Biochemische Methoden

Es wurden standardmäßig 8×6×0,15cm 8 %, 10 %, 12,5 % und 15 % Polyacrylamidgele verwendet. Das Trenngel hatte dabei folgende Zusammensetzung: 8, 10, 12,5 bzw. 15 % Acrylamidlösung, 375mM Tris-HCl pH8.8, 0,1 % SDS, 0,1 % APS und 5μl TEMED mit H2O auf 10ml aufgefüllt. Das Sammelgel wiederum wurde wie folgt angesetzt: 4 % Acrylamidlösung, 130mM Tris-HCl pH 6.8, 0,1 % SDS, 0,1 % APS und 2,5μl TEMED mit H2O auf 6,5ml aufgefüllt. Die Polymerisationsreaktion wurde durch die Zugabe des TEMED gestartet.

Die Proben wurden in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen und unmittelbar vor dem Auftragen auf das Gel 5min bei 95 °C gekocht. Die Gelelektrophorese wurde bei einer Spannung von 100-120V (konstant) und einer Stromstärke von 25mA durchgeführt.

8.2.2 Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen

Die Gele wurden für 30-60min in Färbelösung unter Schütteln inkubiert und anschließend in der Entfärbelösung entfärbt.

8.2.3 Western Blot

Der Transfer der Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine PVDF-Membran erfolgte durch die Semi-dry-Methode. Bei diesem Verfahren wurden drei mit Anodenpuffer getränkte Filterpapiere und die mit Methanol aktivierte PVDF-Membran übereinander auf eine Graphitanode gelegt. Auf die Membran wurden das mit Kathodenpuffer befeuchtete Gel und drei weitere, mit Kathodenpuffer getränkte Filterpapiere geschichtet. Nach der Entfernung von Luftblasen zwischen Filterpapier, Gel und Membran wurde die Graphitkathode aufgelegt und der Transfer für 1–1,5 Stunden bei einer konstanten Stromstärke von 0,7mA pro cm² Gelfläche durchgeführt. Nach dem Transfer der Proteine auf die Membran wurde diese mit Färbelösung zur Kontrolle des Transfers und zum Einzeichnen der Markerbanden angefärbt und anschließend wieder mit Entfärber wieder entfärbt.

8.2.3.1 Immundetektion von Proteinen

Nach dem Transfer der Proteine wurde die PVDF-Membran für 1h bei RT bzw. über Nacht bei 4 °C zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen in Blockierlösung inkubiert. Danach wurde die Membran 3 × 10min mit TBS-T gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper (siehe 4.5.1 Antikörper) ca. 1h bei RT oder über Nacht bei 4 °C.

Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper wurde die Membran erneut 3 x 10min in TBS-T gewaschen und anschließend mit dem sekundären AK ca. 1h bei RT inkubiert. Als Sekundärantikörper wurde ein mit Meerrettichperoxidase gekoppelter Ziege-anti-Maus (siehe 7.5.1 Antikörper) verwendet. Der sekundäre AK wurde in der Verdünnung 1:3.000 in TBS-T eingesetzt. Nach dem Waschen der Membran wurde der Blot kurz mit ECL-Lösung inkubiert.

Zur Detektion der Lumineszenz wurde die Membran einem Röntgenfilm exponiert, welcher abhängig von der Signalstärke für wenige Sekunden bis zu mehreren Minuten aufgelegt wurde.

8.2.3.2 Strippen von PVDF-Membranen

Durch Inkubation der Membran in „stripping“-Puffer für 1 min bei 70 °C wurde die Membran von gebundenem Antikörper befreit. Im Anschluss wurde die Membran durch erneutes Blockieren mit einem weiteren Primärantikörper inkubiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion von verschiedenen Proteinen innerhalb derselben Ausgangsprobe.

8.2.4 Peptid-Bindeexperiment

Die für dieses Experiment verwendeten Peptid-Membranstreifen wurden von Dr. Ronald Frank (Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig, Forschungsgruppe Chemische Biologie) hergestellt. Die Membranstreifen mit den synthetisierten Peptiden wurden mit Blockierlösung (ein Volumenteil Sigma-Aldrich Casein-basierter Blockierpuffer, vier Volumenteile TBS mit 0,005 % Tween und 5 % Saccharose) für 16 h bei 4 °C inkubiert.

Anschließend wurden die Membranen mit der zu untersuchenden GST-SH2 Domäne oder GST in Blockierlösung für 16 h bei 4 °C inkubiert. Nach drei 15minütigen Waschschritten in TBS-T wurde das GST mittels anti-GST Primärantikörper, gefolgt von einem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper detektiert und durch die ECL-Reaktion visualisiert (vgl.

(Schmitter et al. 2007a)).

Methoden

8.2.5 Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Bakterien

8.2.5.1 Expression rekombinanter Proteine

1000ml LB-Medium mit Antibiotikum (abhängig von Bakterienstamm und Plasmid) wurden mit 25ml Übernachtkultur (gleiches Medium) angeimpft und für ca. 4h unter Schütteln (ca.

220 bis 250rpm) bei 30 °C bis zur OD580 von 0,6 bis 0,7 (Ende der logarithmischen Phase) inkubiert. Anschließend wurde die Proteinexpression mit 500µM IPTG induziert Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 30 °C unter Schütteln. Bei Konstrukten, die eine starke Degradation der Fusionsproteine aufwiesen, wurde die Proteinexpression auf 1,5 bis max. 2 Stunden verringert. Anschließend wurde die Bakterienkultur abzentrifugiert und das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

8.2.5.2 Reinigung von GST-Fusionsproteinen

Das Bakterienpellet wurden in 20ml Lysepuffer (1×PBS pH7.4, 2,5mM DTT, 5mM EDTA, Proteaseinhibitoren – 10µM PMSF, 5µg/ml Leupeptin, 10µg/ml Aprotenin, 10µg/ml Pefablock) resuspendiert. Anschließend wurde der Ansatz auf Eis für 2 × 2min mit Ultraschall aufgeschlossen. Das erhaltene Zelllysat wurde 60min bei 16.000 rpm (SS34-Rotor) abzentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45µm filtriert. Im Folgenden wurde das geklärte Lysat auf eine 1ml (bed volume) GS-TrapFF Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,1ml aufgetragen. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule für 1h bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3ml/min mit Puffer A (PBS pH7,4) gewaschen. Anschließend wurde das an die Säule gebundene Protein mittels eines Gradienten von 0 % bis 100 % Puffer B (50mM Tris pH8.0, 10mM GSH) und einer Fließgeschwindigkeit von 0,3ml/min eluiert. Das Eluat wurde mit Hilfe des Fraktionssammlers in Reagenzgläser aufgefangen (10min/pro Fraktion entspricht etwa 3ml). Die einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS-Page und anschließender Coomassie-Färbung auf Proteingehalt überprüft. Die Fraktionen, welche das gereinigte Protein enthielten, wurden vereinigt und in einen Dialyseschlauch überführt. Die Dialyse erfolgte für mindestens 4 x 3 Stunden in je 2 l PBS.

Dabei wurde dem PBS beim letzten Dialyseschritt 10 % Glycerol zugesetzt. Nach der Dialyse wurden die Proteinlösungen aliquotiert, im flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

8.2.6 Analyse von Protein Interaktionen mittels ELISA

In einem ersten Schritt wurden die GST-Fusionsproteine oder GST in dreifacher Ausführung in den einzelnen Vertiefungen einer ELISA-Platte immoblisiert. Dazu wurden die Proteine in 50 mM Na-Bicarbonat pH9.0 aufgenommen, so dass die Konzentration 20 ng/µl betrug.

Davon wurden je 50 μl/pro Vertiefung der ELISA-Platten gegeben und für 5 Stunden oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Immobilisierung der Proteine an die Plastikoberfläche wurde die Lösung wieder von der ELISA-Platte abgesaugt und 480μl Blockierlösung (2 % BSA in PBS-T) pro Vertiefung zugegeben. Das Blockieren der ELISA-Platten erfolgte für 2Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurde die Blockierlösung abgesaugt und die Platten 3-mal mit PBS-T gewaschen. Danach erfolgte die Übernachtinkubation der imoblisierten GST-Fusionsproteine mit verdünnten Ganzzellysaten bei 4 °C. Dazu wurden die Zelllysate in PBS-T (versetzt mit Proteaseinhibitoren und Natriumorthovanadat) auf eine Proteinendkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt. Danach wurden die Platten 3-mal mit PBS-T gewaschen und 50 μl des monoklonaler Maus-anti-HA Antikörper (1:2000 in PBS-T + 2 %BSA) pro Vertiefung zugegeben. Nach 1stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten 3-mal mit PBS-T gewaschen und pro Vertiefung 50 μl Ziege-anti-Maus-IgG (gekoppelt mit Merrettichperoxidase) (1:10.000 in PBS-T) zugegeben. Die Inkubation mit dem Zweitantikörper erfolgte ebenfalls 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Platten erneut 4-mal mit PBS-T gewaschen, 50 μl/well 3,3’,5’5-Tetramethylbenzidine (TMB) zugegeben und 5 bis 15min, je nach Stärke der Reaktion, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl 1 N H2SO4 gestoppt. Die Absorption wurde bei 450 nm mittels des Varioskan Flash der Firma Thermo Scientific gemessen.

8.2.7

Für die GST-pull-down Experimente wurden 5 µg gereinigtes GST-Fusionsprotein oder GST mit 100 µl 50%iger Glutathion-Sepharose (in PBS) versetzt und für 4 Stunden bei 4 °C rotierend inkubiert. Anschließend wurde die Sepharose 3-mal mit PBS-T gewaschen (Zentrifugation für 1min bei 4 °C und 2000xg). Das Sepharosepellet wurde im gleichen Volumen PBS resuspendiert und mit 750 µl geklärtem Zelllysat der HEK293T Zellen inkubiert. Für die Zelllysate wurden die HEK293T Zellen 48 Stunden vorher mit den entsprechenden Plasmidkonstrukten kotransfiziert. Diese Plasmidkonstrukte waren

Methoden

Leervektoren, kodierend für GFP oder kodierten für CEACAM3, CEACAM4 oder v-Src. Die pull-down Proben wurden für 4 Stunden oder über Nacht bei 4 °C unter ständiger Rotation inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze 4-mal mit PBS-T gewaschen (Zentrifugation für 1min bei 4 °C und 2000xg). Das Präzipitat wurde in SDS-Probenpuffer aufgenommen, aufgekocht und mittels Gelelektrophorese, gefolgt von Western Blot Analyse untersucht.

8.2.8 Phosphorylierung von Proteinen in vitro

Alle Phosphorylierungen erfolgten im P-Puffer (20mM TEA-HCl pH7.5, 5mM MgCl2, 0,24mM Vanadat, 0,16mM Molybdat). Der Reaktionsansatz enthielt 10 – 20μg rekombinantes Protein, 20μl P-Puffer, 2μl ATP (100mM), 6 μl Kinase und wurde mit H2Odest

auf ein Gesamtvolumen von 120µl aufgefüllt. Als Kontrollen dienten Ansätze, welche keine Kinase bzw. kein rekombinantes Protein enthielten. Die Phosphorylierungsreaktion wurde durch die Zugabe der jeweiligen Kinase gestartet und für 30min bei 30 °C inkubiert. Zum Stoppen der Reaktion wurde der Phosphorylierungsansatz mit 1mM EDTA in PBS auf eine Proteinkonzentration von 20ng/µl verdünnt. Für den Nachweis der Proteinphosphorylierung mittels Western-Blot wurde vor dem Abstoppen der Phosphorylierungsrekation ein 20µl Aliquot des Ansatzes in 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen, für 5min bei 95 °C inkubiert, auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und auf eine PVDF-Membran transferiert. Das phosphorylierte Protein wurde mittels monoklonalem anti-Phosphotyrosin-Antikörper nachgewiesen.