0 500 1000 1500 2000
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
c /c 0
t * I 0,E
* 10 8
/ E cm -2
T5D0-T
T5D0-C Ac
T5D0-A Bz
T5D0-G Am
Abbildung 5.29: Vergleich der Kinetiken des T5D0–Abspaltung bei Bestrahlung der vier ver-schiedenen (z.T. an den Basen gesch¨utzten) Nukleoside.
Die Bestrahlungsexperimente der vier T5D0–gesch¨utzten Nukleoside, die alle vier Nu-kleobasen, z.T. in zus¨atzlich an den Basen gesch¨utzter Form, umfassen, wurden bereits in Kapitel 5.7 besprochen. Die zugeh¨origen photokinetischen Kurven sind in Abbildung 5.29 gezeigt, und die erhaltenen Kenngr¨oßen im untersten Teil der Tabellen 5.1, 5.2 und 5.3 aufgef¨uhrt. Bei Wellenl¨angen oberhalb 350 nm h¨angen die Absorbanzen nicht von der Art des Nukleosids ab. Die Quantenausbeuten des gesch¨utzten Thymidins T5D0-T, Desoxycytosins T5D0-dCAc und Desoxyadenosins T5D0-dABz liegen grob in einem Be-reich um 0.3, d.h. etwas niedriger als bei NPPOC. Eine Ausnahme bildet das gesch¨utzten Desoxyguanosin T5D0-dGAm, das eine wesentlich kleinere Quantenausbeute besitzt. Ein Entsch¨utzen findet zwar in gleicher Ausbeute wie bei den anderen gesch¨utzten Nukleosi-de statt, allerdings dauert die Entsch¨utzung, wie in Abbildung 5.29 gezeigt, bei gleicher Lichtintensit¨at etwa dreimal so lange. Wie bereits bei den laserblitzspektroskopischen Un-tersuchungen gezeigt, kann diese Beobachtung damit erkl¨art werden, dass eine reversible Elektronen¨ubertragung von Desoxyguanosin auf Thioxanthon stattfindet. Durch diesen zus¨atzlichen Pfad der Desaktivierung des Triplettzustands wird die Quantenausbeute f¨ur die Schutzgruppenabspaltung verkleinert. Die Produktausbeute wird allerdings dadurch
nicht beeinflußt, da nach dem Elektronentransfer die Edukte durch einen R¨uckelektro-nentransfer wieder regeneriert werden. Sie k¨onnen in einer erneuten Photoreaktion immer noch entsch¨utzt werden.
Bei Anwesenheit von Sauerstoff wurde bei Bestrahlung der gesch¨utzten Desoxyadeno-sine und DesoxyguanoDesoxyadeno-sine eine erhebliche Verringerung der Ausbeute an Nukleosid von ca.
50% auf 35% festgestellt. Dies k¨onnte darauf zur¨uckzuf¨uhren sein, dass der Sensibilisator Singulettsauerstoff bildet und dieser mit der Nukleinbase reagiert. Eine M¨oglichkeit f¨ur solch eine Reaktion ist die Oxidation von Desoxyguanosin zu 8-oxo-Desoxyguanosin [175].
Eine entsprechende Reaktion mit Desoxyadenosin ist nicht bekannt. Weitergehende Un-tersuchungen zu diesen Nebenreaktionen wurden jedoch nicht durchgef¨uhrt.
6 Chipexperimente
Nachdem die neuen photolabilen Schutzgruppen synthetisiert waren, und einige davon bei den zeitaufgel¨osten Messungen und den kontinuierlichen Bestrahlungen gute Ergeb-nisse lieferten, war es interessant, sie auch unter den ¨ublichen Produktionsbedingungen der Synthese von DNA–Chips zu testen. Zum Einsatz kam T7C4– und T5D0–gesch¨utztes Thymidin. Aus den gesch¨utzten Nukleosiden mussten zun¨achst die Phosphoramidite her-gestellt werden, die dann mit den freien OH–Gruppen der Oberfl¨ache reagieren konnten, wie es in Abbildung 1.7 auf Seite 8 beschrieben ist.
6.1 Durchf¨ uhrung
Alle Chip–Experimente wurde am MAS1 der Firma NimbleGen GmbH Waldkraiburg durchgef¨uhrt. Der genaue Aufbau der Apparatur und die exakten Reaktionsbedingungen und Zus¨atze d¨urfen hier nicht genannt werden. Die Bestimmung der Ausbeuten f¨ur die stufenweise Synthese von Oligonukleotiden verlief nach einer von Affymetrix ver¨offentlich-ten Vorschrift [33].
F¨ur die Chipexperimente wurden funktionalisierte Glasobjekttr¨ager verwendet2 (vgl.
Abbildung 6.1). Diese wurden in eine spezielle Durchflusszelle eingespannt, und es wurden
O Si
O
O
O
N OH
OH
OH
Abbildung 6.1: Funktionalisierung der Oberfl¨ache des Glasobjekttr¨agers
nach einem Standardprotokoll Spots mit Polythymidinen unterschiedlicher L¨ange erzeugt.
Hierzu wurde zun¨achst 0.5 g des an der 5’–Position photolabil gesch¨utzten Thymidin–
3’–Amidits in 20 ml (sehr trockenem) MeCN mit Zus¨atzen gel¨ost. Diese L¨osung ließ man uber die Oberfl¨ache des Objekttr¨agers str¨omen, wobei, wie in Abbildung 6.2 gezeigt, an¨ fast alle verf¨ugbaren OH–Gruppen auf der Oberfl¨ache gesch¨utztes Thymidin gekuppelt wurde (Schritt 1). Die Phosphoramiditkupplungen funktionieren sehr gut, verlaufen aber nicht absolut quantitativ, wie an der linken OH–Gruppe der Abbildung schematisch ge-zeigt ist. Die Oxidation des Phosphits zum Phosphat (nicht gege-zeigt) erfolgte mit einer L¨osung, die Pyridin, Wasser und Iod enthielt. Daraufhin wurden gewisse Regionen die-ser photolabil gesch¨utzten Oberfl¨ache mit einer Lampenintensit¨at von 105 mW cm−2
1Maskless Array Synthesizer
2Nach einer Hausvorschrift der Firma NimbleGen, Waldkraiburg
OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH O O O O O O O O
O O O O O O O O
OH O O O O O O O O
O OH OH O OH OH O
O O O O O O O O O
O O O O O O O
O O O O
O O O O O O O O O
O O O OH O O O
OH OH O OH
O O O O O O O O O
O O O O O O O
O O O O
O O
O
O
O O O O O O O O O
O O O O O O O
O O OH O
OH OH O
O
O O
O
1
2
3
4
5
7
6
O O O O O O O O O
O O O O O O O
O O O O
O O
O
O
Abbildung 6.2: Schema eines Chipexperiments zur Ausbeute-Bestimmung der photolithogra-phischen Oligonukleotid-Synthese. Die roten Kreise stehen f¨ur die photolabilen Schutzgruppen, die blauen Rechtecke f¨ur die einzelnen Nukleotide. Der gelb dargestellte Bereich wird jeweils belichtet. M¨ogliche unvollst¨andige Reaktionen sind hier bewusst ber¨ucksichtigt. Unerw¨unschten Photoreaktion k¨onnen dazu f¨uhren, dass die 5’-OH–Gruppe irreversible blockiert bleibt. Diese Blockierung ist durch die schwarzen Balken am Ende der Ketten dargestellt.
belichtet. Damit wurden je nach Zeit und Lichtempfindlichkeit die Schutzgruppen abge-spalten und wieder freie OH–Gruppen generiert (Schritt 2). Als L¨osungsmittel w¨ahrend der Belichtung wurde entweder DMSO oder Acetonitril mit Zus¨atzen verwendet. Das Belichtungsmuster wird durch ein Mikrospiegel–Array erzeugt und weist bei den durch-gef¨uhrten Experimenten ein Aussehen auf, wie es in Abbildung 6.3 gezeigt ist. Einer von je vier Mikrospiegeln ist so eingestellt, dass das von ihm reflektierte Licht auf den Chip abgebildet wird, wodurch ein belichteter Spot entsteht. Jeder belichtete Spot ist somit von einer entsprechend breiten unbelichteten Zone umgeben. An die entstandenen freien
16 µ m 16 µ m
Abbildung 6.3: Belichtungsmuster f¨ur die mit dem Mikrospiegel-Array gesteuerte Photolitho-graphie. Jeder dunkel dargestellte Spot wurde durch das von einem Mikrospiegel umgelenkte Licht erzeugt, wobei alle angrenzenden Mikrospiegel stets so geschalten waren, dass auf die ent-sprechenden Spots kein Licht traf, und sich so eine durchgehend unbelichtete Zone um jeden belichteten Spot ergab.
OH–Gruppen kann das n¨achste Amidit gekuppelt werden (Schritt 3 in Abbildung 6.2).
Nach der Oxidation des Phosphits zum Phosphat kann an dieser Stelle erneut belichtet und damit die Schutzgruppe abgespalten werden (Schritt 4). Eine Wiederholung dieser Vorg¨ange f¨uhrt schließlich zu immer l¨angeren Poly–T–Ketten. Zwischen den einzelnen Schritten wurde der Chip jeweils mit einer Waschl¨osung aus Acetonitril gesp¨ult.
Nach den Belichtungs–Zyklen werden alle Schutzgruppen durch eine letzte Belich-tung abgespalten, und die freien OH–Gruppen mit Cy3–Amidit gekuppelt und somit fluoreszenzmarkiert. In einem Chip–Reader k¨onnen dann ortsaufgel¨ost die Intensit¨aten ausgelesen werden, die proportional zu den vor der Reaktion mit Fluoreszenzfarbstoff frei zug¨anglichen OH–Gruppen sind.
Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass nicht nur die Oligomere der vollen L¨ange fluoreszenzmarkiert werden, sondern auch grunds¨atzlich zu kurze Sequenzen zur Fluoreszenzintensit¨at beitragen, wie das in Abbildung 6.2 dargestellt ist (die 5. und 6.
Kette von links sind um ein Nukleotid zu kurz). Dennoch lassen sich aus solch einem Experiment recht n¨utzliche Informationen gewinnen. Abbildung 6.4 gibt einen schema-tischen ¨Uberblick ¨uber die durchzuf¨uhrenden Arbeitsschritte beim Aufbau eines solchen
Testchips.
Zun¨achst l¨asst sich die Homogenit¨at der Schutzgruppenabspaltung beurteilen. Die Spots sollten relativ einheitliche Intensit¨aten aufweisen und nicht in der Mitte, wo die meiste Lichtintensit¨at der Bestrahlung abf¨allt, ausbleichen, was ein Zeichen f¨ur zu lange Belichtung und damit verbundene Nebenreaktionen ist. Damit l¨asst sich auch grob die optimale Bestrahlungsdauer absch¨atzen. Erfahrungsgem¨aß ist diese dann erreicht, wenn die Fluoreszenzintensit¨aten relativ hoch sind, aber noch kein Bleichen in der Mitte der Spots zu sehen ist. Aufgrund dieser nicht ganz pr¨azisen Definition kann mit einem solchen Experiment die optimale Belichtungszeit nur grob abgesch¨atzt werden. Eine weitere
cha-1. photochemische Entschützung
2. Phosphoramidit-Kupplung photolabil
geschützte Chipobefläche
Qualitätsprüfung des Chips 3. photochemische
Entschützung
4. Labeln der freien OH-Gruppen mit einem Fluoreszenzfarbstoff mehrfache Wiederholung
von Schritt 1 und 2
Abbildung 6.4: Ben¨otigte Schritte zum Aufbau eines Chips zum Zweck der Ausbeutebestim-mung.
rakteristische Gr¨oße, die durch das beschriebene Experiment gewonnen werden kann, ist die Ausbeute an freien OH–Gruppen pro Kupplungsschritt. Wie bereits erw¨ahnt, wird die Abnahme der Fluoreszenzintensit¨at mit zunehmender Kettenl¨ange gemessen. Die Fluo-reszenzintensit¨at ist proportional zur Anzahl der freien OH–Gruppen vor dem Schritt der abschließenden Fluoreszenzmarkierung. F¨ur den Aufbau der Oligothymidine auf dem Chip wird die in Abbildung 6.4 dargestellte Reaktionssequenz benutzt. Schritt 3 und 4 ist bei al-len Spots identisch, d.h. die Ausbeuteverluste aufgrund dieser beiden letzten Schritte sind unabh¨angig von der Kettenl¨ange, sofern die OH–Gruppen f¨ur die Fluoreszenzmarkierung gleich verf¨ugbar sind. Angenommen die Gesamtausbeute der beiden Endschritte sei 90%, dann w¨urde die Fluoreszenzintensit¨at aller Spots 10% unter den Maximalwerten liegen, was man allerdings innerhalb eines Chipexperiments nicht bestimmen k¨onnte, da nur re-lative Fluoreszenzintensit¨aten gemessen werden. F¨ur die gemessene rere-lative Abnahme der Fluoreszenz mit zunehmender Kettenl¨ange der Oligothymidine sind Ausbeuteverluste der sich wiederholenden Schritte 1 und 2 verantwortlich (vgl. schwarze Balken in Abbildung 6.2). Dabei handelt es sich um Nebenreaktionen, die freie Alkoholgruppen verschwinden lassen.
Unter der Annahme, dass eine Blockierung nur durch solch fehlerhafte Photoreaktio-nen stattfindet, kann man die Folge der Fluoreszenzintensit¨aten f¨ur eine variable Zahl n von Belichtungszyklen theoretisch wie folgt ableiten. Dazu f¨uhrt man die Gr¨oßepein, die den Anteil an Molek¨ulen angibt, die in einem Synthesezyklus Licht absorbieren und eine Photoreaktion zeigen. Diese Reaktion kann sowohl zu der gew¨unschten Entsch¨utzung als auch zu einer Blockierung der weiteren Synthese an dieser Stelle f¨uhren. Mit der Lichtin-tensit¨atI0, der Bestrahlungsdauert, dem Absorptionsquerschnitt σ und der Quantenaus-beuteφR f¨ur das Auftreten einer photochemischen Reaktion (gleich ob sie zur Abspaltung oder zur endg¨ultigen Blockierung f¨uhrt) ergibt sich f¨ur pder folgende Ausdruck:
p= 1−e−I0·t·σ·φR (6.1)
Zu Beginn sei die Anzahl der mit gesch¨utzten Alkoholgruppen versehenen Ketten a0. Bezeichnet man mit y die Entsch¨utzungsausbeute bei einem Synthesezyklus, so erh¨alt
man nach dem ersten Zyklus eine Anzahl von a0 ·p ·y um ein Nukleotid verl¨angerter Ketten, deren endst¨andige Alkoholgruppe wiederum photolabil gesch¨utzt ist. Bei wegen unzureichender Belichtungszeit nicht vollst¨andiger Reaktion (p <1) sind aber außerdem noch a0·(1−p) gesch¨utzte Ketten vorhanden, die nicht reagiert haben und somit um ein Nukleotid k¨urzer sind. Auch diese k¨onnen in den folgenden Schritten weiter verl¨angert werden, und somit nach Einf¨uhrung einer Fluoreszenzmarkierung zur gemessenen Fluo-reszenz beitragen (vgl. 5. und 6. Kette von links in Abbildung 6.2). Die Anzahl der noch
”reaktiven” Ketten nach dem ersten Syntheseschritt betr¨agt somit a1 =a0 ·(1−p) +a0 ·p·y =a0 · 1−p·(1−y)
(6.2) Im zweiten Belichtungszyklus k¨onnen genau die gleichen ¨Uberlegeungen angestellt werden, und es ergibt sich
a2 =a1· 1−p·(1−y)
=a0· 1−p·(1−y)2
(6.3) F¨ur den n–ten Zyklus ergibt sich entsprechend:
an=a0· 1−p·(1−y)n
(6.4) Unter der Voraussetzung, dass die Ausbeute der Phosphoramidit–Kupplung nicht da-von abh¨angt, ob an die endst¨andige OH–Gruppe der Kette ein weiteres Nukleosid oder ein Fluoreszenzfarbstoff gekuppelt wird, betr¨agt die Anzahlfn der fluoreszenzmarkierten Ketten nach dem n–ten Schritt
fn=an−1 ·p·y=a0· 1−p·(1−y)n−1
·p·y (6.5)
Als Verh¨altnis der Fluoreszenzintensit¨aten zwischen einer Markierung nach dem n–tem und dem ersten Synthesezyklus erh¨alt man somit
In I1
= fn f1
= a0 1−p·(1−y)n−1
·p·y
a0·p·y = 1−p·(1−y)n−1
(6.6) Pro Synthesezyklus ergibt sich f¨ur die Ausbeute der Entsch¨utzung auf dem Chip bzw. bes-ser formuliert die Wahrscheinlichkeit, dass bei Bestrahlung eine Entsch¨utzung zur freien Alkoholgruppe stattfindet, folgender Ausdruck:
y = 1 p
In
I1
(n−1)1
+p−1
(6.7) Die Abh¨angigkeit des Verh¨altnisses IIn1 von p bzw. y ist in Abbildung 6.5 dargestellt.
Hieraus ersieht man, dass die Fluoreszenzintensit¨aten in zunehmenden Maße st¨arker ab-nehmen, wenn die Ausbeute der einzelnen Entsch¨utzungsschitte geringer wird. Ande-rerseits nehmen die Fluoreszenzintensit¨aten weniger stark ab, wenn nur ein kleiner An-teil der Molek¨ule angeregt wird. Dies kann dazu f¨uhren, dass in diesem Fall zu hohe Entsch¨utzungsausbeuten berechnet werden, wenn von vollst¨andiger Anregung ausgegan-gen wird (p= 1).
Um diesen Zusammenhang noch genauer zu untersuchen, wurde in Abbildung 6.6 die Ausbeute y als Funktion des Anteils p an Ketten, die pro Belichtungsschritt eine Pho-toreaktion eingehen, f¨ur unterschiedliche Verh¨altnisse II121 der Fluoreszenzintensit¨aten zu Beginn und nach 12 Synthesezyklen aufgetragen. Bei einem hohen Verh¨altnis der Fluo-reszenzintensit¨aten sind die Kurven bei p > 0.5 recht flach, d.h. selbst bei ungen¨ugend
2 4 6 8 10 12 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(1-1*(1-y)) n-1
Anzahl n der Nukleotide in der Kette
rel.Fluoreszenzintensität
y=0.70 y=0.80 y=0.90 y=0.95 y=1.00
2 4 6 8 10 12
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
p=0.4
p=0.5
p=0.6
p=0.7
p=0.8
p=0.9
(1-p*(1-0.9)) n-1
rel.Fluoreszenzintensität
Anzahl n der Nukleotide in der Kette
p=1.0
Abbildung 6.5: Abh¨angigkeit der relativen Fluoreszenzintensit¨aten IIn1 von der Anzahl n der Nukleotide in der Kette f¨ur verschiedene feste Werte der Ausbeutey und des photoreagierenden Anteils ppro Zyklus. Links: Variation vony f¨urp= 1.0; rechts: Variation vonp f¨ury= 0.9.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
y
p 1.0
0.8
0.6
0.4
0.3
0.2
0.1
Abbildung 6.6: Zusammenhang zwischen der Reaktionsausbeuteypro Belichtungsschritt und dem Anteilpder pro Belichtungsschritt reagierender Molek¨ule f¨ur feste Werte von II121 (siehe An-gaben im Diagramm), dem Verh¨altnis der Fluoreszenzintensit¨aten nach 12 Belichtungschritten und nach dem ersten Belichtungsschritt.
langer Bestrahlung erh¨alt man mit Gleichung 6.6 recht genau die tats¨achlichen Ausbeu-ten, wenn man f¨urp= 1 setzt. F¨ur niedrigere Verh¨altnisse II121 ¨andern sich die berechneten Ausbeuten jedoch bei einer Variation von p zunehmend st¨arker. Bei dem in den folgen-den Experimenten oft beobachteten Verh¨altnis II121 von 0.3 (fettgedruckte, gr¨une Kurve in Abbildung 6.6) erh¨alt man f¨ur yz.B. einen Wert von 0.90 anstelle des wahren Wertes von 0.80, wenn man von gen¨ugend langer Bestrahlung ausgeht (p = 1). Ohne die Kenntnis von p, k¨onnen die Ausbeuten pro Synthesezyklus nur grob bestimmt werden. Die Erfah-rung zeigt allerdings, dass scharfe Spots und eine sich nach Gleichung 6.7 (mit p = 1) ergebende hohe Ausbeute Voraussetzung f¨ur eine sehr gute Schutzgruppe sind.