Immobilisierung von rekombinanten SH2 Domänen auf einer

Als Trägermatrix zur Immobilisierung der SH2 Domänen in punktförmigen Mustern (Spots) wurden aldehydbeschichtete Glasobjektträger (Aldehydslides) verwendet. Die Aldehydoberflächen stellten sich wegen ihrer leichten Handhabung im Hinblick auf die Immobilisierung als am geeignetsten heraus. Als Alternativen wurden zuvor noch die nicht-kovalente Immobilisierung der Proteine auf Nickel-beschichtete Oberflächen und Aminosilanoberflächen getestet. Allerdings erfolgt die nicht-kovalente Bindung eines Proteins auf einer Aminosilanoberflächen lediglich durch elektrostatische Wechselwirkungen

2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

zwischen den Aminosilan-Seitenketten der Oberfläche und negativ geladenen Aminosäureseitenketten (z. B. Aspartat oder Glutamat). Im Vergleich zur kovalenten Bindung der Proteine auf den aldehydbeschichteten Oberflächen immobilisierte eine wesentlich geringere Menge Protein auf der Aminosilanoberfläche. Gegen die Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen sprachen zwei Gründe. Erstens, die SH2 Domänen mussten als 6-fach Histidin-markierte (His6)-Proteine exprimiert und aufgereinigt werden. Dies war nur sehr bedingt möglich, da durch die Expression in E. coli alle His6-SH2 Domänen unlöslich waren und unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt werden mussten. Dadurch konnte die Funktionalität der SH2 Domänen nicht mehr gewährleistet werden. Der zweite Grund, der gegen die Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen sprach, war (genau wie bei den Aminosilanoberflächen) die nicht-kovalente Bindung zwischen Protein und Oberfläche. Auch bei der Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen war es nicht möglich, eine ausreichende Menge an immobilisiertem Protein nachzuweisen. Im Gegensatz zu den Aminosilan- und Nickeloberflächen ist die Bindung von Proteinen an eine Aldehydoberfläche kovalenter Natur und erfolgt über die reaktiven Aldehyd-Gruppen (R-CH=O) der Oberfläche mit primären Aminen (R-NH2) des Proteins. Durch nukleophile Addition primärer Amine kommt es, unter Abspaltung von Wasser (Kondensation), zur Ausbildung kovalenter C=N Doppelbindungen, welche als ‚Schiff’sche Basen’ bezeichnet werden.

Aus Gründen der besseren Löslichkeit wurden die zur Etablierung des Arrays verwendeten SH2 Domänen in Form von GST-Fusionsproteinen (GST-SH2) in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatografie über eine GSH-Sepharose-Säule aufgereinigt. Die Funktionalität der gereinigten GST-SH2 Domänen wurde mittels pull-down Experimenten (Abb. 2.2.1) überprüft. Hierzu wurden die bereits bekannten pTyr-abhängigen Interaktionen des Membranproteins CEACAM3 mit verschiedenen Mitgliedern aus der Familie der Src-Kinase verifiziert (vgl. auch (Schmitter et al. 2007b)). Das Aufbringen der GST-SH2 Domänen auf die Aldehydoberfläche erfolgte mittels eines kontaktlosen Mikroarray-Druckers (Nano-Plotter 2.1, Fa. GeSim). Als Puffer für die Immobilisierung wurde PBS mit 10 % Glycerin verwendet, da auch bereits die gereinigten GST-SH2 Domänen gegen diesen Puffer dialysiert und bei –80 °C gelagert worden waren. Das im Immobilisierungspuffer enthaltene Glycerin soll zum einen die Stabilität der Proteine während der Verarbeitung gewährleisten und zum anderen die Viskosität der Lösung erhöhen, damit gleichmäßige und scharf begrenzte Spots erzielt werden und außerdem der Spot-Durchmesser relativ klein gehalten werden kann.

Protein-Protein Interaktionen

Abb. 2.2.1 Die rekombinanten GST-SH2 Domänen sind funktionell. (A) Die angegebenen rekombinanten GST-SH2 Domänen wurden mit Ganzzelllysaten von HEK293T Zellen, in denen GFP (als Kontrollprotein) oder GFP-fusioniertes CEACAM3 in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimiert wurde, inkubiert. Das Präzipitat wurde mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper auf den Gehalt von CEACAM3-GFP (obere Reihe) untersucht. Der Einsatz von gleichen Mengen an GST-Fusionsproteinen oder GST allein wurde mittels Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft. (B) Die für das pull-down Experiment verwendeten Ganzzelllysate wurden durch Western Blot Analyse hinsichtlich Phosphorylierung und gleichmäßiger Expression von CEACAM3-GFP überprüft.

Zunächst wurde die optimale Proteinkonzentration für die Generierung gleichmäßiger Spots ermittelt. Hierzu wurde jeweils ein konstantes Volumen (7,5 nl pro Spot) einer Proteinlösung mit steigender Proteinkonzentration in Triplikaten gedruckt. Zur Detektion der immobilisierten Proteine wurde der Array nach dem Blockieren der freien Aldehydgruppen (dieses Verfahren wird im nachfolgenden Kapitel 2.2.2 beschrieben) mit monoklonalem anti-GST Primärantikörper und anschließend mit einem fluoreszenzmarkierten (Cy3) Sekundär-antikörper inkubiert. Die dadurch fluoreszenzmarkierten Spots wurden mittels eines Mikroarray-Scanners (LS400 Reloaded, Fa. Tecan) detektiert.

Abb. 2.2.2 Bestimmung der optimalen Proteinkonzentration zur Generierung gleichmäßiger Spots. (A) Unterschiedliche Proteinmengen von GST, GST-Src-SH2 oder GST-Slp76-SH2 Domänen wurden in dreifacher Ausführung als punktförmige Muster immobilisiert. Die Detektion der immobilisierten Proteine erfolgte mittels eines monoklonalen anti-GST Primärantikörpers, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper. Die Fluoreszenzsignale der einzelnen Spots wurden mittels eines Mikroarray-Scanners detektiert. (B) Grafische Darstellung der unter (A) ermittelten Fluoreszenzsignale. Die Nettosignalintensität ergibt sich aus Subtraktion des unspezifischen Hintergrunds vom gemessenen Fluoreszenzsignal. Dargestellt sind die Mittelwerte

±Standardfehler des Mittelwerts von Triplikaten.

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Die konzentrationsabhängigen Fluoreszenzsignale der gedruckten Proteine sind in Ab-bildung 2.2.2 dargestellt. Die maximale Fluoreszenzintensität ist ab einer Proteinkonzen-tration von 1,0 ng/spot erreicht (Abb. 2.2.2B). Bis zu einer Proteinmenge von 1,6 ng/spot wurden distinkte Spots erzielt (Abb. 2.2.2A). Somit konnte die optimale Proteinkonzentration für den Druckvorgang auf einen Bereich von 1,0–1,6 ng/spot eingegrenzt werden. Für alle nachfolgenden Experimente wurde eine Proteinkonzentration von 1,3 ng/spot verwendet. Pro Versuchsdurchführung wurde eine individuelle Anordnung (Array) verschiedener GST-SH2 Domänen in mehrfacher Ausführung auf eine Aldehydoberfläche gedruckt. Die in Abbildung 2.2.2A gezeigte Anordnung der Proteine ist ein Beispiel für einen solchen Array.

Jeweils 16 solcher Arrays konnten auf einem Standard-Glasobjektträger aufgebracht und separat beprobt werden. Um die erfolgreiche Immobilisierung der GST-SH2 Domänen nachweisen zu können, wurde bei jeder Versuchsdurchführung ein Array nach dem Blockieren der freien Aldehydgruppen nicht mit phosphorylierter Probe, sondern mit anti-GST Primärantikörper und anschließend mit fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper inkubiert. Dieser Array wurde auch dazu verwendet, die relativen Mengen an immobilisierten GST-SH2 Domänen über die Fluoreszensintensität der Spots zu ermitteln. Allerdings ist diese Art der Mengenermittlung nur indirekt über die Fluoreszenzintensität der einzelnen Spots möglich, da die Anzahl der Aldehydgruppen pro Fläche, laut Herstellerangaben, unbekannt ist. Dennoch können die Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Spots dazu verwendet werden, die immobilisierten Mengen der unterschiedlichen GST-SH2 Domänen untereinander anzugleichen. Dies ermöglicht somit das Normalisieren der detektierten Phosphotyrosin-abhängigen Bindungssignale auf die Menge an immobilisierten SH2 Domänen innerhalb eines Arrays.