von DNA–Chips gegen¨uber herk¨omm-lichen Verfahren ist, dass die Expression von Tausenden von Genen simultan verfolgt werden kann.
Hierzu wird mit der aus der Zelle gewonnenen mRNA eine inverse Transkription durchgef¨uhrt, mit der zugleich auch Fluoreszenzsonden eingef¨uhrt werden. Die erhalte-nen, markierten cDNA–Target–Str¨ange werden auf den Chip gegeben und hybridisieren dort mit ihren komplement¨aren Sequenzen. Das durch Auslesen des Chips gewonnene Bild enth¨alt Informationen ¨uber die Genexpression [13]. Besonders interessant ist auch ein direkter Vergleich von zwei verschiedenen Proben (vgl. Abbildung 1.3). Dazu k¨onnen DNA–Str¨ange unterschiedlichen Ursprungs mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (z.B.
gr¨un und rot) markiert und beide zur Hybridisierung auf einen Chip gegeben werden. Da-nach fluoreszieren dieSpots entweder gar nicht, in einer der beiden Farben (z.B. gr¨un bzw.
rot) oder in der positiven Mischfarbe (z.B. gelb = gr¨un + rot). Erscheint keine Farbe, so ist in keiner Analyse eine zum immobilisierten Oligonukleotid komplement¨are Sequenz enthalten. Fluoresziert der Spot in der Mischfarbe, dann wurde die komplement¨are Se-quenz in beiden F¨allen exprimiert. Wesentlich interessanter sind aber die F¨alle, bei denen nur eine Farbe erscheint und somit nur die Targets einer der beiden Analysen mit den Probe–Str¨angen des Spots hybridisieren, denn sie zeigen Unterschiede zwischen den
Gen-expressionen der beiden untersuchten Proben auf. Gerade an diesen Unterschieden ist man interessiert, denn diese k¨onnen z.B. den Unterschied zwischen einer gesunden und kranken (Tumor–)Zelle aufzeigen, und sind somit ein Schl¨ussel f¨ur das Design neuer Medikamente.
Weitere neuere Entwicklungen der DNA–Chiptechnologie sind in einem ¨ Ubersichtsar-tikel von Stahl zusammengefasst [14]. Arbeitsweisen und Anwendungsbeispiele k¨onnen dem Buch ”DNA Microarrays” entnommen werden [15].