und Thioxanthon–Chromophor
Zus¨atzlich zum Standardtestprogramm der anderen Schutzgruppen in dieser Arbeit, f¨ur die nur Thymidin als Testnukleosid fungierte, wurden mit der T5D0–Schutzgruppe alle vier Nukleoside Thymidin, Desoxycytosin, Desoxyadenosin und Desoxyguanosin photola-bil gesch¨utzt4 (vgl. Abbildung 5.11), um die Abh¨angigkeit der Schutzgruppenabspaltung von dem gesch¨utzten Nukleosid zu untersuchen. Hierzu mussten zun¨achst die st¨orenden Aminogruppen mit Acetyl (Verbindung T5D0-dCAc), Benzyl (Verbindung T5D0-dABn) bzw. als Amidin (Verbindung T5D0-dGAm) gesch¨utzt werden (vgl. Abbildung 5.11). Die Bestrahlungen dieser Verbindungen sind im Folgenden beschrieben und werden in Bezug auf ihre Kinetik in Kapitel 5.13 noch genauer diskutiert.
200 250 300 350 400 450
0
200 250 300 350 400 450
0
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0
200 250 300 350 400 450
0
T5D0-dCAc T5D0-dGAm
T5D0-dABz
dABz
dGAm T
dCAc
Abbildung 5.11:Die vier mit T5D0 gesch¨utzten Nukleoside, deren Verhalten unter station¨arer Belichtung untersucht wurde, und deren Absorptionsspektren in Methanol. Als Vergleich sind außerdem die Absorptionsspektren der entsprechenden Nukleoside mit freier 5’-OH–Gruppe ge-zeigt.
4F¨ur die Herstellung von T5D0-dCAc, T5D0-dABnund T5D0-dGAm danke ichJ. Smirnova.
5.7.1 T5D0–gesch¨ utztes Thymidin (T5D0 − T)
Thymidin
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02 0.03
200 250 300 350 400
0.000
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04
200 250 300 350 400
0.000
Abbildung 5.12: HPLC von T5D0-T in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschiedlichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T5D0-T] = 0.042 mM;I0 = 3.39·10−8 Einsteincm2s
Bei der in Abbildung 5.12 gezeigten Bestrahlung von T5D0-T ist schon nach ca. 30 s nur noch die H¨alfte des gesch¨utzten Thymidins (Retentionszeit tR = 16.6 min) vorhan-den. Mit gleicher Kinetik entsteht auch das bei tR = 7.3 min detektierbare Thymidin.
Außerdem sind Produkte bei tR = 18.3 min, 20.8 min und 15.2 min zu finden, wobei die Konzentration von letzterem bei einer Bestrahlungszeit von ca. 100 s ein Maximum durchl¨auft und danach wieder etwas abnimmt. Die Substanzen bei tR = 15.2 min und 20.8 min besitzen recht ¨ahnliche UV–Spektren mit Maxima bei 260 nm und 375 nm. Das l¨angstwellige Maximum ist im Vergleich zu T5D0-T (Spektrum in Abbildung 5.11) batho-chrom verschoben und weist ein im Vergleich zu T5D0-T sehr unterschiedliches Aussehen auf. Bei den beiden Verbindungen handelt es sich, wie genauer in Abschnitt 5.7.5 disku-tiert, um zwei Nitrosoformen. Außerdem entsteht zun¨achst ein Peak bei tR = 24.0 min, der aber sehr schnell wieder verschwindet und ein dem T5D0-T ¨ahnliches Spektrum zeigt.
Hierbei handelt es um das entprechende Styrolprodukt (vgl. Abschnitt 5.7.5).
5.7.2 T5D0–gesch¨ utztes Desoxyguanosin–Amidin (T5D0 − dG
Am)
Die Chromatogramme nach der Bestrahlung von T5D0-dGAm (Abbildung 5.13) sehen denjenigen von T5D0-T ¨ahnlich. Es entsteht freies dGAm bei einer Retentionszeit von 6.6 min und ein Produkt bei 19.6 min, welches ein identisches UV–Spektrum wie das Pro-dukt bei tR = 20.8 min aus der Bestrahlung des gesch¨utzten Thymidins aufweist. Trotz der etwas unterschiedlichen Retentionszeiten, kann man davon ausgehen, dass es sich bei diesem Produkt bei beiden Bestrahlungen um die gleiche Substanz handelt. Es wurde oft beobachtet, dass die Rententionszeiten bei unterschiedlichen HPLC–L¨aufen nicht konstant sind. Ebenso scheint die Substanz mit einem Peak bei tR = 22.6 min identisch mit der Substanz beitR = 24.0 min der letzten Bestrahlung zu sein, da beide Verbindungen iden-tische UV-Spektren besitzen. Der Peak verschwindet ebenso wie im Falle der Bestrahlung
200 250 300 350 400
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02 0.03
200 250 300 350 400
0.000
Abbildung 5.13: HPLC von T5D0-dGAm in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschied-lichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T5D0-dGAm] = 0.084 mM; I0 = 2.04·10−8 Einsteincm2s
von T5D0-T mit zunehmender Bestrahlungsdauer wieder. Ein deutlicher Unterschied zur Bestrahlung von T5D0-T besteht bei dem Peak bei tR = 12.3 min. Sein UV–Spektrum weist bei 300 nm eine zus¨atzliche Absorptionsbande auf, die vermutlich von Guanin im Molek¨ul stammt. Bei der Bestrahlung des Thymidinderivats ist es aufgrund der zusam-menfallenden Absorptionmaxima von Thymidin und Thioxanthon schwer zu beurteilen, ob das Produkt bei tR = 15.2 min den Thymidin–Chromophor noch enth¨alt.
5.7.3 T5D0–gesch¨ utztes Benzyl–Desoxyadenosin (T5D0 − dA
Bn)
Abbildung 5.14 zeigt die Bestrahlung von T5D0–gesch¨utztem Benzyl–Desoxyadenosin T5D0-dABn. Hier ist gleichzeitig mit der Abnahme des Reaktanden die Entstehung von Produkten bei Retentionszeiten von 7.5 min, 15.9 min, 20.0 min, und 23.0 min zu be-obachten. Der Peak bei 7.5 min besitzt ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und ist dem benzylierten Adenosin dABn zuzuordnen. Der HPLC–Peak bei 15.9 min zeigt Ab-sorptionsmaxima bei 374 nm und 267 nm. Sein Absorptionsspektrum ist demjenigen des Peaks bei tR = 20.0 min mit Maxima bei 377 nm und 265 nm recht ¨ahnlich. Es handelt sich dabei wie bei den anderen Bestrahlungen der T5D0–gesch¨utzten Nukleoside um zwei Nitroso–Verbindungen. Das Signal bei einer Retentionszeit von 23.0 min ist mit identi-schem UV-Spektrum und ¨ahnlicher Entstehungs– und Zerfallskinetik wie bei den anderen T5D0–gesch¨utzten Nukleosiden dem Styrolprodukt zuzuordnen (vgl. Abschnitt 5.10.2).
5.7.4 T5D0–gesch¨ utztes Acetyl–Desoxycytidin (T5D0 − dC
Ac)
Die Bestrahlung von T5D0–gesch¨utztem Acetyl–Desoxycytidin T5D0-dCAc (vgl. Abbil-dung 5.15) f¨uhrt zu f¨unf detektierbaren Produkten. Bei einer Retentionszeit von 6.5 min erscheint das acetylierte Cytidin dCAc mit seinen Absorptionsmaxima von 298 nm, 246 nm und 215 nm. Die bei 15.4 min eluierte Verbindung zeigt Absorptionsmaxima bei 377 nm, 265 nm, 255 nm und eine Schulter bei 297 nm, und konnte einer Nitroso–Verbindung
T5D0-ABn dABn
200 250 300 350 400
0.00 0.04 0.08 0.12
200 250 300 350 400
0.00 0.02 0.04 0.06
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02 0.03
200 250 300 350 400
0.000
Abbildung 5.14: HPLC von T5D0-dABn in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschied-lichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T5D0-dABn] = 0.080 mM;I0 = 2.11·10−8 Einsteincm2s
200 250 300 350 400
0.00 0.04 0.08 0.12
200 250 300 350 400
0.00 0.01 0.02 0.03
200 250 300 350 400
0.00 0.02 0.04 0.06
200 250 300 350 400
0.000
Abbildung 5.15: HPLC von T5D0-dCAc in stickstoffges¨attigtem Methanol nach unterschied-lichen Bestrahlungsdauern mit 366 nm; [T5D0-dCAc] = 0.089 mM; I0 = 2.55·10−8 Einsteincm2s
zugeordnet werden. Im Vergleich zu dem UV–Spektrum des entsprechenden Produkts bei der Bestrahlung von T5D0-T bzw. T5D0-dABn fallen die zus¨atzlichen Absorptionen um 255 nm und 297 nm auf, die bei dem hier betrachteten Produkt auf das Vorhandensein von Cytidin hinweisen. Der Peak bei tR = 19.6 min wurde nicht weiter zugeordnet. Die Verbindungen bei tR = 21.4 min und 24.4 min zeigen die gleichen Absorptionsspektren wie die entsprechenden Peaks bei den anderen T5D0–gesch¨utzten Nukleosiden. Daher liegt die Vermutung nahe, dass es sich jeweils um die gleichen Produkte handelt, die im Folgenden kurz diskutiert werden.
5.7.5 Diskussion der Photoprodukte der T5D0–gesch¨ utzten Nukleoside
Die Bestrahlung der T5D0–gesch¨utzten Nukleoside f¨uhrt prinzipiell zu den gleichen Pho-toreaktionen. Neben dem Abbau des Edukts, ist die Entstehung von haupts¨achlich vier Produkten zu beobachten. Zum einen ist dies das entsch¨utzte Nukleosid, das bei sehr fr¨uhen Retentionszeiten erscheint. Des Weiteren wird kurz vor dem Edukt ein Produkt eluiert, das in allen F¨allen ein Maximum bei 375 nm besitzt. Bei Wellenl¨angen unterhalb von 350 nm unterscheiden sich die Spektren jedoch signifikant. Bei diesen Substanzen handelt es sich um die entsprechenden Nitrosoalkohole 120 (vgl. Abbildung 5.17), die immer noch das Nukleosid enthalten. Die Absorptionsmaxima der Nukleoside sind in den Spektren dieser Substanzen eindeutig zu erkennen. Die Spektren der beiden am langsams-ten eluierlangsams-ten Substanzen bei einer Relangsams-tentionszeit von ca. 20 min bzw. 23 min sind v¨ollig unabh¨angig davon, welches gesch¨utzte Nukleosid bestrahlt wurde (vgl. Abbildungen 5.12, 5.13, 5.14 und 5.15). Hierbei handelt es sich zum einen um das zyklisierte Nitroso–Produkt 121, dessen Entstehung in Abschnitt 5.10.4 genauer diskutiert wird, und zum anderen um das Styrol–Produkt 119 (vgl. Abschnitt 5.10.2). Sowohl das zyklisierte Nitroso–Produkt als auch das Styrol–Produkt enthalten kein Nukleosid mehr. Diese Produkte sind in allen Bestrahlungen identisch.