1.6.1 Sensibilisierung in homogener L¨ osung
Unter Sensibilisierung versteht man die Induktion einer Photoreaktion durch einen in der Gesamtbilanz nicht an der Photoreaktion beteiligten Absorber. In der Regel erfolgt eine Sensibilisierung mittels einer elektronischen Energie¨ubertragung von einem Sensibilisa-tor (Energiedonor) auf ein reagierendes Substrat (EnergieakzepSensibilisa-tor, Quencher), das nor-malerweise durch eine direkte (=nicht–sensibilisierte) Bestrahlung nicht so effektiv zur Reaktion gebracht werden kann. Erste Versuche zur Sensibilisierung von NPPOC wur-den von Stefan Walbert mit Benzophenon durchgef¨uhrt [50]. Urspr¨unglich waren sie zur Best¨atigung des Mechanismus ¨uber einen Triplettzustand gedacht (vgl. voriger Ab-schnitt), doch entwickelte sich daraus die Idee, die Sensibilisierung zu benutzen, um die Schutzgruppenabspaltung bei der DNA–Chip–Synthese zu beschleunigen. Durch Substi-tution amo–Nitrophenylaromaten war dies, wie bereits beschrieben, nur schwer m¨oglich.
Idealerweise erm¨oglicht die Sensibilisierung, durch den erh¨ohten Absorptionskoeffizienten ǫdes Sensibilisators eine Verbesserung der Aufnahme der Lichtenergie ohne die Quanten-ausbeute φ zu beeinflussen. Dies f¨uhrt insgesamt zu einer h¨oheren Lichtempfindlichkeit ǫ×φder Schutzgruppenabspaltung. Das Prinzip der Sensibilisierung ist zwar schon relativ lange bekannt, doch auf photolabile Schutzgruppen wurde es vor unseren Arbeiten noch nie angewandt. Hierzu musste zun¨achst ein geeigneter Sensibilisator gefunden werden, der bei 366 nm einen hohen Absorptionskoeffizienten aufweist und zus¨atzlich die wei-teren geforderten Eigenschaften besitzt (vgl. Seite 28). Benzophenon ist nicht geeignet, da es bei 366 nm kaum Licht absorbiert. Aber es stellte sich heraus, dass zwei Derivate von Benzophenon, n¨amlich Thioxanthon und Acridon gute Sensibilisatoren sind, wobei sich ersteres wegen seiner h¨oheren Photostabilit¨at unter den verwendeten Bedingungen besser eignet [34]. Die Triplettenergie von Thioxanthon betr¨agt ca. 265 kJ mol−1 und liegt somit etwas h¨oher als die Triplettenergie von Nitrobenzol, die je nach Polarit¨at des L¨osungsmittels zwischen 243 und 252 kJ mol−1variiert [52]. Im Rahmen meiner Diplomar-beit konnte ich mit blitzlichtspektroskopischen Untersuchungen zeigen, dass Thioxanthon die aufgenommene Lichtenergie mit einer etwas l¨osungsmittelabh¨angigen Geschwindig-keitskonstanten von ca. 2 ·109 M−1s−1 an den o–Nitrophenylchromophor weitergeben kann. Außerdem konnte auch unter diesen Bedingungen der Sensibilisierung die Acinitro–
Form der NPPOC–Gruppe mit ihrem Absorptionsmaximum bei 400 nm und ihrer cha-rakteristischen Abklingdauer im Bereich von 10−4 s nachgewiesen werden. Sie entsteht in dem Maße wie der Triplettzustand des Sensibilisators abklingt. Der Triplettzustand der NPPOC–Gruppe konnte jedoch ebenso wenig wie bei einer direkten Anregung nach-gewiesen werden. Nach Hurley et al. besitzt der Triplettzustand des Nitrobenzol eine Lebensdauer von ca. 1 ns [53]. Die Lebensdauer des NPPOC–Tripletts sollte sich davon nicht zu stark unterscheiden. Die Zeitaufl¨osung unserer Apparatur (ca. 10 ns) erlaubt es deshalb nicht, ihn direkt nachzuweisen. In den L¨osungsmitteln Methanol und Acetonitril waren keine chemischen Reaktionen des Sensibilisators zu beobachten, w¨ahrend in THF und 1,4–Dioxan chemische Zwischenprodukte und ein Zerfall des Sensibilisators gefunden wurde, der auf eine Reaktion mit dem L¨osungsmittel zur¨uckzuf¨uhren ist.
Um die Kinetik und Produkte der Photoreaktion zu charakterisieren, wurden kontinu-ierliche Bestrahlungen bei 366 nm durchgef¨uhrt, das Reaktionsgemisch nach verschiedenen Bestrahlungszeiten mittels HPLC aufgetrennt und UV–spektroskopisch charakterisiert.
Die Kinetik des noch nicht umgesetzten NPPOC–gesch¨utzten Thymidins (NPPOC-T) ist
in Abbildung 1.11 gegen die in die Probe eingestrahlte Lichtenergie, f¨ur die das Produkt aus Bestrahlungsdauer tund Lichtintensit¨atI0,Eein Maß ist (vgl. Seite 145), aufgetragen.
Es ist hierbei klar zu erkennen, dass die Abspaltung der Schutzgruppe mit Sensibilisator
0 500 1000 1500 2000 2500
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
t * I 0,E
* 10 8
/ E cm -2 NPPOC-T
in luftges. MeOH
NPPOC-T und Thioxanthon
in luftges. MeOH
NPPOC-T und Thioxanthon
in stickstoffges. MeOH
[NPPOC-T]/[NPPOC-T] 0
Abbildung 1.11: Photokinetik des NPPOC–gesch¨utzten Thymidins (NPPOC-T) unter stati-on¨arer Belichtung mit 366 nm in MeOH. Die Konzentration sind [NPPOC] = 0.087 mM und [Thioxanthon] = 0.120 mM. Die Kurven sind mit Gleichung 1.1 angepasst [34].
um einen Faktor von ca. 5 beschleunigt werden kann. Dies ist aber nur dann m¨oglich, wenn unter Ausschluss von Sauerstoff gearbeitet wird. In luftges¨attigter L¨osung wurde unter den gew¨ahlten Bedingungen sogar eine Verlangsamung der Schutzgruppenabspal-tung beobachtet (vgl. Abbildung 1.11). Sauerstoff l¨oscht n¨amlich den Triplettzustand des Thioxanthons sehr effektiv, d.h. der Thioxanthontriplett kann seine Energie auf Sauerstoff statt auf NPPOC ¨ubertragen. Wegen dieses Konkurrenzprozesses wird kaum noch Energie auf die NPPOC–Schutzgruppe ¨ubertragen. Diese reagiert dann haupts¨achlich durch die schwache direkte Aufnahme der Lichtenergie. Da Thioxanthon aber einen Teil der Licht-energie abf¨angt und somit als innerer Filter wirkt, empf¨angt die NPPOC–Gruppe weniger Licht als bei Abwesenheit von Thioxanthon. Dadurch kommt es zu einer Verlangsamung der Reaktion.
Die Kinetik l¨asst sich photochemisch mit der Gleichung d[Q]
dt =c·
ǫQ·[Q]·φdir+ǫSens·[Sens]·φ0Sens·ηq
(1.1) modellieren. Hier bedeuten [Q] die Quencherkonzentration, t die Bestrahlungsdauer, ǫQ
den Absorptionskoeffizienten der Schutzgruppe (des Quenchers), φdir die Quantenaus-beute der direkten Schutzgruppenabspaltung und ǫSens den Absorptionskoeffizienten des Sensibilisators. Die Konstante cist durch den Ausdruck
c=−IE,0· F
V ·Fpk(A)−1·d (1.2)
definiert und fasst charakteristische photokinetische Gr¨oßen wie die Lichtintensit¨at IE,0, die bestrahlte Fl¨acheF, das bestrahlte VolumenV, die Schichtdickedund der photokine-tische FaktorFpk(A) zusammen. Die Gr¨oßeφ0Sensentspricht der Gesamt–Quantenausbeute der sensibilisierten Schutzgruppenabspaltung f¨ur den Fall, dass jeder Sensibilisatortriplett durch eine Energie¨ubertragung auf die Schutzgruppe gel¨oscht wird. Sie ergibt sich als das Produkt aus der Intersystem Crossing–Quantenausbeute φisc des Sensibilisators, der Energie¨ubertragungseffizienzηET und der Quantenausbeute der photolabilen Schutzgrup-penreaktion φplsr,T aus dem Triplettzustand:
φ0Sens =φisc·ηET·φplsr,T (1.3) Die Energie¨ubertragungseffizienzηET gibt den Bruchteil an, mit dem die Energie¨uber-tragung in Konkurrenz zu anderen L¨oschmechanismen zur bimolekularen L¨oschung des Sensibilisatortripletts beitr¨agt. Die Quencheffizienz ηq l¨asst sich berechnen nach
ηq= kq·[Q]
k0+kq·[Q] +kq,P·([Q]0−[Q]) +kq,O2 ·[O2] (1.4) wobei kq die Quenchkonstante des Substrats, k0 die Geschwindigkeitskonstante der mo-nomolekularen Desaktivierung des Sensibilisator–Triplettzustands bei Abwesenheit eines Quenchers und [Q]0 die eingewogene Quencherkonzentration ist. Außerdem muss ber¨uck-sichtigt werden, dass auch das chemische Produkt der Schutzgruppenabspaltung den Sen-sibilisator l¨oschen kann. Deshalb muss die Ratenkonstante kq,P der L¨oschung durch das Produkt eingef¨uhrt werden. Bei Anwesenheit von Sauerstoff muss schließlich noch der Quenchterm kq,O2 ·[O2] ber¨ucksichtigt werden. In luftges¨attigter L¨osung hat kq,O2 ·[O2] einen Wert von 7.0·106 s−1 in Methanol und 1.1·107 s−1 in Acetonitril [34] und macht somit die Quencheffizienz der sensibilisierten Reaktion sehr klein. Mit der Sauerstoffkon-zentration von 2.2·10−3 M und 1.9·10−3 M in Methanol bzw. Acetonitril [52] ergeben sich Werte der bimolekularen Quenchkonstanten kq,O2 von 3.2·109 M−1s−1 bzw. 5.8·109 M−1s−1.
Bei den detektierten Produkten handelte es sich haupts¨achlich um das in Abbildung 1.9 gezeigte Styrol– und Nitrosoprodukt. Welches dieser Produkte entsteht, h¨angt vor allem vom L¨osungsmittel und von eventuellen Zus¨atzen ab. Die Produktzusammenset-zung wurde durch Sensibilisierung nicht ver¨andert. In Methanol wurde haupts¨achlich das Styrolderivat beobachtet, w¨ahrend eine Bestrahlung in Acetonitril gr¨oßtenteils zur Entste-hung des unerw¨unschten Nitroso–Produkts f¨uhrte. Durch Zugabe geeigneter Basen konnte das intermedi¨are S¨aure–Basen–Gleichgewicht der Acinitro–Form allerdings so verschoben werden, dass auch hier ¨uberwiegend die gew¨unschte Schutzgruppenabspaltung stattfin-det. Viele verwendete Basen, insbesondere solche, die Wasserstoffatome in α–Position zum Stickstoff besitzen, erwiesen sich als ungeeignet, da sie photochemisch mit Thio-xanthon reagierten. Als beste Base stellte sich daher Ammoniak heraus. Ansonsten war Thioxanthon unter den gew¨ahlten Bedingungen jeweils stabil.
F¨ur die Bestimmung der Thymidinausbeuten wurde zun¨achst eine Eichung mit ver-schiedenen Thymidinkonzentrationen durchgef¨uhrt. Ein Vergleich der HPLC–Peakfl¨achen nach den Bestrahlungen mit dieser Eichung ergab die Ausbeuten an Thymidin. Sie un-terschieden sich bei der sensibilisierten Schutzgruppenabspaltungen nicht merklich von denjenigen der direkten Abspaltungen. Unter Bedingungen, bei denen keine Nitroso–Form gebildet wurde, lagen sie bei ca. 90%.
Unsere Idee der Sensibilisierung der Schutzgruppenabspaltung wurde in der Literatur bereits von Shaginian et al. aufgegriffen [54]. Durch Zugabe von 0.1% Thioxanthon konn-ten sie die photolabile 3,4,5–Trimethyoxyphenylacyl(TMP)–Schutzgruppe bei ohne Sensi-bilisierung ineffektiven Wellenl¨angen von 350–420 nm ohne Qualit¨atseinbußen abspalten.
Außerdem beschreibt ein 2005 erschienener Artikel von Sundararajan et al., dass die photochemische Entsch¨utzungsreaktion von mitN–Alkyl–4–picoliniumestern gesch¨utzten Carbons¨auren durch Benzophenon bzw. Carbazol als intramolekular verkn¨upften Sensi-bilisator beschleunigt werden konnte [55].
1.6.2 Sensibilisierung auf dem Chip
Nachdem die Sensibilisierung in homogener L¨osung gut funktionierte, wurden bei unse-rem Kooperationspartner, der NimbleGen Systems Inc., Tests mit sensibilisierter Photo-reaktion auf dem Chip durchgef¨uhrt. Unter Standardbedingungen wurden DNA–Chips zun¨achst ohne und anschließend mit Sensibilisator hergestellt. Es stellte sich heraus, dass die optimalen Belichtungszeiten durch Sensibilisierung um einen Faktor von ca. 3 ver-ringert werden konnten. Die Oligonukleotidausbeuten waren mit 97% im Rahmen der Messgenauigkeit genauso hoch wie bei den direkten (nicht–sensibilisierten) Bestrahlun-gen (97.5%).
0 3 6 9 12
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Entschützung auf dem Chip
direkte Bestrahlung ohne Thioxanthon
mit Thioxanthon sensibilisierte Bestrahlung
σ R
/σ 0
Lichtenergie / J cm -2
Abbildung 1.12: Photokinetik der Entsch¨utzungsreaktion von NPPOC-T auf einem Chip.
Eine Chipoberfl¨ache mit einer einzelnen Schicht von NPPOC-T auf dem Glassubstrat wurde jeweils f¨ur unterschiedlich lange Zeiten bestrahlt. Der Verlauf der Entsch¨utzung wurde ¨uber die Fluoreszenzintensit¨at gemessen, die sich nach Kupplung der entsch¨utzten OH–Gruppen mit dem Fluoreszenzlabel Cy-3 ergaben. Aus der Fluoreszenzintensit¨at ergibt sich die relative Ober-fl¨achenbelegungsdichte σσR0 der noch intakten Schutzgruppen. Die Kurven wurden durch eine kinetische Simulation entsprechend Gleichung 1.5 erhalten. [32]
In Abbildung 1.12 ist die Abnahme der Oberfl¨achenbelegungsdichte mit intakten Schutzgruppen–Verbindungen gegen die auf den Chip gestrahlte Lichtenergie, die pro-portional zur Bestrahlungsdauer ist, aufgetragen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der sensibilisierten Reaktion eine ann¨ahernd vollst¨andige Entsch¨utzung bereits nach 4 J cm−2 erreicht wird, w¨ahrend dies bei der nicht–sensibilisierten Abspaltung erst nach ca. 12 J cm−2 der Fall ist. Außerdem existieren signifikante Unterschiede in der Kinetik der
sensi-bilisierten im Vergleich zur direkten Abspaltung. Statt einer exponentiellen Abbaukinetik (Reaktion 1. Ordnung) ergibt sich ein ann¨ahernd linearer Zusammenhang (Reaktion 0.
Ordnung).
t0
× D
homogene Lösung Chipoberfläche
Abbildung 1.13: Vergleich der Verteilung von Sensibilisator und Schutzgruppenverbindungen in homogener L¨osung bzw. auf einer Chipoberfl¨ache (genaue Erl¨auterung siehe Text).
Zur theoretischen Behandlung der jeweiligen Kinetik ist es erforderlich, sich zun¨achst einmal die unterschiedlichen Situationen der sensibilisierten Schutzgruppenabspaltung in homogener L¨osung und auf dem Chip zu veranschaulichen (vgl. Abbildung 1.13). In ho-mogener L¨osung sind sowohl Sensibilisator also auch Schutzgruppenverbindung homogen verteilt. Jedes im Volumen angeregte Sensibilisatormolek¨ul hat die gleiche Chance einen Reaktionspartner zu finden. Auf dem Chip ist die Schutzgruppenverbindung hingegen kovalent an die Oberfl¨ache gebunden, so dass eine Energie¨ubertragung nur m¨oglich ist, wenn ein Sensibilisatormolek¨ul in unmittelbarer N¨ahe der Oberfl¨ache angeregt wird.
Die Photokinetik der Oberfl¨achenbelegungsdichte σQ des mit NPPOC gesch¨utzten Thymidins NPPOC-T auf dem Chip kann durch Gleichung 1.5 beschrieben werden. Sie wurde zun¨achst durch die Betrachtung der Diffusion an eine Oberfl¨ache aufgestellt, und anschließend in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Nikita Lukzenstreng abgeleitet.
dσQ
dt =−I0·ln(10)·
ǫQ·σQ·φdir+ǫSens·[Sens]·p
D·τ0·φ0Sens· k′qσQ
k0+k′qσQ
(1.5) Diese Kinetik ¨ahnelt der in Gleichung 1.1 beschriebenen Situation, weist aber wichtige Anderungen auf, die sich aus den ver¨anderten geometrischen Bedingungen ergeben (vgl.¨ Abbildung 1.13). Da die Lichtabsorption nur in einer sehr d¨unnen Schicht stattfindet, kann die Gleichung durch eine Linearisierung des Lambert–Beer–Gesetzes nach Glei-chung 1.6 vereinfacht werden, denn der photokinetische Faktor geht f¨ur kleine Werte der Absorbanz gegen ln 10:
1−10−A
A = 1·1−e−A·ln(10) A
A→0−→ 1−(1 + (−A·ln(10))
A = ln(10) (1.6)
Analog zu Gleichung 1.1 beschreibt in Gleichung 1.5 der erste Summand in der Klam-mer der rechten Seite den kinetischen Anteil der direkten, der zweite Summand den der sensibilisierten Photoreaktion. Die photolabilen Schutzgruppen sind nun aber nicht mehr homogen in der L¨osung verteilt, sondern sitzen fest verankert auf der Chipoberfl¨ache.
Ein angeregtes Sensibilisatormolek¨ul muss somit w¨ahrend seiner Triplettlebensdauer zu den Schutzgruppen auf der Oberfl¨ache diffundieren, um seine Triplettenergie auf diese ubertragen zu k¨onnen. Dies ist aber nur f¨ur diejenigen Sensibilisatormolek¨ule m¨oglich,¨ die sich bei Anregung nicht zu weit von der Oberfl¨ache entfernt befinden. Diese mittlere Entfernung ist durch die L¨ange √
D·τ0 charakterisiert, wobei D der Diffusionskoeffizient und τ0 die Triplettlebensdauer des Sensibilisators ist. Der Quotient im letzten Term von Gleichung 1.5 entspricht der Wahrscheinlichkeit, dass ein angeregtes Sensibilisatormolek¨ul durch ein Substratmolek¨ul gel¨oscht wird, sobald es die Chipoberfl¨ache erreicht hat. Diese Wahrscheinlichkeit ist f¨ur hinreichend hohe BelegungsdichtenσQ gleich 1, nimmt aber ge-gen Ende der Abspaltung ab, da es auf der Oberfl¨ache immer weniger Schutzgruppen gibt, welche mit einem angeregten Sensibilisatormolek¨ul in Wechselwirkung treten k¨onnen. Aus einer Anpassung der Kinetiken auf dem Chip wird deutlich, dass der Quotient bis zu der Abspaltung der meisten Schutzgruppen den Wert 1 besitzt, d.h. fast bis zu ihrem Ende ist diese Reaktion diffusionskontrolliert. Bei der nicht–sensibilisierten Reaktion handelt es sich um eine Reaktion erster Ordnung. Dies kommt in dem ersten Term auf der rech-ten Seite in Gleichung 1.5 zum Ausdruck. Im Falle der sensibilisierrech-ten Reaktion dagegen dominiert der zweite Term. Da hierin zun¨achst kq′σQ ≫ k0 gilt, ist der Einfluss von σQ
vernachl¨assigbar und es ergibt sich eine Reaktion nullter Ordnung, d.h. die Geschwindig-keit der Entsch¨utzungsreaktion ist vom Reaktionsumsatz unabh¨angig. Damit erg¨abe sich f¨ur die sensibilisierte Photoreaktion in Abbildung 1.12 ein linearer Abfall von 0 bis knapp 3 J cm−2. Die leichte Abweichung von der nullten Ordnung ist durch den Beitrag der direkten Abspaltung erster Ordnung zu erkl¨aren. Dieses kinetische Verhalten ist f¨ur die Chipherstellung besonders g¨unstig, da unter den ¨ublichen Bedingungen der Chipherstel-lung bei einer Reaktion nullter Ordnung eine (ann¨ahernd) vollst¨andige Abspaltung viel schneller erreicht werden kann als bei einer Reaktion erster Ordnung. Beide in Abbildung 1.12 gezeigten Experimente wurden in luftges¨attigten L¨osungen durchgef¨uhrt8 Bei der verwendeten Sensibilisatorkonzentration kann also sogar in Gegenwart von Sauerstoff ein klarer Sensibilisierungseffekt beobachtet werden.
Die Auswertung der Kinetik auf dem Chip erm¨oglicht es, die anf¨angliche Belegungs-dichteσQ,0abzusch¨atzen. Dabei wird ein Wert von 8·1012Molek¨ule/cm2erhalten [32], wel-cher mit anderweitig bestimmten Werten aus der Literatur recht gut ¨ubereinstimmt [56].
Bei einem Chip mit einer Belegungsdichte von einer Million Spots/cm2 stehen demnach noch ca. 107 Molek¨ule pro Spot f¨ur eine Detektion zur Verf¨ugung. Dies entspricht einem durchschnittlichen Abstand der einzelnen immobilisierten Oligonukleotidmolek¨ule von ca.
3 nm.