Blockierung und Beprobung von SH2 Domänen Arrays

Die Bildung der ‚Schiff’schen Basen’ zwischen Amino- und Aldehydgruppen erfolgt spontan ohne Energiezufuhr oder Katalysatoren. Somit war es unumgänglich vor der Beprobung der Arrays die noch freien Aldehydgruppen der Oberfläche abzusättigen, um unspezifische Bindungen des zu untersuchenden Protein Interaktionspartners an noch vorhandene freie Aldehydgruppen zu verhindern. Hierzu wurde eine 1%ige BSA-Lösung in PBS verwendet, die noch zusätzlich mit Ethanolamin (Endkonzentration 0,2 M) angereichert war. Die anschließende Beprobung des Arrays erfolgte als erstes mit rekombinanten, in vitro phos-phorylierten Proteinen.

Protein-Protein Interaktionen

Abb. 2.2.3 Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit dem fluoreszenzmarkierten und in vitro phosphorylierten zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3. (A) Rekombinantes, fluoreszenzmarkiertes CEACAM3zyto wurde mittels rekombinatem v-Src in vitro phosphoryliert und via Western Blot unter Verwendung eines monoklonalen anti-pTyr Antikörpers auf erfolgreiche Phosphorylierung überprüft (obere Reihe). Unter Einsatz eines monoklonalen anti-GST Antikörpers wurden die Phosphorylierungsansätze auf den gleichen Gehalt von GST-CEACAM3zyto überprüft (untere Reihe). (B) Zehn verschiedene GST-SH2 Domänenkonstrukte oder GST allein wurden in sechsfacher Ausführung, mit einer Proteinkonzentration von 1,3 ng/spot, auf einer aldehydbeschichteten Oberfläche immobilisiert. Die erfolgreiche Immobilisierung der GST-Proteine wurde mittels monoklonalem anti-GST Primärantikörper, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper überprüft (vgl. auch (C) linke Spalte unten). (C) Auf zwei aldehydbeschichteten Objektträgern wurden jeweils acht identische Arrays aufgebracht (linke Spalte unten, weiß umrandet; unter (B) beschrieben). Im Folgenden wurden jeweils zwei Arrays mit unterschiedlichen Konzentrationen des unter (A) beschriebenen in vitro phosphorylierten GST-CEACAM3zyto beprobt. Als Negativkontrolle wurden zwei Arrays mit unphosphoryliertem GST-CEACAM3zyto inkubiert (linke Spalten, oben). Um eine Autofluoreszenz der immobilisierten GST-SH2 Domänen auszuschließen, blieben zwei Arrays unbeprobt (rechte Spalte unten).

2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

Hierzu wurde zunächst der zytoplasmatische Abschnitt des humanen Oberflächenrezeptors CEACAM3 als GST-Fusionsprotein (CEACAM3zyto) hergestellt und mit dem Fluoreszenz-farbstoff Rhodamin markiert. Anschließend wurden verschiedene Konzentrationen von CEACAM3zyto mittels gereinigter Src-Kinase in vitro phosphoryliert. Die Phosphorylierung wurde mittels Western Blot überprüft (Abb. 2.2.3A). Die zur Beprobung verwendeten Arrays umfassten zunächst lediglich ein kleines Repertoire von zehn verschiedenen GST-SH2 Konstrukten sowie GST und PBS als Negativkontrollen. Auf zwei aldehydbeschichtete Objektträger wurden jeweils acht identische Arrays gedruckt. Ein Array umfasste dabei die zur Untersuchung herangezogenen GST-SH2 Domänen sowie die GST- und PBS-Kontrollen in sechsfacher Ausführung (Abb. 2.2.3B). Die erfolgreiche Immobilisierung der GST-SH2 Domänen wurde durch anti-GST Primärantikörper, wie im Abschnitt 2.2.1 beschrieben, überprüft (Abb. 2.2.3B). Es wurden jeweils zwei Arrays mit einer definierten Konzentration des in vitro phosphorylierten CEACAM3zyto (pCEACAM3zyto) inkubiert (Abb. 2.2.3C). Die Beprobung erfolgte automatisiert mit Hilfe einer Mikroarray-Hybridisierstation (HS 400 Pro^TM, Fa. Tecan). Nach der Beprobung wurden beide Objektträger mit derselben elektronischen Nachverstärkung des Messsignals ausgelesen. Für die Arrays, welche mit unphosphoryliertem CEACAM3zyto beprobt wurden sowie für die unbeprobten Arrays waren keine Bindungssignale detektierbar (Abb. 2.2.3C). Somit kann ausgeschlossen werden, dass GST-CEACAM3zyto phosphorylierungsunabhängig mit den GST-SH2 Domänen interagiert bzw. die immobilisierten GST-SH2 Domänen durch Autofluoreszenz falsch positive Bin-dungssignale liefern.

Die Nettosignalintensitäten der Bindungen an die N-terminale und die Tandem (NC)-SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p85 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3KR1) sind bei allen vier pCEACAM3zyto Konzentrationen gleich (Abb. 2.2.4A). Dies lässt darauf schließen, dass diese GST-SH2 Domänen bereits ab einer Konzentration von 1,57 µg mit pCEACAM3zyto abgesättigt sind. Betrachtet man allerdings die einzelnen Signalintensitäten im Verhältnis zum unspezifischen Hintergrund des Arrays, so ist dieses Verhältnis umso größer, je weniger pCEACAM3zyto zur Beprobung des Arrays verwendet wird (Abb. 2.2.4B).

Die ausschließliche Bindung von pCEACAM3zyto an die GST-SH2 Domänen PI3KR1-N- und PI3KR1-NC legte die Vermutung nahe, dass möglicherweise noch andere Faktoren (Inkubationsdauer, Inkubationstemperatur und/oder „molecular crowding“ Effekte) für die Interaktion mit anderen SH2 Domänen wichtig sein könnten. Dies wurde überprüft, indem in einem ersten Versuchsdurchlauf die Inkubationsdauer mit pCEACAM3 von 1 h bis auf 4 h

Protein-Protein Interaktionen

erhöht wurde. Als diese Änderung in der Versuchsdurchführung keinen Effekt zeigte, wurde die Inkubationstemperatur schrittweise von 20 °C über 25 °C bis auf 30 °C angehoben.

Allerdings führte auch diese Modifikation in der Beprobung zu keiner Änderung der Ergebnisse.

Abb. 2.2.4 Grafische Darstellung der Fluoreszenzsignale, die durch die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit unterschiedlichen Konzentrationen von in vitro phosphoryliertem GST-CEACAM3zyto

ermittelt wurden. (A) Grafische Darstellung der phosphorylierungsabhängigen Bindung von GST-CEACAM3zyto an die immobilisierten GST-SH2 Domänen nach Abzug des unspezifischen Hintergrundsignals.

Die Grafik zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von Sechsfachbestimmungen. (B) Grafische Darstellung der Verhältnisse Fluoreszenzsignal der Spots zu unspezifischem Hintergrundfluoreszenzsignal. Die Grafik zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von Sechsfachbestimmungen.

Dies gilt ebenfalls für den Versuch, einen „molecular crowding“ Effekt in der Beprobungslösung zu erzeugen. Hierfür wurden der Lösung von pCEACAM3zyto

verschiedene Konzentrationen (0,5 %, 1 % bzw. 1,5 %) BSA zugesetzt. Unabhängig von den verschiedentlich variierten Inkubationsparametern blieb es bei der ausschließlichen Bindung von pCEACAM3zyto an PI3KR1-N- und -NC-SH2. Ebenso erfolglos blieben auch die Versuche, den relativ starken Hintergrund durch Variation der Beprobungs- und Wasch-parameter zu verringern. Dies legte die Vermutung nahe, dass möglicherweise freier Fluoreszenzfarbstoff aus der Beprobungslösung an immobilisiertes BSA (welches zum

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Blockieren verwendet wurde) gebunden hatte. Eine weitere Möglichkeit ist, dass sich bei der Beprobung überschüssiges pCEACAM3zyto unspezifisch auf der Oberfläche ablagerte und durch die Waschschritte nicht effizient genug entfernt wurde.

Aufgrund der Tatsache, dass die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit rekombinantem pCEACAM3zyto, hinsichtlich der Detektion von Bindungssignalen, nur mäßig erfolgreich war, wurde das System modifiziert. Durch die Verwendung von Ganzzelllysaten zur Beprobung wurde der Versuchsaufbau dahingehend verändert, dass es ähnlich einem pull-down Experiment auch den Einfluss zellulärer Proteine auf die Interaktion berücksichtigt. Durch diese Modifikation der Beprobung ist es zwar nicht mehr möglich, ausschließlich direkte Interaktionen zwischen den SH2 Domänen und dem zu untersuchenden tyrosinphos-phorylierten Protein nachzuweisen, es können aber dennoch Aussagen über eine indirekte Assoziation zwischen beiden Proteinen getroffen werden. Der hier angestrebte Versuchsaufbau ist im Hinblick auf Versuchsdurchführung und –dauer wesentlich unkomplizierter, als die bisher zu Interaktionsstudien verwendeten pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitationen. Des Weiteren können sehr viel mehr SH2 Domänen auf ihre Interaktion mit einem tyrosinphosphorylierten Protein untersucht werden als es im Maßstab eines pull-down Experimentes oder einer Koimmunpräzipitation möglich wäre.

Die im weiteren Versuchsaufbau zur Beprobung verwendeten Ganzzelllysate enthielten CEACAM3 und v-Src. Beides wurde zuvor in HEK293T Zellen koexprimiert. CEACAM3 wurde als GFP-Fusionsprotein mit zusätzlicher Hämagglutininepitop (HA)-Markierung (CEACAM3-HA-GFP) exprimiert. Die GFP-Fusion ermöglichte es, die verschiedenen Lysate auf den gleichen Gehalt an CEACAM3 einzustellen. Das Angleichen der einzelnen Lysate erfolgte dabei durch Auslesen der GFP-Fluoreszenz mittels des Varioskan Flash (Firma Thermo Scientific). Zusätzlich zur GFP-Fusion besaß CEACAM3 noch eine Peptidsequenz aus dem Hämagglutinin (HA) des Influenz A Virus. Diese HA-Sequenz war nötig, um das auf dem Array gebundene CEACAM3 detektieren zu können. Die Detektion erfolgte mittels eines spezifischen monoklonalen Primärantikörpers gegen die HA-Sequenz, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper. Zur Beprobung wurden drei verschiedene Lysatverdünnungen getestet, wobei die Lysate immer auf die gleiche Konzentration von phosphoryliertem und unphosphoryliertem CEACAM3 eingestellt wurden (Abb. 2.2.5A).

Verglichen mit den Beprobungen, bei denen Fluoreszenzfarbstoff-markiertes, rekombinantes GST-CEACAM3zyto verwendet wurde, konnte bei der Verwendung von Ganzzelllysaten ein

Protein-Protein Interaktionen

Abb. 2.2.5 Evaluierung verschiedener Blockierungs- und Beprobungsparameter für den SH2 Domänen Array. (A) CEACAM3-HA-GFP wurde in An- oder Abwesenheit von v-Src in HEK293T Zellen exprimiert. Die Zellen wurden lysiert und hinsichtlich gleichmäßiger Expression von CEACAM3-HA-GFP und Phosphorylierung mittels Western Blot Analyse überprüft. (B) Auf einem aldehydbeschichteten Objektträger wurden 14 identische Arrays, bestehend aus 15 unterschiedlichen GST-SH2 Domänen und GST allein, in jeweils vierfacher Ausführung gedruckt (Anordnung innerhalb eines Arrays siehe Tabelle). Bei einem Array wurden die nach dem Drucken noch freien Aldehydgruppen mittels 0,25%iger Natriumborhydrid (NaBH4)-Lösung reduziert. Bei einem zweiten Array erfolgte die Absättigung der noch freien Aldehydgruppen mittels einer 1%igen BSA-Lösung. Anschließend wurden beide Arrays zur Detektion der immobilisierten GST-Proteine unter den gleichen Bedingungen mit anti-GST Primär- und Cy3-markiertem Sekundärantikörper inkubiert. (C) Abbildung von 12 SH2 Domänen Arrays, deren nach dem Drucken noch freie Aldehydgruppen, wie unter (B)

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beschrieben, mittels BSA abgesättigt oder NaBH4 reduziert wurden. Die Arrays wurden mit Ganzzelllysaten (siehe (A)) beprobt, die zuvor mittels PBS auf eine Proteinkonzentration von 0,25mg/ml, 0,5mg/ml bzw.

1,0mg/ml verdünnt wurden. Die Dektektion von gebundenem CEACAM3-HA-GFP erfolgte mittels monoklonalem anti-HA Primärantikörper, gefolgt von Cy3-markiertem Sekundärantikörper. (D) Grafische Darstellung der unter (C) detektierten und in Relativwerte umgerechneten Bindungssignale. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardfehler des Mittelwerts aus Vierfachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten.

Wie bei der Beprobung mit Fluoreszenz-markiertem rekombinantem GST-CEACAM3zyto, konnte auch für die mit BSA blockierten und mit Ganzzelllysaten beprobten Arrays kein anderes Bindungsverhalten von CEACAM3 an einzelne SH2 Domänen detektiert werden.

Auch in diesem Fall konnte lediglich die Bindung von CEACAM3 an die N-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 detektiert werden (Abb. 2.2.5C). Wurden die freien Aldehydgruppen der Oberfläche jedoch nicht mit BSA abgesättigt, sondern mittels 0,25%iger Natrium-borhydridlösung (NaBH4) reduziert, konnten bei anschließender Beprobung der Arrays mit den gleichen Ganzzelllysaten Bindungssignale an bis zu 10 verschiedene SH2 Domänen detektiert werden (Abb. 2.2.5C). Die Behandlung der Aldehydoberfläche mit dem Reduktionsmittel NaBH4 reduziert freie Aldehydgruppen in nicht reaktive Alkoholgruppen.

Dies verhindert die Ausbildung von ‚Schiff’schen Basen’ mit Proteinen der Beprobungslösung. Außerdem reduziert NaBH4 auch die Doppelbindungen der ‚Schiff’schen Basen’ der immobilisierten GST-SH2 mit der Aldehydoberfläche zu stabilen sekundären Aminoverbindungen, wodurch die GST-SH2 fester an die Oberfläche gebunden werden.

Auch die Detektion der an die Oberfläche gebundenen GST-SH2 ist im Falle der mit NaBH4

reduzierten Arrays wesentlich gleichmäßiger als für die Arrays, die mit BSA blockiert wurden (Abb. 2.2.5B). Aus diesem Grund wurden alle weiteren Arraybeprobungen unter Ausschluss von BSA durchgeführt. Auch in Bezug auf die Gesamtproteinmenge des zur Beprobung verwendeten Zelllysates wurde festgestellt, dass sich das Verhältnis zwischen phosphorylierungsabhängigem Bindungssignal und unspezifischem Hintergrundsignal verbesserte, je stärker das Lysat verdünnt wurde. Dadurch konnten die Bindungssignale von phosphoryliertem CEACAM3 an die verschiedene GST-SH2 Domänen deutlicher detektiert und ausgewertet werden (Abb. 2.2.5D). Für alle drei Lysat-Verdünnungsstufen (0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml und 1,0 mg/ml Proteingehalt im Lysat) wurden Interaktionen von phos-phoryliertem CEACAM3 mit den SH2 Domänen von verschiedenen Signalproteinen identifiziert. Auch blieben die Verhältnisse der Bindungssignale über die einzelnen Verdünnungsstufen gleich. Dies war in Bezug auf die Versuchsdurchführung ein sehr positiver Effekt, da die Verdünnung der Lysate lediglich auf die Reduktion des unspezifischen Hintergrundsignals Einfluss hatte und nicht auf die Interaktion des zu untersuchenden

pTyr-Protein-Protein Interaktionen

Proteins mit den einzelnen SH2 Domänen. Wie erwartet, zeigten die Negativkontrollen (GST und GST-Slp76-SH2) keine Interaktion mit phosphoryliertem CEACAM3. Im Hinblick auf die Identifizierung neuer Interaktionspartner für CEACAM3 wart deutlich zu erkennen, dass der Rezeptor in seiner phosphorylierten Form eine sehr starke Interaktion mit der SH2 Domäne der Src-Kinase Yes, des Signalproteins Grb14 und der N-terminalen SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K (PI3KR3) aufwies. Auch für die SH2 Domäne des Adapterproteins Nck2, der Proteintyrosinkinase Lck und die C-terminale SH2 Domäne der PI3KR3 konnten Bindungssignale detektiert werden, diese entsprachen in etwa den Signalstärken der Positivkontrollen Hck und Vav. Zwei dieser neu identifizierten, potentiellen Interaktionspartner für CEACAM3 werden in den Kapiteln 3.1 und 3.2 verifiziert und hinsichtlich ihrer Funktion näher untersucht.

2.2.3 Detektion der an die SH2 Domänen gebundenen