Neue photolabile Schutzgruppen mit intramolekularer Sensibilisierung – Synthese, photokinetische Charakterisierung und Anwendung f¨ur die DNA–Chip–Synthese
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) an der Universit¨at Konstanz
vorgelegt von
Dominik Florian W¨ oll
aus Durach bei Kempten (Allg¨au)
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Universit¨at Konstanz M¨arz 2006
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS)
Dissertation der Universit¨at Konstanz
1. Gutachter: Prof. Dr. U.E. Steiner 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Fischer 3. Gutachter: Prof. Dr. E. Daltrozzo
Tag der m¨undlichen Pr¨ufung: 28. April 2006
Alle Rechte liegen bei Dominik W¨oll
und Prof. Dr. Ulrich E. Steiner
Die Arbeiten zu dieser Dissertation wurden vom Mai 2002 bis zum M¨arz 2006 im Fach- bereich Chemie der Mathematisch–Naturwissenschaftlichen Sektion der Universit¨at Kon- stanz in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ulrich E. Steiner im Rahmen der von der DFG gef¨orderten Forschergruppe ”Oligosaccharid– und DNA–Chips” (FOR 434) durchgef¨uhrt.
Ergebnisse aus dieser Arbeit wurden bereits publiziert in
• D. W¨oll, S. Walbert, K.-P. Stengele, R. Green, T. Albert, W. Pflei- derer, U.E. Steiner, More Efficient Photolithographic Synthesis of DNA-Chips by Photosensitization, Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids 2003, 22, 1395- 1398.
• D. W¨oll, S. Walbert, K.-P. Stengele, T. Albert, T. Richmond, J. Nor- ton, M. Singer, R. Green, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, Triplet-sensitized photodeprotection of oligonucleotides in solution and on microarray chips, Helv.
Chim. Acta 2004, 87(1), 28-45.
• J. Smirnova, D. W¨oll, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, Synthesis of caged nucleosides with photoremovable protecting groups linked to intramolecular anten- nae, Helv. Chim. Acta 2005, 88(4), 891-904.
• D. W¨oll, J. Smirnova, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, Hocheffiziente photo- labile Schutzgruppen mit intramolekularem Energietransfer, Angew. Chem. 2006, 118, 3042-3045;Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2975-2978.
und bei Tagungen vorgestellt
• D. W¨oll, J. Smirnova, D. Kucina, K.-P. Stengele, R. Green, T. Al- bert, N. Lukzen, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, Kinetics of Photosensitized Synthesis of Oligonucleotides in Solution and on DNA-Chips, Poster bei HRSMC Summer School ’New Perspectives in Photochemistry’, 28.6.-2.7.2003, Egmond aan Zee, Holland.
• D. W¨oll, J. Smirnova, U.E. Steiner, Photolabile Protecting Groups utilizing Intramolecular Energy Transfer, Poster bei der Tagung ’Perspectives of photoche- mistry in the new millenium’, 7.3.-11.3.2004, Bad Gastein, ¨Osterreich.
• D. W¨oll, Photolabile Protecting Groups with Integrated Antennas for DNA Chip Synthesis, Kurzvortrag bei ’Minisymposium Photochemie - Optische Spektroskopie - Sensorik’, 29.3.-2.4.2004, Riezlern (Kleinwalsertal), ¨Osterreich.
• D. W¨oll, J. Smirnova, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, Photolabile Protecting Groups utilizing Triplet Energy Transfer, Poster bei ’20. IUPAC Symposium on Photochemistry’, 17.7.-22.7.2004, Granada, Spanien.
• D. W¨oll, J. Smirnova, D. Kucina, K.-P. Stengele, N. Lukzen, W. Pflei- derer, U.E. Steiner, Cleavage of Photolabile Protecting Groups by Diffusion–
Controlled Triplet Energy Transfer, Poster (pr¨asentiert von Prof. Dr. N. Luk- zen) bei ´4th Workshop on Diffusion Assisted Reactions’, 21.8.-26.8.2004, Leibnitz, Osterreich.¨
• D. W¨oll, J. Smirnova, W. Pfleiderer, U.E. Steiner, New Photolabile Pro- tecting Groups utilizing Intramolecular Energy Transfer, Poster bei ’85th Annu- al meeting of the Chemical Society of Japan’, 26.3.-29.3.2005, Yokohama, Japan und (pr¨asentiert von K. Gebauer) bei der ’GDCh-Fachgruppentagung Photoche- mie 2005’, 29.3.-31.3.2005, Jena.
Das Verfahren zur sensibilisierten Abspaltung photolabiler Schutzgruppen ist in Deutsch- land (DE 2002-10209203) und international (WO 2003-EP2208, US 2005-0255401-A1) als Patent angemeldet, in der Schweiz (CH 693202) wurde bereits ein Patent erteilt.
Die Verbesserung der Lichtempfindlichkeit durch neue intramolekular sensibilisierte Schutz- gruppen ist in Deutschland (DE 2003-10315772) und international (WO 2004-EP2361) als Patent angemeldet.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Ulrich E. Steiner f¨ur die außerordentlich inter- essante und herausfordernde Themenstellung, f¨ur die Freiheit, die er mir bei der Bearbei- tung dieser Arbeit und bei der Organisation der Labors gew¨ahrte, und f¨ur die zahlreichen M¨oglichkeiten, meine Ergebnisse international pr¨asentieren und mich pers¨onlich in Se- minaren und einer Sommerschule weiterbilden zu d¨urfen. Seine freundliche Betreuung, seine immerw¨ahrende Unterst¨utzung bei Problemen und seine klaren und anschaulichen Erkl¨arungen haben nicht nur das Projekt, sondern auch mein Verst¨andnis der Physikali- schen Chemie stark vorangetreiben. Neue Ideen wurde stets unterst¨utzt, und die f¨ur ihre Ausf¨uhrung n¨otige Unterst¨utzung gew¨ahrleistet.
Herrn Prof. Dr. H. Fischer danke ich f¨ur die ¨Ubernahme des Zweitgutachtens und die Diskussionen und Gespr¨ache w¨ahrend meines Studiums und meiner Promotion.
Dr. K.-P. Stengele, Dr. Jochen B¨uhler, Dr. Sigrid B¨uhler, und Dr. Jenia von der Nimble- Gen Systems GmbH gilt mein Dank f¨ur die Kooperation bei diesem Projekt und die Unterst¨utzung bei der Durchf¨uhrung der Chipexperimente.
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) danke ich f¨ur die finanzielle Unterst¨utzung dieses Projekts.
Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Dr. Ewald Daltrozzo f¨ur die ¨außerst lehrreichen Dis- kussionen zur spektroskopischen Strukturaufkl¨arung und f¨ur die Reinigung eines Thio- xanthonderivats durch Sublimation. Ebenso gilt mein Dank Prof. Dr. Nikita Lukzen, Dr.
Georg Kollmannsberger–von Nell, Friedrich Menges und Prof. Dr. Fritz Metz f¨ur die Dis- kussionen theoretischer Fragen.
F¨ur die Diskussionen organischer Synthesewege und Reaktionsmechanismen danke ich vor allem Herrn Prof. Dr. Wolfgang Pfleiderer. Sehr hilfreiche Ratschl¨age erhielt ich auch von Tamara Prykota, Geeta R. Charubala, Jan Uwe M¨uller, Dr. Thomas Huhn, Dr. Marc Jung, Prof. Dr. Ulrich Groth, Christian Kesenheimer, Annekatrin Heimann, Michael Bur- gert und Kathrin Fischer.
Weiterhin sei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Steiner ein Riesendank ausgesprochen.
Zu den Ergebnissen dieser Arbeit trugen insbesondere Dr. Julia Smirnova und Marina Gateskaya bei, die mich bei den Ausf¨uhrungen der Synthesen von neuen Schutzgrup- pen unterst¨utzten, und Michael Hog, der eine gr¨oßere Zahl von Bestrahlungsversuchen durchf¨uhrte. F¨ur die Einf¨uhrung in die Messmethoden m¨ochte ich mich vor allem bei Stefan Walbert bedanken. Außerdem genoss ich sehr das kollegiale und freundschaftli- che Umfeld in unserer Arbeitsgruppe, zu dem außer den bereits genannten Personen Dr.
Andreas Klingert, Dr. Karsten H¨otzer, Nikolas Welte, Dennis Kucina, Katja Gebauer und Dr. Mingli Peng beitrugen. Außerdem waren die l¨angeren Aufenthalte von Prof. Dr.
Nikita Lukzen, Prof. Dr. Mike Elliott und Matthew Rawls in unserer Gruppe eine gute Gelegenheit, Erfahrungen und Gedanken auszutauschen.
Ferner gilt mein Dank den Studierenden, die an der Durchf¨uhrung einiger Experimen- te und Synthesen beteiligt waren. Dies sind Anna Steck, Martin Winterhalder, Matthias Riedrich und Sze–man Yu, die in unserer Arbeitsgruppe als studentische Hilfskr¨afte arbei- teten. Daneben synthetisierten Daniel Specker, Corinna Naundorf, Andrea Gerster, Frank Streckenbach, Andrea Niederwieser, Ricarda Miller und Sabrina K¨oder im Rahmen des
Praktikum zum Kurs ”Chemie der Heterozyklen und Stereochemie” bzw. im organischen Anf¨angerpraktikum wichtige Edukte f¨ur meine Schutzgruppen–Synthesen.
Prof. Dr. Heiko M¨oller, Peter Scheckenburger, Anke Friemel und Ulrich Haunz danke ich f¨ur die Diskussion und Durchf¨uhrung von NMR–Experimenten.
Moritz Biskup sei f¨ur die Unterst¨utzung bei der pr¨aparativen HPLC zur Trennung von zwei Bestrahlungsgemischen gedankt, ohne welche die Aufkl¨arung zweier neuer Produkte wohl kaum m¨oglich gewesen w¨are.
F¨ur die Aufnahme von Massenspektren gilt mein Dank Benjamin Bornemann, Dimitri Galetskii und Nicolay Youhnovski.
Dr. Marcus Ringwald (MCAT) danke ich f¨ur die immer schnelle und unkomplizierte Ver- sorgung mit Palladium–Katalysatoren, ebenso wie der Arbeitsgruppe Groth f¨ur die Ver- sorgung mit getrockneten L¨osungmitteln.
Henning Kopf, Andreas Ehlers, Benjamin Bornemann, Samuel Weisbrod und Nikolas Welte m¨ochte ich meinen Dank daf¨ur aussprechen, dass ich mich bei Computerproblemen immer an sie wenden konnte, und sie mir w¨ahrend meiner Zeit als Netzwerkadiministrator sehr viel Know How vermittelten. Andreas Ehlers danke ich außerdem f¨ur quantenchemi- sche Rechnungen zu Nitrosobenzolen.
Diese Arbeit h¨atte in einem Fachbereich, in dem nicht die meisten Arbeitsgruppen kol- legial und hilfsbereit zusammenarbeiten, sicherlich nicht so durchgef¨uhrt werden k¨onnen.
Deshalb sei hiermit nochmals dem gesamten Fachbereich herzlichst gedankt.
Ein ganz großer Dank gilt auch den Freunden, die w¨ahrend meiner Promotion f¨ur mein Wohlbefinden und den ausgeleichenden Spass sorgten. Dies sind vor allem meine Freunde von der Fachschaft Chemie, vom ”Chemikerkicken”, vom AStA–Kino und vom Floorball.
Besonders bedanken m¨ochte ich mich in diesem Zusammenhang bei meiner Tanzpart- nerin Gitte (Brigitte Korthals), Benni (Benjamin Bornemann), Andrea Gerster, Jochen Lipps und meinem Snooker–Kumpel ¨Orner (Bernhard Reichmann). Bei Georg Fischer und D¨omi (Dominik Gauss) bedanke ich mich außerdem f¨ur die gem¨utlichen TeX-er–Abende w¨ahrend des Zusammenschreibens.
Meinen Freunden von Kempten und Durach gilt mein Dank f¨ur die Abwechslung in den Zeiten, die ich w¨ahrend meiner Arbeit im Allg¨au verbrachte.
Meinen Chemielehrern Lothar Ortmann und Lothar Wagner und meinem Mathemati- klehrer Wolfgang Mayr danke ich daf¨ur, dass sie w¨ahrend meiner Schulzeit in mir ein dauerhaftes Interesse an Mathematik und Naturwissenschaften weckten.
Besonders danke ich schließlich meinen Eltern Mathilde und Michael W¨oll daf¨ur, dass sie, ebenso wie mein Bruder Alexander, meine k¨urzlich verstorbene Oma Genoveva und mein Onkel Josef W¨oll zusammen mit seiner Frau Thilde, mich stets unterst¨utzten und f¨ur mich da waren.
Inhaltsverzeichnis
Abk¨urzungsverzeichnis XI
1 Einleitung 1
1.1 DNA und Genom . . . 1
1.2 Aufbau und Funktionsweise von DNA–Chips . . . 2
1.3 Anwendungen von DNA–Chips . . . 4
1.3.1 Sequencing by Hybridization (SBH) . . . 4
1.3.2 Genotyping Analysis . . . 5
1.3.3 Gene Expression Profiling . . . 6
1.4 Herstellung von DNA–Chips . . . 7
1.5 Photolabile Schutzgruppen . . . 9
1.5.1 Einsatzfelder photolabiler Schutzgruppen . . . 9
1.5.2 Photolabile Schutzgruppen f¨ur die DNA–Chip–Synthese . . . 11
1.5.3 Quantifizierung der Lichtempfindlichkeit photolabiler Schutzgruppen 12 1.5.4 Der Entsch¨utzungsmechanismus der NPPOC–Schutzgruppe . . . 13
1.6 Intermolekulare Sensibilisierung der NPPOC–Schutzgruppe . . . 15
1.6.1 Sensibilisierung in homogener L¨osung . . . 15
1.6.2 Sensibilisierung auf dem Chip . . . 18
1.7 Aufbau und Ziele dieser Doktorarbeit . . . 20
2 Elektronische Energie¨ubertragung 22 2.1 Bedeutung elektronischer Energie¨ubertragungsprozesse . . . 22
2.2 Mechanismen der elektronischen Energie¨ubertragung . . . 22
2.3 Intermolekulare Triplett–Triplett–Energie¨ubertragung . . . 28
2.3.1 Begegnungskomplex–Modell f¨ur eine irreversible Energie¨ubertragung nachCollins–Kimball . . . 29
2.3.2 Modell f¨ur einen reversiblen Energietransfer nach Sandros. . . 31
2.3.3 Modell f¨ur einen reversiblen Energietransfer nach Balzani . . . 33
2.3.4 Absch¨atzung der diffusionskontrollierten Ratenkonstante . . . 35
2.4 Intramolekulare Triplett–Triplett–Energie¨ubertragung . . . 35
2.5 Intermolekulare Singulett–Singulett–Energie¨ubertragung . . . 41
2.6 Intramolekulare Singulett–Singulett–Energie¨ubertragung . . . 43
2.7 Singulett–Triplett–Energie¨ubertragung . . . 45
3 Synthese neuer Schutzgruppen und Modellverbindungen 47 3.1 Synthesestrategien . . . 47
3.2 Synthese der Thioxanthonderivate . . . 48
3.3 Ankn¨upfungen an der benzylischen Position von NPPOC . . . 52 3.4 Direkte Verkn¨upfung von Sensibilisator und NPPOC ¨uber eine Biarylbindung 57
3.5 Verkn¨upfung von Sensibilisator und NPPOC ¨uber eine Esterbindung am
Aromaten . . . 59
3.6 Synthese der neuen Schutzgruppe 2-(9H-Thioxanthen-9-on-2-yl)ethyl . . . 60
3.7 Synthese gesch¨utzter Thymidine . . . 61
3.8 Synthese von Modellverbindungen f¨ur vergleichende Untersuchungen . . . . 62
4 Spektroskopische Untersuchungen 64 4.1 Absorptionsspektren . . . 64
4.2 Fluoreszenzspektren . . . 65
4.3 Methodisches zur Laserblitzspektroskopie . . . 66
4.4 Laserblitzspektroskopische Untersuchungen an Thioxanthon als Vergleichs- substanz . . . 68
4.5 Laserblitzspektroskopische Untersuchung der neuen Schutzgruppenverbin- dungen mit einem Oligomethylenlinker . . . 71
4.5.1 Transientenspektren und Abklingkinetik . . . 71
4.5.2 Triplett–Triplett–Energietransfer . . . 78
4.5.3 Intramolekulare Singulett–L¨oschung des angeregten Sensibilisators . 82 Anfangsamplituden der Triplettsignale . . . 82
Intramolekulare Singulett–L¨oschung . . . 83
Abh¨angigkeit der Ratenkonstante der intramolekularen Singulett– L¨oschung von der Linker–L¨ange . . . 84
M¨ogliche Mechanismen der intramolekularen Singulett–L¨oschung des Sensibilisators . . . 85
Intramolekulare Singulett–Singulett–Energie¨ubertragung vom Thioxanthon–Singulett auf den Nitrophenyl–Singulett . . . 88
Intramolekulare Singulett–Triplett–Energie¨ubertragung vom Thioxanthon–Singulett auf den Nitrophenyl–Triplett . . . 88
Photochemisch induzierter Elektronentransfer . . . 89
Vergleich der Geschwindigkeiten der Singulett– und Triplett–L¨oschung 91 4.6 Die Schutzgruppenverbindungen T7P4 und T7R4 mit Doppel– bzw. Drei- fachbindung im Linker . . . 93
4.7 Laserblitzspektroskopie der Schutzgruppenverbindungen T5D0 mit direk- ter Verkn¨upfung zwischen den beiden Chromophoren . . . 95
4.8 Die Schutzgruppenverbindungen T4E2 mit einer Esterverkn¨upfung der bei- den Chromophore . . . 100
4.9 Vergleichende Diskussion der Transientenkinetiken . . . 104
4.9.1 Triplettlebensdauern . . . 104
4.9.2 L¨oschung der Tripletts durch Sauerstoff . . . 107
4.9.3 Entstehung und Abklingen der Acinitro–Form . . . 108
4.10 Laserblitzspektroskopische Untersuchung der Schutzgruppenverbindung TE1-T . . . 111
4.11 L¨oschexperimente mit Nukleosiden . . . 114
5 Kontinuierliche Bestrahlungen 118 5.1 Aktinometrie mit Azobenzol . . . 118
5.2 Durchf¨uhrung der Bestrahlungen und Analyse der Produkte . . . 119
5.3 Chromatographische Trennung der Reaktionsgemische nach der Bestrahlung120 5.4 Bestrahlung der Oligomethylen–verbr¨uckten Schutzgruppen T7Cn . . . 120
5.5 Bestrahlung der Schutzgruppe T7P4 mit Doppelbindung in Konjugation
zum Thioxanthon–Chromophor . . . 124
5.6 Bestrahlung der Schutzgruppe T7R4 mit Dreifachbindung in Konjugation zum Thioxanthon–Chromophor . . . 128
5.7 Bestrahlung der Schutzgruppe T5D0 mit einer direkten Verkn¨upfung zwi- schen Nitrophenyl– und Thioxanthon–Chromophor . . . 129
5.7.1 T5D0–gesch¨utztes Thymidin (T5D0−T) . . . 130
5.7.2 T5D0–gesch¨utztes Desoxyguanosin–Amidin (T5D0−dGAm) . . . . 130
5.7.3 T5D0–gesch¨utztes Benzyl–Desoxyadenosin (T5D0−dABn) . . . 131
5.7.4 T5D0–gesch¨utztes Acetyl–Desoxycytidin (T5D0−dCAc) . . . 131
5.7.5 Diskussion der Photoprodukte der T5D0–gesch¨utzten Nukleoside . . 133
5.8 Bestrahlung der Schutzgruppe T4E2 mit einer Ester–Verkn¨upfung der bei- den Chromophore . . . 133
5.9 Bestrahlung von TE1-T (103) . . . 134
5.10 Diskussion der wichtigsten photochemischen Reaktionsprodukte . . . 134
5.10.1 Charakterisierung der freien Nukleoside (118) . . . 134
5.10.2 Charakterisierung des Styrol–Produkts (119) . . . 135
5.10.3 Charakterisierung des Nitroso–Alkohols (122) . . . 136
5.10.4 Charakterisierung eines aus dem Nitroso–Alkohol entstehenden Pro- dukts (123) . . . 138
5.10.5 Weitere Photoprodukte . . . 143
5.11 Photokinetische Charakterisierung der Sensibilisatorwirkung . . . 144
5.12 Lichtempfindlichkeit der gesch¨utzten Thymidine . . . 146
5.13 Vergleich der Kinetiken der vier mit T5D0–gesch¨utzten Nukleoside . . . 151
6 Chipexperimente 153 6.1 Durchf¨uhrung . . . 153
6.2 Ergebnisse der Chipexperimente . . . 159
6.2.1 Aufbau von Oligo–T–Ketten mit der T7C4–Schutzgruppe . . . 159
6.2.2 Aufbau von Oligo–T–Ketten mit der T5D0–Schutzgruppe . . . 161
6.2.3 Zusammenfassung der Chipexperimente . . . 162
7 Zusammenfassung 163 8 Experimenteller Teil 170 8.1 Verwendete Apparaturen und Methoden . . . 170
8.1.1 NMR–Spektrometer . . . 170
8.1.2 Massen–Spektrometer . . . 170
8.1.3 UV–VIS– und Fluoreszenz–Spektrometer . . . 170
8.1.4 Schmelzpunkte . . . 170
8.1.5 Elementaranalyse . . . 170
8.1.6 Laserblitzspektrometer . . . 170
8.1.7 Bestrahlungsapparatur . . . 171
8.1.8 HPLC . . . 172
8.2 Herkunft der nicht selbst synthetisierten Verbindungen . . . 173
8.3 Eigene Synthesen . . . 173
8.3.1 Einstufige Synthese von substituierten Thioxanthonen . . . 173
2-Brom-9H-thioxanthen-9-on (23) . . . 173
2-Hydroxy-9H-thioxanthen-9-on (24) . . . 174
2-Methoxy-9H-thioxanthen-9-on (25) . . . 174
4-Fluor-1-methyl-9H-thioxanthen-9-on (26) und 1-Fluor-4-methyl-
9H-thioxanthen-9-on (27) . . . 175
8.3.2 Zweistufige Synthese von substituierten Thioxanthonen . . . 176
2-(4-Tolylthio)benzoes¨aure (128) . . . 176
2-Methyl-9H-thioxanthen-9-on (31) . . . 176
2-(Brommethyl)-9H-thioxanthen-9-on (54) . . . 177
2-(3,5-Dimethylphenylthio)benzoes¨aure (129) . . . 177
1,3-Dimethyl-9H-thioxanthen-9-on (32) . . . 177
2-(2-Carboxyphenylsulfanyl)benzoes¨aure (130) . . . 178
9H-Thioxanthen-9-on-4-carbons¨aure (34) . . . 178
2-(4-Bromphenyl)-1,3-dioxolan (36) . . . 179
2-(4-(1,3-Dioxolan-2-yl)phenylthio)benzoes¨aure (37) . . . 179
9-Oxo-9H-thioxanthen-2-carbaldehyd (38) . . . 180
8.3.3 Vorstufen . . . 180
2-Nitrophenylessigs¨auremethylester (39) . . . 180
4-Iodbut-1-en (43) . . . 181
5-Iodpent-1-en (44) . . . 181
8-Iodoct-1-en (45) . . . 181
8.3.4 Substitutionen an der benzylischen Position von 2-Nitrophenylessig- s¨auremethylester (39) mit KOtBu (Methode a) . . . 181
2-(2-Nitrophenyl)pentans¨auremethylester (46) . . . 181
2-(2-Nitrophenyl)-5-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)pentans¨auremethyl- ester (47) . . . 182
2-(2-Nitrophenyl)-3-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)propans¨auremethyl- ester (57) . . . 183
2-(2-Nitrophenyl)pent-4-ins¨auremethylester (55) . . . 183
2-(2-Nitrophenyl)hex-5-ens¨auremethylester (48) . . . 183
2-(2-Nitrophenyl)hept-6-ens¨auremethylester (49) . . . 184
2-(2-Nitrophenyl)dec-9-ens¨auremethylester (50) . . . 184
8.3.5 Substitutionen an der benzylischen Position von 2-Nitrophenylessig- s¨auremethylester (39) mit K2CO3 (Methode b) . . . 185
2-(2-Nitrophenyl)pent-4-ens¨auremethylester (56) . . . 185
8.3.6 Synthese der T7Cn–Schutzgruppenverbindungen mitn ≥3 . . . 185
2-(2-Nitrophenyl)pent-4-en-1-ol (64) . . . 185
2-(2-Nitrophenyl)hex-5-en-1-ol (65) . . . 186
2-(2-Nitrophenyl)hept-6-en-1-ol (66) . . . 186
2-(2-Nitrophenyl)dec-9-en-1-ol (67) . . . 186
1-(1-tert-Butyldimethylsilyloxy-pent-4-en-2-yl)-2-nitrobenzol (68) . 186 1-(1-tert-Butyldimethylsilyloxy-hex-5-en-2-yl)-2-nitrobenzol (69) . . 187
1-(1-tert-Butyldimethylsilyloxy-hept-6-en-2-yl)-2-nitrobenzol (70) . 187 1-(1-tert-Butyldimethylsilyloxy-dec-9-en-2-yl)-2-nitrobenzol (71) . . 188
2-[5-[(tert-Butyldimethylsilyl)oxy]-4-(2-nitrophenyl)pentyl]- 9H-thioxanthen-9-on (72) . . . 188
2-[6-[(tert-Butyldimethylsilyl)oxy]-5-(2-nitrophenyl)hexyl]- 9H-thioxanthen-9-on (73) . . . 189
2-[7-[(tert-Butyldimethylsilyl)oxy]-6-(2-nitrophenyl)heptyl]- 9H-thioxanthen-9-on (74) . . . 189
2-[10-[(tert-Butyldimethylsilyl)oxy]-9-(2-nitrophenyl)decyl]- 9H-thioxanthen-9-on (75) . . . 189
2-[5-Hydroxy-4-(2-nitrophenyl)pentyl]-9H-thioxanthen-9-on (5) . . 189
2-[6-Hydroxy-5-(2-nitrophenyl)hexyl]-9H-thioxanthen-9-on (7) . . . 190
2-[7-Hydroxy-6-(2-nitrophenyl)heptyl]-9H-thioxanthen-9-on (8) . . 190
2-[10-Hydroxy-9-(2-nitrophenyl)decyl]-9H-thioxanthen-9-on (9) . . 191
8.3.7 Synthese der T7C2–Schutzgruppenverbindung . . . 191
2-(2-Nitrophenyl)-3-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)propans¨aure (60) . 191 2-[2-(2-Nitrophenyl)ethyl]-9H-thioxanthen-9-on (63) . . . 191
2-[3-Hydroxy-2-(2-nitrophenyl)propyl]-9H-thioxanthen-9-on (1) . . 192
Reduktion von 57 zu 2-(2-Nitrophenyl)-3-(9H-thioxanthen-2-yl)- propans¨auremethylester (59) . . . 193
8.3.8 Synthese von T7R4–Schutzgruppenverbindungen . . . 193
2-(2-Nitrophenyl)pent-4-in-1-ol (83) . . . 193
2-(2-Nitrophenyl)-5-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)-4-pentin-1-ol (12) 194 8.3.9 Synthese von T5D0–Schutzgruppenverbindungen . . . 194
2-(5-Brom-2-nitrophenyl)propan-1-ol (85) . . . 194
2-(5,5-Dimethyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)-9H-thioxanthen-9-on (87) aus 2-Bromthioxanthon 23 (Methode a) . . . 195
2-(5,5-Dimethyl-1,3,2-dioxaborinan-2-yl)-9H-thioxanthen-9-on (87) aus 2-Iodthioxanthon 82 (Methode b) . . . 196
2-[3-(1-Hydroxyprop-2-yl)-4-nitrophenyl]-9H-thioxanthen-9-on (14) aus 87 (Methode a) . . . 196
2-[3-(1-Hydroxyprop-2-yl)-4-nitrophenyl]-9H-thioxanthen-9-on (14) aus 23 und 88 ohne Isolation des Zwischenprodukts 89 (Methode b) . . . 197
1-Ethyl-2,4-dinitrobenzol (94) . . . 198
8.3.10 Synthese der TE1–Schutzgruppe . . . 198
4-Fluor-1-(2-hydroxyethyl)-9H-thioxanthen-9-on (102) . . . 198
8.3.11 Synthese der gesch¨utzten Thymidine . . . 199
5’-O-[2-Nitrophenyl-3-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)- propyloxycarbonyl]-thymidin (2) . . . 199
5’-O-[2-Nitrophenyl-5-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)- pentyloxycarbonyl]-thymidin (6) . . . 200
5’-O-[2-Nitrophenyl-5-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)- pent-4-inyloxycarbonyl]-thymidin (13) . . . 200
5’-O-[2-(5-(9-oxo-9H-thioxanthen-2-yl)- 2-nitrophenyl)propoxycarbonyl]-thymidin (15) . . . 201
5’-O-[(4-Fluor-9-oxo-9H-thioxanthen-1-yl)- ethoxycarbonyl]-thymidin (103) . . . 202
8.3.12 Synthese von Modellverbindungen . . . 203
2-(4-Nitrophenyl)-9H-thioxanthen-9-on (105) . . . 203
Benzoes¨aure-9-oxo-9H-thioxanthen-2-ylester (106) . . . 204
8.4 NMR–Spektren . . . 205
9 Anhang: Toskana - einLabview–basiertes Steuer– und Datenerfassungs- programm f¨ur die Laserblitzspektroskopie 229 9.1 Die Entwicklung von Toskana . . . 229
9.2 Das Hauptmenu . . . 229
9.3 Strahlengang optimieren . . . 231
9.4 Messung mit dem Oszilloskop . . . 231
9.5 Messung mit der CCD-Kamera . . . 233 9.6 File–Struktur der gespeicherten Daten . . . 237
10 Literaturverzeichnis 240
Abk¨ urzungsverzeichnis
A Absorbanz
tR Retentionszeit
1Xn n-ter Singulettzustand von X
1Xn n-ter Triplettzustand von X
2D zweidimensional
3D dreidimensional
A Adenosin
A Energieakzeptor
ABz benzyl–gesch¨utztes Adenosin
ADP Adenosindiphosphat
ATP Adenosintriphosphat
BELT R¨uck–Elektronentransfer
br. breit
BSS Singulett–Singulett–R¨uck–Energietransfer
C Cytidin
CAc acetyl–gesch¨utztes Cytidin
CCD Charge Coupled Device
cDNA komplement¨are DNA
D Energiedonor
d Dublett
DMT Dimethoxytrityl
DNA Desoxyribonukleins¨aure
E Einstein = 1 mol Photonen
eA Elektronenakzeptor
eD Elektronendonor
eff effektiv
ELT Elektronentransfer
ET 2-Ethylthioxanthon
G Guanosin
GAm als Amidin gesch¨utztes Guanosin
HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Hochdruck–Fl¨ussigkeits–Chromatographie)
ISC Intersystem Crossing
KD Kettendiffusion
M molar = moll
m Multiplett
MeCN Acetonitril
MeOH Methanol
mRNA messenger–RNA (Boten–Ribonukleins¨aure) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Kernspinresonanz) NPPOC 2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonyl
PM Photomultiplier
ppm parts per million
q Quartett
quint Quintett
RIP Radikalionenpaar
RNA Ribonukleins¨aure
RT Raumtemperatur
s Singulett
SBH Sequencing by Hybridization Sens Sensibilisator
SNP Single Nukleotide Polymorphism SS Singulett–Singulett–Energietransfer ST Singulett–Triplett–Energietransfer
T Thymidin
t Triplett
Thy Thymidin
TT Triplett–Triplett–Energietransfer TTA Triplett–Triplett–Annihilation
Tx Thioxanthon
UV Ultraviolett
Vis Visible
X∗ angeregter Zustand von X
1 Einleitung
Das Interesse an dem hier bearbeiteten Thema entwickelte sich aus Untersuchungen im Umfeld der photolithographischen DNA–Chip–Synthese. F¨ur diesen Prozess ben¨otigt man photolabile Schutzgruppen, an deren Verbesserung in verschiedenen Projekten unserer Ar- beitsgruppe gearbeitet wird. In dieser Einleitung wird daher zun¨achst ein ¨Uberblick zur Thematik von DNA–Chips gegeben, sodann auf photolabile Schutzgruppen im Allgemei- nen und bei der DNA–Chip–Synthese im Besonderen eingegangen und schließlich der Bogen zur Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit geschlagen.
1.1 DNA und Genom
Das Human Genome Project, eines der aufwendigsten Großprojekte der Wissenschaft, wurde 2003 abgeschlossen. Das damit erreichte Ziel war die Bestimmung einer repr¨asenta- tiven Sequenz des menschlichen Erbguts mit h¨ochster Genauigkeit (ca. 1 Fehler pro 10000 Basen). Wof¨ur wurde dieser enorme Aufwand betrieben? Das Genom eines Lebewesens umfasst den kompletten Satz seiner Gene und damit seinen Bauplan. Die einzelnen Gene sind aus DNA–Str¨angen mit einzelnen Nukleotiden einer bestimmten Basen–Sequenz auf- gebaut. Die Kenntnis dieser DNA–Sequenz ist der Schl¨ussel zu einem tieferen Verst¨andnis der komplexen Vorg¨ange des Lebens. Sie spielt eine zentrale Rolle bei der Aufkl¨arung zellbiologischer und biochemischer Prozesse, von Krankheiten und in der Erforschung der Evolution der Arten.
Das zentrale Dogma der Molekularbiologie ist in Abbildung 1.1 verdeutlicht. Jede
Protein DNA
RNA
Transkription
Tra nsla tio n
Abbildung 1.1: Zentrales Dogma der Molekularbiologie
Zelle eines Organismus enth¨alt, abgesehen von gegebenenfalls auftretenden Mutationen, identische DNA. St¨andig werden die Informationen bestimmter DNA–Abschnitte kopiert (Transkription) und in Form von mRNA aus dem Zellkern geschleust. Anschließend dient diese mRNA w¨ahrend der Translation an den Ribosomen als Matrize f¨ur den Aufbau der von ihr codierten Proteine, die schließlich noch posttranslational modifiziert werden k¨onnen. All diese Prozesse werden ¨uber komplexe Regelvorg¨ange von Umgebungseinfl¨us- sen gesteuert, die bestimmen, welche Gene wann
”eingeschalten“ sind, d.h. welche DNA–
Abschnitte zu bestimmten Zeitpunkten in mRNA umgeschrieben werden. Das bedeutet, dass nicht nur das Genom an sich f¨ur die Entwicklung bestimmend ist, sondern auch die Einflussfaktoren, die bestimmen, welches Gen zu welcher Zeit
”aktiv“ ist. Erst mit Hilfe eines Gesamtverst¨andnisses dieser Regulationsprozesse wird es m¨oglich sein, zu begreifen, wie sich die Variationen im Erbgut eines Lebewesens auf dessen individuelle Eigenschaften auswirken, oder welche Faktoren f¨ur bestimmte Erbkrankheiten wesentlich sind. All dies wird hoffentlich einmal zur Heilung von Krankheiten und zu einer neuen Art von Medizin, welche die Besonderheiten eines jeden Individuums st¨arker ber¨ucksichtigt, beitragen.
F¨ur diese Ziele ben¨otigt man Methoden, die schnell Auskunft ¨uber die in bestimmten Zeitphasen in einer Gewebeprobe vorhandene mRNA geben k¨onnen. Im Gegensatz zu den zeitaufwendigen herk¨ommlichen Methoden der Sequenzierung sind DNA–Chips aufgrund ihrer parallelisierten Detektion ¨außerst schnell. Sie k¨onnen auch vergleichende Informatio- nen ¨uber zwei verschieden markierte DNA– bzw. mRNA–Proben auf ein und dem selben Chip liefern (vgl. Abschnitt 1.3.3).
1.2 Aufbau und Funktionsweise von DNA–Chips
Die Bezeichnung DNA–Chip wird sehr weitreichend angewandt. Unter diesen Begriff f¨allt im Grunde alles, was aus immobilisierten Oligonukleotid– oder DNA–Str¨angen auf ei- ner Oberfl¨ache besteht1. Diese Str¨ange sind gruppenweise als sogenannte Spots an fest definierten Positionen zu finden. In jedemSpot sind Oligonukleotid–Einzelstr¨ange, so ge- nannte Probes, gleicher Basensequenz auf dem Tr¨agermaterial fixiert. Die Basensequenz variiert jedoch von Spot zu Spot. Eine sehr gute ¨Ubersicht ¨uber DNA–Chips und deren Anwendungen gibt ein Sonderheft der Zeitschrift Nature Genetics [1].
Man unterscheidet so genannte Low–Density– und High–Density–DNA–Chips. Low–
Density–Chips besitzen meist nur wenige Spots pro Chip. Auf diese soll hier nicht weiter eingegangen werden. Im Gegensatz dazu k¨onnen auf einemHigh–Density–DNA–Chip2 bis zu einer Million Spots aufgebracht sein, d.h. ein Spot nimmt hier eine Fl¨ache von 10 x 10 µm2 ein. Solch ein Chip reicht beispielsweise aus, um das gesamte menschliche Ge- nom zu repr¨asentieren3. Bei derart hohen Spotdichten besteht jeder Spot noch immer aus mindestens einer Million Oligonukleotid–Einzelstrang–Molek¨ulen gleicher Basensequenz.
Die L¨ange der Oligonukleotid–Einzelstr¨ange kann bis zu 100 Basen betragen, liegt je- doch normalerweise bei 20 bis 30 Basen. Gibt man eine Analysenl¨osung mit DNA– bzw.
RNA–Einzelstr¨angen, den so genannten Targets, auf den Chip, so werden diese aufgrund der bevorzugten Watson–Crick–Basenpaarung (siehe Abbildung 1.2) selektiv an ihre komplement¨arenProbe–Str¨ange auf der Chipoberfl¨ache gebunden (Abbildung 1.3 rechts).
Die Bindung ist umso st¨arker, je l¨anger die komplement¨are Sequenz ist und je mehr Guanin–Cytosin–Basenpaarungen sie enth¨alt. Letztere sind n¨amlich aufgrund ihrer drei Wasserstoffbr¨ucken stabiler als Adenin–Thymin–Basenpaarungen, die nur zwei Wasser- stoffbr¨ucken ausbilden k¨onnen. Mit geeigneten Detektionsmethoden kann man die Spots auf dem Chip bestimmen, an die Target–Molek¨ule gebunden haben. Da man f¨ur jeden Spot auf dem Chip aus seiner Position die Sequenz der Oligonukleotide kennt, kann man
1Obwohl im ersteren Fall besser die Rede von einem Oligonukleotid–Chip sein sollte, wird in meiner Arbeit durchgehend der Begriff DNA–Chip verwendet. In der Literatur werden die Begriffe DNA–
bzw. Oligonukleotid–Array oft gleichbedeutend verwendet.
2High–Density–DNA–Chips besitzen ¨ublicherweise Abmessungen von 1 x 1 cm2
3Pressemitteilung (Madison, 28. Juli 2003), NimbleGen Releases First Human Whole–Genome Array:
”NimbleGen’s human array is composed of almost 200000 long oligo probes (60mers), with an average coverage of 5 probes per gene.“
N N N
N N N
N N N
O
N
N N
N
O
N N
O
O R'
R
R'
Adenin R
Thymin Cytosin
Guanin
H H H
H
H H H
H
Abbildung 1.2: Die Watson–Crick–Basenpaarung: Guanin bildet drei Wasserstoffbr¨uckenbin- dungen mit Cytosin und Adenin zwei Wasserstoffbr¨uckenbindungen mit Thymin aus.
auf die komplement¨are Sequenz derTargets schließen.
Zur Detektion werden die DNA– bzw. RNA–St¨ucke der Probenl¨osung normalerweise mit einem Fluoreszenzlabel markiert. Bestrahlt man nach der Hybridisierung die Ober- fl¨ache des Chips mit Licht geeigneter Wellenl¨ange, so kann die Fluoreszenz ortsaufgel¨ost registriert werden, und man erh¨alt beispielsweise ein Bild wie es links in Abbildung 1.3 gezeigt ist. Der DNA–Chip besteht hier aus 25 x 25 = 625Spots, und wurde einer L¨osung
A X
A
X AX
AX AX
AY AY AY
A Y
A Y
Abbildung 1.3: Der Aufbau eines DNA–Chips zum Vergleich zweier unterschiedlich markierter DNA–Proben.
mit einem Gemisch aus zwei verschieden fluoreszenzmarkierten DNA–Proben (rot und gr¨un) aus zwei unterschiedlichen Quellen ausgesetzt, die miteinander verglichen werden sollen. DieTarget–Einzelstr¨ange binden, wie rechts gezeigt wird, an ihre komplement¨aren Stellen, wenn die entsprechende Probe–Basensequenz in dem DNA–Strang enthalten ist4. Wie sp¨ater in Abschnitt 1.3.3 erkl¨art wird, kann man aus der Farbe der Spots R¨uck- schl¨usse ¨uber gemeinsame und unterschiedliche DNA–Sequenzen der zu vergleichenden Proben ziehen.
4In der Abbildung ist vereinfachend nur die entsprechend komplement¨are Sequenz derTargets gezeigt.
Die Str¨ange k¨onnen aber auch viel l¨anger sein.
Neben der Fluoreszenz sind aber durchaus auch andere Arten der Bindungsdetektion vorstellbar. Zwei sondenfreie Methoden, mit denen sich unsere Gruppe zur Zeit inten- siv besch¨aftigt, sind reflektrometrische Interferenz–Spektroskopie (RIFS) [2] und Ober- fl¨achenplasmonenresonanz (SPR) [3, 4].
Der große Vorteil von DNA–Chips gegen¨uber herk¨ommlichen Methoden, bei denen selektiv Bruchst¨ucke jeweils eines Poly– bzw. Oligonukleotids erzeugt, und diese nach ihrer Gr¨oße getrennt werden, besteht darin, dass relativ komplexe Proben durch die parallele Detektion schnell analysiert werden k¨onnen.
Verbesserungen der DNA–Chips w¨aren m¨oglich durch eine noch selektivere und schnel- lere Synthese der Probe–DNA–Str¨ange mit h¨oheren Ausbeuten der Einzelschritte (vgl.
Abschnitt 1.4) und eine gr¨oßere Sensitivit¨at und Selektivit¨at der Hybridisierung auf der Chipoberfl¨ache. Die Sensitivit¨at wird durch den Anteil anFalse Negatives, d.h.Probes, die keine passendenTargets aus der L¨osung binden, obwohl sie in der L¨osung vorhanden sind, charakterisiert. Wenige False Negatives entsprechen dabei einer hohen Sensitivit¨at. F¨ur die Selektivit¨at hingegen ist der Anteil an False Positives ein Maß. Dies sind Targets, die an eine Stelle auf dem Chip binden, obwohl es sich nicht genau um die korrespondierende Sequenz handelt. Dieser Vorgang wird im Gegensatz zu einem Perfect Match–Paar auch als Mismatch–Paarung bezeichnet, und kann je nach Basenpaarung und Position signifi- kantes Gewicht erlangen. Je geringer die Zahl derMismatches, desto h¨oher die Selektivit¨at.
Eine Erh¨ohung der Selektivit¨at ist jedoch stets mit einer Verringerung der Sensitivit¨at ver- bunden und umgekehrt. Verbesserungen k¨onnten z.B. durch die Einf¨uhrung modifizierter Basen erreicht werden, die noch selektiver an ihre komplement¨aren Basen binden [5]. In der Arbeitsgruppe vonC. Richert wird z.B. an der Verwendung von molekularen Kap- pen am Ende der fixierten Sequenzen gearbeitet, die das Ausfransen verhindern sollen und somit gerade an den kritischen Enden zu einer h¨oheren Basenpaarungsselektivit¨at f¨uhren [6]. Ebenso w¨unschenswert w¨are eine Detektionsmethode, die ohne eine Markie- rung von Oligonukleotiden ausk¨ame.
1.3 Anwendungen von DNA–Chips
1.3.1 Sequencing by Hybridization (SBH)
Die routinem¨aßig verwendeten Verfahren sind heute die Methoden nachMaxam–Gilbert und Sanger [7, 8]. Diese Verfahren sind optimal ausgereift, beinhalten aber gel– bzw.
kapillarelektrophoretische Trennungen, welche eine Grenze f¨ur eine weitere Beschleuni- gung dieser Methoden darstellen. Deshalb wurde das Sequencing by Hybridization auf DNA–Chips vorgeschlagen [9, 10]. Das Funktionsprinzip dieser Methode ist in Abbildung 1.4 dargestellt. Eine L¨osung mit dem Oligo– bzw. Polynukleotid (Target), dessen Se- quenz man analysieren m¨ochte, wird auf den Chip gegeben und bindet nun an die Pro- be–Oligonukleotide, deren komplement¨are Sequenzen in dem Target enthalten sind. Aus den Orten der Bindung kann man die enthaltenen Teil–Sequenzen ermitteln, und durch geeignete Aneinanderreihung der Teil–Sequenzen auf die Gesamt–Sequenz des Targets schließen (vgl. Abbildung 1.5). Auf dem Chip m¨ussen somit alle 4n m¨oglichen Kombina- tionen an Basensequenzen vorhanden sein. Bei Nonameren (n= 9) w¨aren dies 262144, bei Decameren (n = 10) bereits 1048576 Spots. Diese Methode erscheint recht leistungsstark und wurde bereits mit einem Array aus 256 verschiedenen Oktanukleotiden erfolgreich getestet [11]. Dennoch ist das Sequencing by Hybridization aber noch nicht soweit ausge- reift, dass es die klassischen Methoden der Sequenzierung ersetzen kann. Dies hat meh- rere Gr¨unde. Zun¨achst kann diese Methode keine Sequenzwiederholungen erkennen [9]
T
A
G T A T A
A A
G A T A G
C T C A T G
G T T A
A
T A
A
G A T A G
C A T A T G
C T G
G T A
T
C A
A
G A T A G
C A T A T G T T
T C C A
T G
Abbildung 1.4:Schematische Darstellung desSequencing by Hybridization. Von den Bindungs- orten kann auf die Sequenz der Probe geschlossen werden. Von den Millionen von Probes auf einem Spot ist jeweils nur eine dargestellt.
T A
C ATG TC A ATG TC TATG TA
T A
C ATG
Abbildung 1.5: Ermittlung der Basensequenz aus den Teilsequenzen beim Sequencing by Hy- bridization.
wie sie insbesondere bei h¨oheren Organismen h¨aufig vorkommen. Außerdem sind die Se- lektivit¨at und Sensitivit¨at noch nicht so optimiert, dass man ohne jegliche Zweifel in allen F¨allen ein Bindungs– von einem Nichtbindungs–Ereignis unterscheiden kann. Die Verbesserung dieser Schwachstellen und die Verwendung von bioinformatischen und kom- binatorischen Methoden zur weiteren Absicherung der Ergebnisse k¨onnen aber hoffentlich bald zur Durchsetzung dieser Methode beitragen.
1.3.2 Genotyping Analysis
Nach der k¨urzlich erfolgten Aufkl¨arung einer repr¨asentativen Sequenz des menschlichen Erbguts, ist es interessant zu wissen, inwieweit sich Individuen von dieser Sequenz unter- scheiden. Meistens handelt es sich bei diesen Ver¨anderungen um Mutationen von nur einer Base in der Sequenz des interessierenden Gens, so genannten Single Nucleotide Polymor- phisms (SNPs), denen die aktuelle Genomforschung besondere Aufmerksamkeit schenkt.
F¨ur ihre schnelle Aufkl¨arung sind DNA–Chips geradezu ideal [12].
Die Schwierigkeit besteht darin, ein Perfect Match–Bindungsereignis zwischen Probe und Target von einem Bindungsereignis mit einer Fehlpaarung, einem Mismatch Pair zu unterscheiden. Denn auch bei einer Fehlpaarung, je nachdem an welcher Stelle sie auftritt und welchen Anteil an Adenin–Thymin–Sequenzen im Vergleich zu stabileren Guanin–
Cytosin–Sequenzen der gebildete Duplex besitzt, kann man normalerweise ein Bindungs- signal detektieren. Ohne ein Referenzsignal ist es daher schwierig zu entscheiden, ob es sich um einen Perfect Match handelt. Zur L¨osung dieses Problems werden pro interessie- rendem SNP alle vier m¨oglichen Basenvariationen dieser Stelle auf den Chip immobilisiert (vgl. Abbildung 1.6). DieTarget–DNA–St¨ucke der zu analysierenden Sequenz binden nun bevorzugter an die komplement¨aren St¨ucke der immobilisiertenProbes als an eine der drei nicht–komplement¨aren Probes. Das st¨arkste Signal unter den vier Variationen zeigt also
A A T C T G T A G
T C T A G
T T T A G A C
A T C
T G T A G C
A A T C T G T A G
C T
C T A G
T C T A G
T T T A G
T T T A G T
A T A G
A A T C C A
A T C C
100% 0% 33%
33%
T A T A G
T A T A G
Abbildung 1.6: Schematische Darstellung der Verwendung von DNA–Chips zur Genotyping Analysis. Die vier Spots enthalten bis auf eine Base, die durchpermutiert wird und in der Dar- stellung fett markiert ist, identische Oligonukleotidsequenzen. Das Target bindet bevorzugt an den Spot mit komplement¨arer Sequenz, wodurch bei der Detektion an dieser Stelle die h¨ochste Fluoreszenz zu beobachten ist.
die Perfect Match Bindungsstelle auf.
Mit dieser Methode kann man DNA–Chips so konzipieren, dass man parallel Infor- mationen ¨uber s¨amtliche SNPs bekommt. Diese M¨oglichkeit birgt ein großes Potential f¨ur Fortschritte in Medizin und Biologie.
1.3.3 Gene Expression Profiling
Die Genexpressionsanalyse ist eine Momentaufnahme der in der Zelle vorhandenen mRNA.
Viele biochemische Vorg¨ange, die u.a. das Auftreten gewisser Krankheiten und die Wir- kungsweise von Medikamenten erkl¨aren, k¨onnen auf Ver¨anderungen in der Genexpression zur¨uck verfolgt werden. DNA–Chips k¨onnen Einblicke in die gewebe– und entwicklungs- spezifische Genexpression und die Auswirkungen ¨außerer Einfl¨usse auf die Genexpression geben. So besitzen z.B. sowohl Raupe als auch Schmetterling das gleiche Genom, und den- noch zeigen sie aufgrund ihrer unterschiedlichen Genexpression unterschiedliche Ph¨ano- typen, d.h. Erscheinungsformen. Der große Vorteil von DNA–Chips gegen¨uber herk¨omm- lichen Verfahren ist, dass die Expression von Tausenden von Genen simultan verfolgt werden kann.
Hierzu wird mit der aus der Zelle gewonnenen mRNA eine inverse Transkription durchgef¨uhrt, mit der zugleich auch Fluoreszenzsonden eingef¨uhrt werden. Die erhalte- nen, markierten cDNA–Target–Str¨ange werden auf den Chip gegeben und hybridisieren dort mit ihren komplement¨aren Sequenzen. Das durch Auslesen des Chips gewonnene Bild enth¨alt Informationen ¨uber die Genexpression [13]. Besonders interessant ist auch ein direkter Vergleich von zwei verschiedenen Proben (vgl. Abbildung 1.3). Dazu k¨onnen DNA–Str¨ange unterschiedlichen Ursprungs mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (z.B.
gr¨un und rot) markiert und beide zur Hybridisierung auf einen Chip gegeben werden. Da- nach fluoreszieren dieSpots entweder gar nicht, in einer der beiden Farben (z.B. gr¨un bzw.
rot) oder in der positiven Mischfarbe (z.B. gelb = gr¨un + rot). Erscheint keine Farbe, so ist in keiner Analyse eine zum immobilisierten Oligonukleotid komplement¨are Sequenz enthalten. Fluoresziert der Spot in der Mischfarbe, dann wurde die komplement¨are Se- quenz in beiden F¨allen exprimiert. Wesentlich interessanter sind aber die F¨alle, bei denen nur eine Farbe erscheint und somit nur die Targets einer der beiden Analysen mit den Probe–Str¨angen des Spots hybridisieren, denn sie zeigen Unterschiede zwischen den Gen-
expressionen der beiden untersuchten Proben auf. Gerade an diesen Unterschieden ist man interessiert, denn diese k¨onnen z.B. den Unterschied zwischen einer gesunden und kranken (Tumor–)Zelle aufzeigen, und sind somit ein Schl¨ussel f¨ur das Design neuer Medikamente.
Weitere neuere Entwicklungen der DNA–Chiptechnologie sind in einem ¨Ubersichtsar- tikel von Stahl zusammengefasst [14]. Arbeitsweisen und Anwendungsbeispiele k¨onnen dem Buch ”DNA Microarrays” entnommen werden [15].
1.4 Herstellung von DNA–Chips
Die Verfahren f¨ur die Herstellung von DNA–Chips sind ebenso vielf¨altig wie ihr Design und ihre Einsatzgebiete. So k¨onnen DNA–Chips mittels verschiedener Druckverfahren wie z.B.
”Microcontact Printing”, ”Contact Tip Deposition Printing”, ”Piezoelectric Printing”,
”Mikro Wet Printing” produziert werden [16]. Alle folgenden Betrachtungen beziehen sich jedoch aufHigh–Density–DNA–Chips und deren Herstellung. Unter einem High–Density–
DNA–Chip versteht man eine Oberfl¨ache auf der eine große Anzahl verschiedener Spots und somit verschiedener DNA–Sequenzen auf kleinstem Raum untergebracht sind (vgl.
Abschnitt 1.2)
Der bisher f¨uhrende Hersteller f¨ur High–Density–DNA–Chips ist die Firma Affyme- trix in Kalifornien. Die Herstellung derHigh–Density–DNA–Arrays erfolgt dort ¨uber Pho- tolithographie mit Masken [17, 18] kombiniert mit Festphasensynthese. Auch die Firma NimbleGen in Madison hat inzwischen voll funktionsf¨ahige Ger¨ate f¨ur die Herstellung von und die Analyse mit DNA–Chips. Sie verbesserte zum einen die Synthese mit optimierten Schutzgruppen (vgl. Abschnitt 1.5.2) und f¨uhrte zum anderen ein maskenloses Verfahren unter Verwendung eines Mikrospiegelarrays5 ein [19], wodurch im Prinzip jeder Anwender selbst seine ben¨otigten Sequenzen individuell und flexibel erzeugen kann.
Die Synthese erfolgt analog zu der allseits verwendeten und optimierten Oligonuk- leotid–Festphasensynthese, bei der die entsprechenden Nukleotide mit der Phosphorami- dit–Methode miteinander verkn¨upft werden [20]. Der Unterschied zwischen klassischer Oligonukleotid–Synthese und in situ DNA–Chip–Synthese besteht darin, dass bei letzte- rer photolabile Schutzgruppen an Stelle der ¨ublicherweise verwendeten s¨aurelabilen DMT–
Schutzgruppe verwendet werden (vgl. Abbildung 1.7). Normalerweise wird bei der Chip- herstellung die 5’–OH–Gruppe der Ribose gesch¨utzt, was einen Aufbau des Oligonukleo- tids in 3’→5’–Richtung bewirkt, in letzter Zeit wird jedoch immer mehr dazu ¨ubergegan- gen, die 3’–OH–Gruppe zu sch¨utzen. Da die 5’→3’–Synthese auch den nat¨urlichen Weg des Oligonukleotid–Aufbaus darstellt, wird es m¨oglich, s¨amtliche enzymatische Modifika- tionen durchzuf¨uhren und somit die Anwendungsm¨oglichkeiten der Chips noch weiter zu vergr¨oßern [21].
Zur Herstellung eines High–Density–DNA–Chips beginnt man mit einer, normaler- weise mit Amin– oder Alkoholgruppen, funktionalisierten Oberfl¨ache. Auf diese wird ein Spacer mit freien OH–Gruppen am Ende angebracht. Die freien OH–Gruppen m¨ussen zu Beginn der Oligonukleotid–Synthese photolabil gesch¨utzt sein, wie es in Abbildung 1.8 gezeigt ist. Im ersten Schritt wird ein bestimmter Bereich des Chips belichtet, was dort zu einer Abspaltung der photolabilen Schutzgruppe f¨uhrt. An die somit entstande- nen freien OH–Gruppen werden daraufhin mit der in der Oligonukleotidchemie ¨ublichen Phosphoramidit–Methode neue Nukleotide angeh¨angt, die wiederum photolabil gesch¨utz- te Enden enthalten. Nun kann in jedem weiteren Schritt jeweils neu an bestimmten Orten auf dem Chip belichtet werden, was dort zu einer Abspaltung der photolabilen Schutzgrup-
5Ein solches Mikrospiegelarray ist auch in jedem Videoprojektor enthalten.
O HO
O O O O
O P O Base
CN Base O Base
NO2 O
O O O O
O P O
CN Base O Base
NO2 O
O
O O P O
O CN
O O P O
O CN O
O P O O CN
O O
O P O CN Base
N O
NO2 O
1. Aktivierung und Kupplung
2. Oxidation 3. Abspaltung der
photolabilen Schutzgruppe
Abbildung 1.7: Die Phosphoramidit–Methode unter Verwendung der photolabilen NPPOC–
Schutzgruppen zur Festphasensynthese von Oligo–/Polynukleotiden.
pen, und somit nach Zugabe der entsprechenden Phosphoramidite zu einer Verl¨angerung der Oligonukleotidkette um ein Nukleotid f¨uhrt. Somit lassen sich Schritt f¨ur Schritt auf jedem Spot charakteristische Sequenzen aufbauen. Wie bereits erw¨ahnt, ist es auf diese Weise m¨oglich, in wenigen Schritten eine Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen herzustel- len. Man ben¨otigt 4·n Zyklen, um 4n Spots mit unterschiedlicher Oligonukleotidsequenz aufzubauen. Damit vereinigt die DNA–Chip–Synthese alle Vorteile von kombinatorischer Chemie und Festphasensynthese.
= photolabile Schutzgruppe = Nukleotide
chip surface
G G G G
G G G G
Chipoberfläche
G G G G
chip surface
G G G G G G G G
chip surface
G G G G G G G G G
A
A A A
chip surface
G G G G G G G G G
A
A A A
chip surface
G G G G G G G G A G
A A A
chip surface
G G G G G G G G A G
A A A
T T T T
chip surface
G G G G G G G G G
A
A A A
T T T T
chip surface
G G G G G G G G G
A
A A A
T T T
T G G G G
A A C C C A C
A
A C G T
Chipoberfläche
Chipoberfläche Chipoberfläche
Chipoberfläche Chipoberfläche
Chipoberfläche
Chipoberfläche Chipoberfläche
Chipoberfläche Chipoberfläche
Chipoberfläche
Abbildung 1.8: Schematische Darstellung der photolithographischen DNA–Chip–Synthese.
Jeder Strang steht hierbei stellvertretend f¨ur die Millionen von Str¨angen eines Spots. Am Ende wird in diesem Beispiel ein Chip mit acht verschiedenen Trinukleotidsequenzen erhalten.
1.5 Photolabile Schutzgruppen
1.5.1 Einsatzfelder photolabiler Schutzgruppen
Schutzgruppen sind Strukturen, die bestimmte Funktionen eines Molek¨uls sch¨utzen und damit unerw¨unschte Umsetzungen mit bestimmten Reagenzien verhindern. Sie k¨onnen
unter gewissen Bedingungen wieder abgespalten, und das Molek¨ul somit entsch¨utzt werden [22]. Im Falle photolabiler Schutzgruppen bewirkt die Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenl¨angen die Schutzgruppenabspaltung.
Photolabile Schutzgruppen spielen in Chemie und Biologie eine immer wichtigere Rol- le. Der Grund hierf¨ur ist zum einen, dass sie orthogonal zu den herk¨ommlichen Schutz- gruppen sind. Der Begriff der Orthogonalit¨at wurde in den 70er Jahren von Merrifield eingef¨uhrt [23] und kann folgendermaßen definiert werden: Zwei Schutzgruppen sind dann orthogonal, wenn sie unabh¨angig voneinander unter verschiedenen Reaktionsbedingungen abgespalten werden k¨onnen. Oft sind diese Reaktionsbedingungen durch den pH–Wert festgelegt. Dies ist z.B. dann der Fall, wenn ein Molek¨ul zwei Hydroxy–Gruppen besitzt, von denen eine mit Acetyl und die andere mit Dimethoxytrityl (DMT) gesch¨utzt ist. Dann kann man im Sauren selektiv die DMT–Gruppe und im Basischen selektiv die Acetyl–
Gruppe abspalten. Die beiden Gruppen sind somit orthogonal zueinander. Im Falle einer photolabilen Schutzgruppe stellt Licht, genauer gesagt ein Photon den Reaktionspart- ner dar. Idealerweise w¨are eine photolabile Schutzgruppe also z.B. orthogonal zu den s¨aure– und basenlabilen Schutzgruppen. In der Praxis sollte man aber nicht vergessen, dass photolabile Schutzgruppen oft auch basen– bzw. s¨aurelabil sein k¨onnen. Es gibt auch viel versprechende Ans¨atze f¨ur chromatische Orthogonalit¨at zwischen photolabilen Schutzgruppen, d.h. die Eigenschaft dass zwei verschiedene photolabile Schutzgruppen durch die Wahl der Wellenl¨ange der Lichts unabh¨angig voneinander abgespalten werden k¨onnen [24].
Licht besitzt gegen¨uber den gew¨ohnlichen Reagenzien außerdem die vorteilhafte Ei- genschaft, dass es homogen in das Reaktionsvolumen eingestrahlt werden kann, und nicht wie alle anderen Reagenzien sich erst einmal durch Diffusion verteilen bzw. vermischt wer- den muss (vgl. Stopped Flow Apparaturen). Außerdem kann man, insbesondere durch die moderne Lasertechnik, eine betr¨achtliche Lichtdosis in sehr kurzer Zeit zur Anwendung bringen. Alle Schutzgruppen werden also zum gleichen Zeitpunkt angeregt. Aufgrund dieser gleichzeitigen Anregung ¨uber das gesamte bestrahlte Volumen ist es mit kurzen Laserblitzpulsen m¨oglich, sehr schnelle Vorg¨ange zu beobachten. In der Biochemie kann dies z.B. genutzt werden, um ein Molek¨ul, dessen Wirkungskinetik untersucht werden soll, durch eine photolabile Schutzgruppe so zu ver¨andern (zu ”maskieren”), dass es seine normalen Funktionen nicht aus¨uben kann. Die maskierten Molek¨ule werden oft als “caged compounds“ bezeichnet [25]. Erst wenn die Schutzgruppe durch Bestrahlung mit Licht entfernt ist, kann dieses Molek¨ul seine Funktion aus¨uben, und man kann die Folgeprozes- se der Freisetzung zeitaufgel¨ost untersuchen. Ein prominentes Beispiel hierf¨ur ist caged–
ATP [26–28]. Damit konnten z.B. Untersuchungen der Na/K–Pumpe in Membranpr¨apa- rationen gemacht oder die Abh¨angigkeit des Ouabain–sensitiven ATP–ADP–Austausches von der Natriumkonzentration bestimmt werden.
Photolabile Schutzgruppen werden neuerdings auch zur Regulierung der Transkription eingesetzt. Wie z.B. bei Kr¨ock und Heckel beschrieben [29], wurde eine Carbonylgruppe von Thymidin gesch¨utzt und dieses modifizierte Nukleosid in eine Oligonukleotidkette eingebaut. Damit konnte die Transkription an dieser Stelle so lange gestoppt werden bis die Schutzgruppe durch Bestrahlung entfernt wurde, und somit eine Basenpaarung mit Adenosin m¨oglich war.
Im Zusammenhang mit photolabilen Schutzgruppen seien auch photolabile Linker erw¨ahnt, wie z.B. das von Holmes et al. entwickelte α–Methyl–6–nitroveratrylamin [30,31]. Bei solchen Linkern findet keine Spaltung zwischen einer Schutzgruppe und deren Substrat statt, sondern zwischen einer Festphase und einem darauf synthetisierten Biomo- lek¨ul. Damit kann zun¨achst durch herk¨ommliche Schutzgruppenstrategien das betreffende
Biooligomer, wie z.B. ein Oligopeptid, auf der Festphase synthetisiert werden. Der letzte Schritt besteht in der photochemischen Abspaltung des Produkts durch Bestrahlung.
Die f¨ur die DNA–Chip–Synthese wichtigste Eigenschaft photolabiler Schutzgruppen besteht darin, dass sich durch Licht mittels der bereits im vorigen Kapitel beschriebenen Masken bzw. Mikrospiegelarrays die Reaktionen sehr leicht r¨aumlich adressieren lassen.
Dies ist f¨ur den in situ–Aufbau eines High–Density–Chips unerl¨asslich.
1.5.2 Photolabile Schutzgruppen f¨ ur die DNA–Chip–Synthese
Tabelle 1.1: F¨ur die DNA–Chip–Synthese gebr¨auchliche photola- bile Schutzgruppen und deren ǫ×φ–Werte
Acronym Struktur ǫ×φ (366 nm) Referenz ONBOC
NO2 O
O
OR 300 M−1cm−1 [32]
MeNPOC
NO2 O
O O OR
O
CH3
300 M−1cm−1 [33]1
NPPOC
NO2 O
O OR CH3
95 M−1cm−1 [34]
DMBOC
O O
O OR
MeO
OMe
<200 M−1cm−1 [35]1
1 Die ǫ×φ–Werte wurden aus den zitierten Arbeiten mit der Bezie- hung t1/2≈ I·Nlg2A·ǫ·φ erhalten, wobeiI die Lichtintensit¨at undNA die Avogadro–Konstante bedeuten.
F¨ur die DNA–Chip–Synthese werden photolabile Schutzgruppen verwendet, die alle- samt Derivate von drei Hauptklassen chemischer Verbindungen sind. Sie geh¨oren zumo– Nitrobenzyloxycarbonyl– (ONBOC), (2-Nitrophenyl)ethyloxycarbonyl–, oder Dimethoxy- benzoincarbonat– (DMBOC)–Typ [35, 36] (vgl. Tabelle 1.1)6. Der am meisten benutzte Vertreter der ersten Klasse ist die ((α-Methyl-2-nitropiperonyl)oxy)carbonyl (MeNPOC)–
Schutzgruppe [11, 33], derjenige der zweiten die 2–(2–Nitrophenyl)propoxycarbonyl (NPPOC)–Schutzgruppe nachPfleiderer[38–40]. Ein k¨urzlich erschienener ¨Ubersichts- artikel von Pirrung gibt einen guten ¨Uberblick [41]. Der f¨uhrende Hersteller f¨ur High–
Density–DNA–Chips, die Firma Affymetrix, verwendet zur Zeit die MeNPOC–Schutz- gruppe. Um qualitativ hochwertigere DNA–Chips in k¨urzerer Zeit herzustellen, besteht jedoch weiterer Bedarf an Verbesserungen der eingesetzten photolabilen Schutzgruppen.
Folgenden vier Anforderungen ist dabei besondere Beachtung zu schenken:
• Die Entsch¨utzung sollte im Idealfall zu hohen Nukleosidausbeuten f¨uhren.
6Als Alternative zu den photolabilen Schutzgruppen f¨ur die photolithographische DNA–Chip–Synthese wurde die Verwendung der s¨aurelabilen DMT–Schutzgruppe beschrieben, die sich abspaltet, nachdem in einer vorgeschalteten Photoreaktion mit einem Triarylsulfoniumhexafluoroantimonat Protonen frei- gesetzt wurden [37].
• Es sollten in m¨oglichst geringem Umfang Nebenreaktionen stattfinden, insbesondere keine, die zu einer falschen Oligonukleotidsequenz im weiteren Verlauf der Synthese f¨uhren.
• Die Reaktionen auf dem DNA–Chip sollten zu homogenen und r¨aumlich begrenzten Spots f¨uhren. Dieser Punkt h¨angt zwar haupts¨achlich von apparativen Faktoren ab, allerdings kann die Schutzgruppe eine Rolle spielen, da Nebenreaktionen zu Inhomogenit¨aten oder unscharfen R¨andern f¨uhren k¨onnen.
• Die photolabile Schutzgruppe sollte eine hohe Lichtempfindlichkeit aufweisen, d.h.
das Produkt ǫ×φ sollte m¨oglichst groß sein (siehe Kapitel 1.5.3).
Eine Optimierung der ersten drei Punkte f¨uhrt zu einer besseren Qualit¨at eines DNA–Chips, der vierte Punkt spielt f¨ur den Zeitbedarf der DNA–Chip–Herstellung ei- ne wichtige Rolle. In diesem Zusammenhang soll erw¨ahnt werden, dass die Qualit¨at der Chips, insbesondere die Entsch¨utzungsausbeuten, durch die Verwendung der (o–Ni- trophenyl)ethyl–Schutzgruppen gegen¨uber der o–Nitrobenzyl–Schutzgruppen verbessert werden konnte [42, 43]. Der Grund daf¨ur ist, dass als Produkt der Entsch¨utzungsreaktion eino–Nitrostyrolderivat anstatt des chemisch reaktivereno–Nitrosobenzaldehyd, bei dem es leichter zu unerw¨unschten Nebenreaktionen kommen kann, gebildet wird. Besonders f¨ur Studien in Zellkulturen und in vivo ist die Vermeidung eines Nitrosoprodukts von Bedeutung [29].
1.5.3 Quantifizierung der Lichtempfindlichkeit photolabiler Schutzgruppen
Als Maß f¨ur die Lichtempfindlichkeit einer Schutzgruppe kann das Produktǫ×φ aus dem Absorptionskoeffizienten ǫder Schutzgruppe und der Quantenausbeuteφder entsprechen- den Entsch¨utzungsreaktion herangezogen werden. Nur wenn die verwendete Schutzgrup- pe sowohl die Lichtenergie gut aufnehmen als auch mit guter Quantenausbeute reagieren kann, ist sie lichtempfindlich.
Wie bereits erw¨ahnt, ist eine hohe Lichtempfindlichkeit w¨unschenswert, um die DNA–
Chip–Synthese zu beschleunigen. Zus¨atzlich erm¨oglicht eine h¨ohere Lichtempfindlichkeit aber auch eine Reduzierung der auf den DNA–Chip eingestrahlten Lichtenergie, was die Wahrscheinlichkeit f¨ur (Photo–)Nebenreaktionen verringert. Ebenso ist es sehr vorteil- haft, nicht zu energiereiches Licht zu benutzen, da ansonsten Photo–Nebenreaktionen der Nukleins¨aurebasen stattfinden k¨onnen wie z.B. die Dimerisierung von Thymidin, eine 2+2–Photozyklisierung [44]. Daher sollte auf keinen Fall mit Wellenl¨angen unter 300 nm bestrahlt werden. Bei der Chip–Produktion hat sich inzwischen 366 nm, die Wellenl¨ange einer intensiven Quecksilberlinie, etabliert. Wird im folgenden also von Absorptionsko- effizienten gesprochen, so geht es, wenn nicht anders erw¨ahnt, um die Wellenl¨ange 366 nm. In der Praxis der Chip–Produktion werden jedoch hinter den Quecksilberlampen Kantenfilter benutzt, die alle Wellenl¨angen oberhalb 350 nm durchlassen.
In Tabelle 1.1 sind einige Werte f¨ur die Lichtempfindlichkeit typischer Schutzgrup- pen f¨ur die DNA–Synthese aufgef¨uhrt. Bemerkenswert ist, dass die Schutzgruppen vom MeNPOC–Typ eine schlechte Quantenausbeute besitzen, die sie jedoch durch eine re- lativ starke Lichtabsorption kompensieren. Im Gegensatz dazu ist die Quantenausbeute bei NPPOC gut, aber diese Schutzgruppe besitzt einen kleinen Absorptionskoeffizien- ten. Durch Substitutionen am aromatischen Kern konnte die ArbeitsgruppePfleiderer
diesen Absorptionskoeffizienten stark erh¨ohen, allerdings wurde dies durch eine nied- rige Quantenausbeute erkauft, wodurch die Steigerung der Lichtempfindlichkeit gering blieb [40]. Dieser gegenl¨aufige Trend von Absorptionskoeffizient und Quantenausbeute h¨angt vermutlich damit zusammen, dass die nach der Substitution ver¨anderten elek- tronischen Verh¨altnisse des o–Nitrobenzol–Chromophor die Wasserstoffatom– ¨Ubertra- gung (siehe Abschnitt 1.9) verlangsamen. Insbesondere Donor–Akzeptor–Substituenten erh¨ohen den Absorptionskoeffizienten wegen der Charge–Transfer–Wechselwirkung mit der als Akzeptor fungierenden Nitrogruppe. Durch diese Art der elektronischen Wechsel- wirkung nimmt der ππ∗–Charakter des angeregten Zustands und auch die Elektronen- dichte an der Nitrogruppe zu. Beides wirkt sich ung¨unstig auf die Rate der Wasserstoff–
Wanderung zur Nitrogruppe aus.
1.5.4 Der Entsch¨ utzungsmechanismus der NPPOC–Schutzgruppe
F¨ur eine Optimierung der Schutzgruppenabspaltung wurden in der ArbeitsgruppePflei- derer Untersuchungen zum Mechanismus der Entsch¨utzung der NPPOC–Schutzgruppe durchgef¨uhrt [38, 39, 46]. Damit wurde, anlehnend an fr¨uhere Untersuchungen zur Pho- tochemie des o–Nitrobenzylchromophors [25, 47–49], ein Mechanismus aufgestellt, des- sen wesentlichen Schritte in der Dissertation von Stefan Walbert nachgewiesen wur- den [45,50]. Wie in Abbildung 1.9 gezeigt, wird der NPPOC–Teil der gesch¨utzten Verbin- dung A zun¨achst in den ersten angeregten Singulettzustand1A1, der einennπ∗–Charakter besitzt, angeregt. Neben strahlungsloser Desaktivierung kann ein Intersystem–Crossing–
Prozess in das Triplettsystem erfolgen. Der unterste Triplettzustand 3A1 besitzt ebenfalls nπ∗–Charakter und kann nach der intramolekularen Wasserstoffatom–Wanderung zur Nitrogruppe das postulierte Triplett–Biradikal 3B bilden, das bei NPPOC jedoch noch nicht direkt beobachtet werden konnte, da es vermutlich zu schnell in einem erneuten Intersystem–Crossing–Prozess zu einem Acinitro–Intermediat relaxiert. Diese Acinitro–
Form7 steht im S¨aure–Base–Gleichgewicht mit ihrem Anion. Der weitere Verlauf der Re- aktion ist also abh¨angig vom pH–Wert der L¨osung bzw. der Verf¨ugbarkeit von Protonen- akzeptoren. Ist kein Protonenakzeptor vorhanden, so erfolgt vermutlich eine intramoleku- lare Zyklisierung, die letztlich zu einem Nitrosoprodukt f¨uhrt, eine Reaktion, die auch f¨ur die Photoreaktion von o–Nitrobenzyl–Verbindungen typisch ist. Das Anion der Acinitro–
Form kann zu einem o–Nitrostyrolderivat, Kohlendioxid und einem Alkoholat, das nach Aufnahme eines Protons das gew¨unschte entsch¨utzte Produkt darstellt, fragmentieren.
Eine der zun¨achst ungekl¨arten Fragen war, ob der Triplettzustand tats¨achlich die re- aktive Vorstufe zur Bildung der Acinitro–Form darstellt. Sie k¨onnte ja auch direkt aus dem Singulettzustand d.h. ohne Umweg ¨uber den Triplettzustand entstehen. Dies h¨atte auch erkl¨art, warum die Triplett–Intermediate des NPPOCs nicht detektiert werden konn- ten. Zur Kl¨arung der Frage, ob der NPPOC–Triplettzustand ¨uberhaupt eine Rolle spielen kann, begann Stefan Walbert die Reaktion mit einem Triplettsensibilisator zu sen- sibilisieren (vgl. Abbildung 1.10, zur Sensibilisierung siehe n¨achster Abschnitt). Diese Experimente verliefen positiv. Allerdings kann damit nicht ausgeschlossen werden, dass bei direkter Anregung des NPPOC–Chromophors auch zus¨atzlich oder ausschließlich eine Reaktion aus dem Singulettzustand erfolgt.
7Ihr pKa–Wert betr¨agt 3.7 [51].
