Verifikation und Konkretisierung der mittels SH2 Domänen Array

Um die im vorangegangenen Kapitel identifizierten phosphorylierungsabhängigen Interaktionen von CEACAM4 mit den verschiedenen SH2 Domänen zu bestätigen, wurden die GST-fusionierten SH2 Domänen auch für pull-down Experimente verwendet. Der Unterschied zwischen dem SH2 Domänen Array und einem pull-down Experiment besteht darin, dass bei den Arrays die GST-SH2 Domänen auf sehr engem Raum fest an eine Oberfläche gebunden sind. Im Gegensatz dazu sind die SH2 Domänen im pull-down Ansatz frei beweglich, wodurch für ihre Interaktionspartner mehr Platz zur Verfügung steht.

Für die in den pull-down Experimenten verwendeten Ganzzelllysate wurden HEK293T Zellen mit einem v-Src-kodierenden Plasmid und einem Kontrollplasmid (GFP) oder einem CEACAM4-GFP-kodierenden Plasmid kotransfiziert und nach 48 Stunden lysiert. Die Lysate wurden auf den Gehalt gleicher Mengen von GFP und CEACAM4-GFP sowie auf Tyrosinphosphorylierung von CEACAM4-GFP mittels Western-Blot überprüft (Abb 3.3.2A).

Mit den GST-fusionierten SH2 Domänen von Hck, PI3KR3-N und -C, Grb14, Lck, Slp76, Nck1, Nck2 und Yes wurden pull-down Experimente mit CEACAM4-enthaltenden Ganzzell-lysaten durchgeführt (Abb. 3.3.2B, 3.3.2C und 3.3.2D). Da die verschiedenen Ansätze nicht alle auf ein SDS-Gel geladen werden konnten, wurde zum besseren Vergleich auf jedem Gel ein pull-down Ansatz der GST-Hck-SH2 Domäne aufgetragen. Ansätze, in welchen phosphoryliertes CEACAM4 mit GST inkubiert wurde, dienten als Negativkontrolle, um eine Interaktion von phosphoryliertem CEACAM4 mit dem GST-Protein auszuschließen. Als weitere Negativkontrolle diente der Versuchsansatz, bei dem die GST-Hck-SH2 Domäne mit Ganzzelllysaten, welche GFP und v-Src enthielten, inkubiert wurde. Durch diese Kontrolle wurde ausgeschlossen, dass GFP phosphorylierungsabhängig mit der SH2 Domäne interagiert. Der in Abbildung 3.3.2B dargestellte pull-down Ansatz bestätigt die Ergebnisse des SH2 Domänen Arrays für die SH2 Domänen von Hck und PI3KR3. Sowohl die GST-Hck-SH2 Domäne als auch die GST-PI3KR3-N-SH2 Domäne präzipitierten CEACAM4 phosphorylierungsabhängig. Verglichen mit dem Versuchsaufbau des SH2 Domänen Arrays, zeigte die C-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 im pull-down eine leicht erhöhte Assoziation mit CEACAM4. Dieser Unterschied lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass die PI3KR3-C-SH2 Domäne nur eine sehr geringe Affinität für phosphoryliertes CEACAM4 hat und somit die sehr geringe Interaktion zwischen beiden Proteinen in dem

räumlich sehr eng begrenzten SH2 Domänen Array nicht mehr detektierbar war. Ebenso wie die SH2 Domänen von Hck und PI3KR3 kann auch die SH2 Domäne der Src-Kinase Lck CEACAM4 phosphorylierungsabhängig präzipitieren (Abb. 3.3.2C). Vergleicht man die Signalintensitäten der Ansätze mit GST-Hck-SH2 und GST-Lck-SH2 Domäne, scheint es, dass CEACAM4 durch die Hck-SH2 Domäne in höherem Maß aus dem Lysat herausgezogen wird als durch die Lck-SH2 Domäne.

Abb. 3.3.2 Die SH2 Domänen von Hck, Lck, Yes, Nck2 und PI3KR3 assozzieren mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM4. (A) HEK293T Zellen wurden mit einem leeren Kontrollvektor (GFP) oder GFP-fusioniertem CEACAM4 in An- oder Abwesenheit eines v-Src kodierenden Plasmids kotransfiziert und nach 2 Tagen lysiert. Die Ganzzelllysate wurden, mittels Western Blot Analyse hinsichtlich Tyrosinphosphorylierung und gleichmäßiger Expression der CEACAM4 überprüft. (B), (C) und (D) Die Ganzzelllysate wurden für ein pull-down Experiment mit den angegebenen GST-SH2 Domänen oder GST allein verwendet. Präzipitiertes CEACAM4 wurden mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper (obere Reihe) nachgewiesen. Die Verwendung von gleichen Mengen an GST-Fusionsproteinen oder GST allein wurde durch Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft.

Betrachtet man allerdings die Mengen an GST-SH2 Domäne (Abb. 3.3.2C Coomassie-Färbung), ist zu erkennen, dass die eingesetzte Menge GST-Lck-SH2 Domäne im Vergleich zur GST-Hck-SH2 Domäne deutlich geringer war. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache kann davon ausgegangen werden, dass die Lck-SH2 Domäne CEACAM4 stärker bzw. in gleichem Maße wie die Hck-SH2 Domäne präzipitiert. Im Gegensatz dazu sind die SH2 Domänen von Grb14 und Slp76 nicht fähig, CEACAM4 zu präzipitieren (Abb. 3.3.2C). Die

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

in Abbildung 3.3.2D gezeigten pull-down Ergebnisse für die GST-SH2 Domänen von Nck1, Nck2 und Yes zeigen, dass sowohl die Yes-SH2 Domäne als auch die Nck2-SH2 Domäne in der Lage war, CEACAM4 phosphorylierungsabhängig zu präzipitieren. Die SH2 Domäne von Nck1 war nur in sehr geringem Maß fähig, CEACAM4 aus dem Lysat herauszuziehen.

Vergleicht man die Mengen an präzipitiertem Protein, ist deutlich erkennbar, dass die SH2 Domäne der Src-Kinase Yes wesentlich weniger CEACAM4 aus dem Lysat präzipitierte als die SH2 Domäne der Src-Kinase Hck. Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu den Ergebnissen des SH2 Domänen Arrays. Das Signal der Assoziation zwischen der Yes-SH2 Domäne und phosphoryliertem CEACAM4 war bei der Analyse mittels SH2 Domänen Array sechsmal stärker, verglichen mit dem Signal der Interaktion von phosphoryliertem CEACAM4 und der Hck-SH2 Domäne.

Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse der pull-down Experimente die bereits im SH2 Domänen Array identifizierten, phosphorylierungsabhängigen Interaktionen der SH2 Domänen von Hck, Yes, Lck, Nck2 und PI3KR3-N mit CEACAM4.

Allerdings kann die SH2 Domänen vermittelte Bindung von Proteinen in Ganzzelllysaten auch durch indirekte Protein-Protein Interaktionen hervorgerufen werden. In diesem Zusammenhang war es wichtig zu untersuchen, ob die einzelnen SH2 Domänen direkt an die tyrosinphosphorylierte ITAM-Sequenz von CEACAM4 binden können und diese Interaktion somit unabhängig von anderen zellulären Komponenten ist. Um dies zu überprüfen, wurden, parallel zu den pull-down Experimenten, einige SH2 Domänen in einem semi-synthetischen Versuchsaufbau untersucht. Für diese direkte Interaktionsanalyse wurden die SH2 Domänen ausgewählt, welche durch die Ergebnisse des SH2 Domänen Arrays am interessantesten erschienen – die Src-Kinase Yes, die Lipidkinase PI3K und das Adapterprotein Nck2. Um die SH2 Domänen dieser Proteine auf eine direkte Interaktion mit den phosphorylierbaren Tyrosinresten der ITAM-Sequenz von CEACAM4 zu untersuchen, wurden 15 Aminosäuren lange Peptide als individuelle Punkte auf einer Zellulosemembran synthetisiert (Frank 1992).

Jedes Peptid enthielt jeweils einen der beiden Tyrosinreste der ITAM-Sequenz von CEACAM4 und wurde sowohl in unphosphorylierter (Y) als auch in phosphorylierter (pY) Form synthetisiert (Abb. 3.3.3). Als erster Schritt wurden alle freien Proteinbindestellen der Zellulosemembran zunächst mit einer Casein-haltigen Lösung abgesättigt. Anschließend wurde je eine Membran mit den rekombinanten GST-fusionierten SH2 Domänen von Yes, Nck2, der N- oder C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 inkubiert. Als Negativkontrolle

auszuschließen. Die an die Peptide gebundenen GST-SH2 Fusionsproteine wurden mit einem anti-GST Primärantikörper und einem Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper nachgewiesen.

Abb. 3.3.3 Die SH2 Domänen der p55 Untereinheit der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3KR3), Nck2 und Yes binden direkt an beide phosphorylierten Tyrosinreste der ITAM-Sequenz von CEACAM4. Membranen, auf denen phosphorylierte (pY) und unphosphorylierte (Y) synthetische Peptide der ITAM- Sequenz von CEACAM4 immobilisiert waren, wurden mit der GST-fusionieren SH2 Domäne von Nck2, Yes, der N- oder C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 oder GST allein inkubiert. Die gebundenen GST-Fusionsproteine wurden mittels monoklonalem anti-GST Antikörper detektiert.

Für das Kontrollprotein (GST) konnte keine Bindung an eines der Peptide detektiert werden (Abb. 3.3.3). Ebenso konnte auch keine Interaktion der getesteten SH2 Domänen mit den unphosphorylierten Tyrosinresten nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu banden alle getesten SH2 Domänen phosphorylierungsabhängig sowohl an den Tyrosinrest Tyr²²² (pTyr²²²) als auch an Tyr²³³ (pTyr²³³) der ITAM-Sequenz von CEACAM4. Jedoch zeigten alle SH2 Domänen eine stärkere Bindung an pTyr²²² als an pTyr²³³. Ebenso interagierten auch beide SH2 Domänen der PI3KR3 direkt mit beiden phosphorylierten Tyrosinresten.

Allerdings interagierten die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 wesentlich stärker mit dem pTyr²²² als die C-terminale SH2 Domäne. Dieses Ergebnis bestätigte das pull-down Experiment, welches ebenfalls eine stärkere Assoziation von CEACAM4 mit der PI3KR3-N-SH2 Domäne zeigte. Auch für die PI3KR3-N-SH2 Domänen von Nck2 und Yes konnte eine direkte Bindung an die beiden phosphorylierten Tyrosinereste (pTyr²²² und pTyr²³³) nachgewiesen werden. Auch in diesem Fall interagierte die Nck2-SH2 Domäne wesentlich schwächer mit dem pTyr²³³ als mit dem pTyr²²². Lediglich die SH2 Domäne der Src Kinase Yes interagierte mit gleicher Affinität mit beiden phosphorylierten Tyrosinresten.

Insgesamt demonstrieren diese Ergebnisse, dass die SH2 Domänen von Yes, Nck2 und der PI3KR3 direkt mit den phosphorylierten Tyrosinresten der ITAM-Sequenz im zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 interagieren können. Dabei sind die Affinitäten der SH2 Domäne von Nck2 sowie der N- und C-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 für Tyr²²² höher als für Tyr²³³. Im Gegensatz dazu bindet die SH2 Domäne von Yes mit annähernd gleicher Affinität sowohl an Tyr²²² als auch an Tyr²³³.

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

3.3.2.3 Die Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne kolokalisiert mit