Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

(1)

Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation

von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.)

vorgelegt von

Kathrin Kopp (geb. Müller) an der

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie

Konstanz, 2011

Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS)

(2)

Tag der mündlichen Prüfung: 01. Juli 2011 1. Referent: Prof. Dr. Christof Hauck 2. Referentin: Prof. Dr. Iwona Adamska

(3)

Danksagung:

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Christof Hauck, der es mir ermöglichte meine Arbeit in seiner Gruppe anzufertigen und mich mit Rat und Ideen unterstützt hat.

Ich möchte mich ganz herzlich bei Frau Prof. Dr. Iwona Adamska bedanken, die sich als Gutachterin bereit erklärt hat, sowie bei Herrn Prof. Dr. Alexander Bürkle für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes.

Besonders möchte ich mich auch bei allen Kollegen meiner Arbeitsgruppe für die Unterstützung, den Spaß bei der Arbeit und das nette Arbeitsklima bedanken. Ganz besonderer Dank gilt Frau Susanne Feindler-Boeckh, für ihre tatkräftige Unterstützung und Hilfe bei großen und kleinen Nöten. Ein ebenso großes Dankeschön an Frau Anne Keller, Ruth Hohenberger-Bregger und Claudia Hentschel, für die Erledigung so vieler kleiner und großer Dinge des Laboralltags.

Ganz besonders möchte ich mich bei all meinen Freunden in Nah und Fern bedanken, die mich über die gesamte Zeit meiner Promotion begleitet, motiviert und unterstützt haben und immer für mich da sind. Ich danke euch für all den Spaß und die schönen Momente sowie eure stets offenen Ohren, wenn ich euch brauchte!

Schließlich möchte ich mich von ganzem Herzen bei meinen Eltern und meinem Bruder bedanken. Danke dafür, dass ihr mich all die Jahre unterstützt habt und immer für mich da seid.

(4)

ZUSAMMENFASSUNG... 7

1 EINLEITUNG... 9

1.1 Protein Arrays ...9

1.1.1 Proteinkopplung an Trägeroberflächen ...10

1.1.2 Detektion der gebundenen Probe...13

1.1.3 Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays...14

1.2 Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen ...16

1.2.1 Proteinkinasen ...17

1.2.1.1 Proteintyrosinkinasen...19

1.2.1.1.1 Die Fokale Adhäsionskinase ...20

1.2.1.1.2 Die Familie der Src-Kinasen ...23

1.2.2 Tyrosinphosphorylierung von Proteinen ...25

1.2.3 SH2 Domänen – wichtige Interaktionsdomänen in der zellulären Signalweiterleitung...26

1.2.3.1 Struktur und Bindungseigenschaften von SH2 Domänen ...27

1.2.3.2 Proteinfamilien mit SH2 Domänen ...28

1.3 Die Familie der CEACAMs...35

1.3.1 Strukturelle und funktionelle Eigenschaften ...35

1.3.2 CEACAMs als Rezeptoren für humanspezifische Bakterien...40

1.3.2.1 Regulation der CEACAM3-vermittelten Phagozytose...43

1.4 Zielsetzungen ...46

2 SH2DOMÄNEN ARRAYS - EINE METHODE ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PHOSPHOTYROSIN-ABHÄNGIGEN PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN... 48

2.1 Einleitung ...48

2.2 Ergebnisse ...49

2.2.1 Immobilisierung von rekombinanten SH2 Domänen auf einer aldehydbeschichteten Trägermatrix...49

2.2.2 Blockierung und Beprobung von SH2 Domänen Arrays...52

2.2.3 Detektion der an die SH2 Domänen gebundenen Phosphotyrosinproteine mittels spezifischer Antikörper...59

2.2.4 Verifikation des SH2 Domänen Arrays – Nachweis zytoplasmatischer Proteintyrosinkinasen ...63

2.3 Diskussion...67

3 BETEILIGUNG VON PROTEINEN MIT SH2DOMÄNEN AN CEACAM-VERMITTELTEN SIGNALWEGEN... 72

3.1 Die Phosphatidylinositol-3’-Kinase als wichtiges Signalprotein in der CEACAM3- vermittelten Phagozytose und Abtötung von human pathogenen Bakterien ...72

3.1.1 Einleitung ...72

3.1.2 Ergebnisse ...76

(5)

3.1.2.1 Die SH2 Domänen der PI3KR3 assoziieren mit dem

zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3 ...76

3.1.2.2 Die SH2 Domänen der PI3KR3 binden phosphorylierungsabhängig an CEACAM3 ...77

3.1.2.3 Die Bindung Opa52-exprimierender Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung der N-terminalen SH2 Domäne der PI3KR3 an den Rezeptor ...80

3.1.2.4 Die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien ist unabhängig von der Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase ...83

3.1.2.5 Die Aktivität der Phosphatidylinositol-3’-Kinase ist notwendig für die Abtötung CEACAM3-bindender pathogener Bakterien...85

3.1.3 Diskussion ...88

3.2 Das Signalprotein Grb14 ist am CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess beteiligt ...94

3.2.2.1 Grb14 interagiert über seine SH2 Domäne direkt mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3 ...97

3.2.2.2 Grb14 wird in humanen Granulozyten exprimiert...100

3.2.2.3 Die Bindung von Opa52-exprimierenden Gonokokken an CEACAM3 führt zur Rekrutierung von Grb14 ...102

3.2.2.4 Grb14 ist ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose ...103

3.3 Identifikation Phosphotyrosin-abhängiger Interaktionspartner für den zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 ...110

3.3.2.1 Identifikation von Interaktionspartnern für CEACAM4 mittels SH2 Domänen Array...111

3.3.2.2 Verifikation und Konkretisierung der mittels SH2 Domänen Array identifizierten Interaktionen für CEACAM4...114

3.3.2.3 Die Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne kolokalisiert mit Bakterien-assoziierter CEACAM3/4-Chimäre ...118

3.3.2.4 Die Überexpression der Yes-, Nck2- oder PI3KR3-N-SH2 Domäne behindert die CEACAM3/4-vermittelte Phagozytose ...120

4 SCHLUSSBETRACHTUNG... 126

4.1 Etablierung des SH2 Domänen Arrays ...127

4.2 Untersuchungen zu SH2 Domänen-abhängigen Protein-Protein Interaktionen bei granulozytischen CEACAMs...128

5 EIGENABGRENZUNGEN... 134

6 PUBLIKATIONEN... 135

7 MATERIAL... 136

7.1 Bakterien ...136

(6)

7.1.2 Escherichia Coli-Stämme...136

7.2 Zelllinien ...136

7.3 Nährmedien für Bakterien und Zellkultur...136

7.3.1 Flüssigmedien und Agarplatten für Bakterien...136

7.3.2 Medien für Zellkultur ...137

7.4 Plasmide und Oligonukleotide ...137

7.4.1 Plasmide ...137

7.4.2 Oligonukleotide ...137

7.5 Antikörper, Enzyme und Proteine... 140

7.5.1 Antikörper ...140

7.5.2 Enzyme und Proteine...140

7.6 Lösungen und Puffer...141

7.6.1 Lösungen und Puffer für eukaryotische Zellen ...141

7.6.2 Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden...142

7.6.3 Lösungen und Puffer für biochemische Methoden ...142

7.6.3.1 Puffer und Lösungen für SDS-PAGE, Coomassiefärbung, Western Blot und Protein Array...142

7.6.3.2 Lösungen und Puffer für die Proteinexpression und –aufreinigung von GST-Fusionsproteinen...143

7.6.4 Chemikalien und Kits...144

7.7 Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien...144

7.8 Software ...144

8 METHODEN... 145

8.1 Molekularbiologische Methoden ...145

8.1.1 Präparation von Plasmid-DNA (nach Birnboim-Doley) ...145

8.1.2 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA ...145

8.1.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ...146

8.1.4 In-Fusion Reaktion...146

8.1.5 Cre-Lox-site spezifische Rekombination ...147

8.1.6 Restriktionsverdau...148

8.1.7 Ligation ...148

8.1.8 Agarosegelelektrophorese ...148

8.1.9 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ...149

8.1.10 Präparation von RNA ...149

8.1.11 Reverse Transkription ...149

8.2 Biochemische Methoden...150

8.2.1 SDS-Gelelektrophorese ...150

8.2.2 Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen...150

8.2.3 Western Blot...150

8.2.3.1 Immundetektion von Proteinen...151

8.2.3.2 Strippen von PVDF-Membranen...151

8.2.4 Peptid-Bindeexperiment ...151

(7)

8.2.5 Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen aus Bakterien ...152

8.2.5.1 Expression rekombinanter Proteine ...152

8.2.5.2 Reinigung von GST-Fusionsproteinen ...152

8.2.6 Analyse von Protein Interaktionen mittels ELISA...153

8.2.7 Pull down Experimente mittels GST-Fusionsproteinen...153

8.2.8 Phosphorylierung von Proteinen in vitro...154

8.3 Herstellung und Beprobung von Protein Arrays...154

8.4 Zellbiologische Methoden...156

8.4.1 Transfektion von Zellen mittels Calcium-Phosphat-Kopräzipitation...156

8.4.2 Herstellung von Zelllysaten...156

8.4.3 FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting)...157

8.4.4 Rezeptorfärbung für FACS ...157

8.5 Herstellung stabiler shRNA-Zelllinien ...158

8.5.1 Klonierung von shRNA in den lentiviralen Vektor pLKO.1 ...158

8.5.2 Produktion lentiviraler Partikel ...158

8.5.3 Transduktion von Zellen mit lentiviralen Partikeln...159

8.6 Infektionsexperimente...159

8.6.1 Kultivierung von Neisserien...159

8.6.2 Beschichten von Platten für den Gentamicin-Protektions Assay ...159

8.6.3 Gentamicin-Protektions Assay ...159

8.6.4 Markierung von Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoffen ...160

8.6.5 Beschichten von Deckgläsern für Konfokalmikroskopie...160

8.6.6 Herstellung von Präparaten für Konfokalmikroskopie...160

8.6.7 FACS-Invasionsassay...161

8.6.8 Aufreinigung von Granulozyten aus humanem Blut...161

8.6.9 Bakterien-Degradations Assay ...162

8.6.10 Quantifizierung der Phagozytoserate von humanen Granulozyten ...162

8.6.11 Messung der Entstehung reaktiver Sauerstoffderivate (Oxidative Burst Messung) in humanen Granulozyten...163

9 ABKÜRZUNGEN... 164

10 LITERATURVERZEICHNIS... 167

(8)

Zusammenfassung

Zur Klärung verschiedenster biologischer Fragestellungen haben Biochips seit nunmehr 20 Jahren einen festen Platz in der Wissenschaft. Die Verwendung von DNA Arrays zur Erstellung von Genexpressionsprofilen im Hochdurchsatzverfahren ist zu einem festen Bestandteil der molekularbiologischen Forschung geworden. Im Gegensatz dazu kann die Untersuchung von Proteinen hinsichtlich ihrer Einbindung in zelluläre Signalnetzwerke bisher nur minimal in parallelen Ansätzen durchgeführt werden. Protein Arrays bieten eine gute Möglichkeit, um auch diese Untersuchungen in großem Maßstab durchführen zu können und somit Einblicke in die Beteiligung einzelner Proteine an verschiedenen Signalwegen zu bekommen. So stellen beispielsweise Protein Arrays mit immobilisierten SH2 Domänen als Affinitätsmatrix eine sehr gute Möglichkeit dar, um Proteine in kürzester Zeit auf Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen mit allen im menschlichen Genom kodierten SH2 Domänen zu untersuchen.

Mit der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für eine solche globale Protein-Protein Interaktionsanalyse gelegt. Etwa zwei Dutzend humane SH2 Domänen wurden rekombinant als GST-Fusionsproteine exprimiert, aufgereinigt und auf einer Trägeroberfläche immobilisiert. Durch Verwendung von Aldehydoberflächen als Trägermatrix wurde eine robuste, da kovalente, Bindung der Proteine an die Oberfläche erreicht. Die nicht durch SH2 Domänen abgesättigten Aldehydgruppen der Oberfläche wurden mittels Natriumborhydrid (NaBH4) reduziert, wodurch die unspezifische Bindung von Proteinen der Beprobungslösung effektiv verhindert wurde. Ebenso erfolgreich war auch die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit Ganzzelllysaten und die anschließende Detektion der gebundenen Phospho- tyrosinproteine durch spezifische Antiköper. Die erfolgreiche Verwendung unterschiedlicher Antikörper zur Detektion zeigt die breite Anwendbarkeit des SH2 Domänen Arrays zur Untersuchung verschiedenster Proteine und Proteingruppen. In diesem Zusammenhang konnten Membranproteine wie CEACAM3 und CEACAM4, die zytoplasmatisch lokalisierende Fokale Adhäsionskinase (FAK) sowie die Gesamtheit der tyrosinphosphorylierten Proteine einer Zelllinie hinsichtlich ihrer Bindefähigkeit an unterschiedliche SH2 Domänen untersucht werden.

Im Zuge der Etablierung des SH2 Domänen Arrays konnten sowohl bereits bekannte als auch bisher unbekannte Interaktionspartner für den phagozytischen Rezeptor CEACAM3 identifiziert werden. Die nähere Analyse der neu identifizierten Interaktionspartner, Grb14

(9)

Zusammenfassung

und Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3K), gaben Einblicke in die Beteiligung dieser Proteine an CEACAM3-vermittelten Signalwegen und bestätigten somit die physiologische Relevanz dieser Interaktionen. So konnte das Signalprotein Grb14 als Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose identifiziert werden, während die PI3K für die Abtötung der internalisierten Pathogene von essentieller Bedeutung ist.

Durch die Anwendung des SH2 Domänen Arrays zur Interaktionspartnersuche für CEACAM4, den evolutionären Vorläufer von CEACAM3, konnten sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede im Bindungsverhalten dieser Proteine an verschiedene SH2 Domänen ermittelt werden. Genau wie für CEACAM3 konnten auch für CEACAM4 phosphory- lierungsabhängige Assoziationen mit den SH2 Domänen der Src-Kinase Yes, dem Adapterprotein Nck2 und der regulatorischen Untereinheit p55 der PI3K festgestellt werden.

Da für CEACAM4 kein natürlicher Ligand bekannt ist, wurden erste funktionelle Untersuchungen nicht mit CEACAM4 selbst, sondern unter Einsatz eines chimären Proteins, durchgeführt. Diese Chimäre bestand aus der OpaCEA-bindenden N-terminalen Domäne des phagozytischen Rezeptors CEACAM3 und dem zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 und ermöglichte die Beobachtung der Lokalisation sowie Untersuchung der Funktion der neu identifizierten Interaktionspartner im Infektionsverlauf. Neben diesen Gemeinsamkeiten wurden allerdings auch interessante Unterschiede zwischen CEACAM3 und CEACAM4 festgestellt. So konnte weder für den neu identifizierten Negativregulator, der CEACAM3- vermittelten Phagozytose, Grb14 noch für den, für die Phagozytose über CEACAM3 essentiellen, Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav eine phosphorylierungsabhängige Assozi- ation mit CEACAM4 gefunden werden. Diese Befunde deuten trotz enger Verwandtschaft beider Rezeptoren auf abweichende Signalwege hin.

(10)

Protein Arrays

1 Einleitung

1.1 Protein Arrays

Seit nunmehr 20 Jahren haben DNA Arrays einen festen Platz in der molekularbiologischen Forschung. Sie finden beispielsweise Anwendung bei der Erstellung von Genexpressionsprofilen, der Detektion von Sequenzdeletionen und –mutationen, sowie der Identifikation von Transkriptionsfaktorbindestellen (Bertone and Snyder 2005). Die DNA Arrays können im Hochdurchsatzverfahren angewendet werden, geben jedoch lediglich Auskunft über die Präsenz oder Transkription der untersuchten Gene und nur in einem sehr geringem Umfang Aufschluss über die Funktion der Proteine, für welche sie kodieren (Hall et al. 2007). Bisher gibt es viele verschiedene Methoden, um beispielsweise die Interaktions- und Signaltransduktionseigenschaften von isolierten Proteinen zu untersuchen. Jedoch sind diese Methoden (z. B. Far-Western, pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitation) sehr zeitintensiv und nicht im Hochdurchsatzverfahren sowie in großem Maßstab anwendbar (Wolf-Yadlin et al. 2009). In diesem Zusammenhang stellt die seit einigen Jahren immer mehr an Aufschwung gewinnende Protein Array Technologie eine sehr viel versprechende Alternative dar. Im Gegensatz zu den DNA Arrays ermöglichen die Protein Arrays unter anderem die funktionelle Analyse von Protein-Protein Interaktionen in einem sehr schnellen und großen Maßstab (Bertone and Snyder 2005; Wolf-Yadlin et al. 2009). Weitere Einsatzmöglichkeiten von Protein Arrays ist ihre Verwendung zur Untersuchung von Protein- DNA (Bulyk et al. 1999; Bulyk 2007), Substrat-Enzym (z. B. Proteasen, Peroxidasen, Phosphatasen, Kinasen) (Arenkov et al. 2000; MacBeath and Schreiber 2000; Zhu et al. 2000) oder Protein-Ligand (Bradner et al. 2006) Interaktionen. Ähnlich wie die DNA Arrays enthalten auch die Protein Arrays sehr viel Information auf sehr engem Raum. Dies ist so zu verstehen, dass eine sehr geringe Menge an Protein (im Piko- oder Nanogrammbereich) auf eine sehr kleine Fläche von oft nur wenigen Mikrometern Durchmesser aufgebracht wird.

Werden viele verschiedene Proteine auf diese Weise in punktförmigen Mustern (Spots) auf einer speziellen Trägeroberfläche immobilisiert, so wird die Gesamtheit dieser individuell angeordneten Spots als Array bezeichnet. In der Literatur werden in diesem Zusammenhang auch oft die Begriffe „Biochip“ oder Mikroarray verwendet. Diese Bezeichnungen verdeutlichen die Miniaturisierung der Testansätze, bei denen eine hohe Anzahl von Molekülen auf sehr kleinem Raum immobilisiert wird. Heutzutage gibt es beispielsweise DNA Arrays die aus bis zu 200.000 einzelnen Spots pro cm² bestehen. Durch diese

(11)

Einleitung

Protein Arrays

Miniaturisierung der Testansätze ist es möglich, mehrere hundert bis tausend verschiedene Protein-Spots auf eine Trägeroberfläche aufzubringen, die den Maßen eines normalen Mikroskopobjektträgers entspricht. In der Folge können diese Arrays unterschiedlich beprobt werden. Zum einen kann die Beprobung mittels markierter, löslicher Proben (z. B.

Fluoreszenz-markierter Proteine) erfolgen. Zum anderen ist aber auch eine Inkubation mit unmarkierten Proben möglich. Bei dieser Beprobungsform wird die gebundene Probe in weiteren Inkubationsschritten mit Hilfe spezifischer Primär- und fluoreszenzgekoppelter Zweitantikörper nachgewiesen. Durch Auslesen der Fluoreszenzintensität kann die Bindung der Probe an jeden einzelnen Spot quantitativ erfasst werden. Mittels dieser Methodik konnte bereits ein Großteil des gesamten Hefe-Proteoms (etwa 5800 Genprodukte) im Array Format aufgetragen und analysiert werden, wobei Protein-Protein und Protein-Lipid Interaktionen im Vordergrund standen (Zhu et al. 2001). Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von Protein Arrays wurde von Jones et al. im Jahr 2006 vorgestellt. Sie zeigten, dass ein funktionaler Proteindomänen Array, auf der Basis von isolierten SH2 Domänen, eine realistische Methodik darstellt, um Bindungseigenschaften von Phosphotyrosin (pTyr)-modifizierten Peptiden quantitativ zu bestimmen (Jones et al. 2006).

1.1.1 Proteinkopplung an Trägeroberflächen

Das Aufbringen der Proteine auf speziell beschichteten Mikroskopobjektträgern erfolgt unter Verwendung eines Kontakt-Mikroarraydruckers (MacBeath and Schreiber 2000; Zhu et al.

2001) oder mittels eines kontaktfreien Druckers (Delehanty and Ligler 2003; Delehanty 2004;

Jones et al. 2006). Um die Stabilität der Proteine während und auch nach dem Druckvorgang zu gewährleisten, müssen diese vor Austrocknung geschützt werden. Aus diesem Grund wird dem Immobilisierungspuffer eine möglichst hohe Konzentration Glycerin zugesetzt.

Zusätzlich sollte der Druckprozess bei einer konstant hohen Luftfeuchtigkeit (circa 70-85 %) durchgeführt werden (MacBeath and Schreiber 2000; Jones et al. 2006; Kaushansky et al.

2010). Zur Proteinimmobilisierung steht eine große Auswahl unterschiedlich behandelter Trägeroberflächen zur Verfügung. Bei der Wahl eines geeigneten Trägers sollte darauf geachtet werden, dass der Kontakt zwischen Protein und Oberfläche keinen negativen Einfluss auf die Proteinkonformation und –funktionalität hat und dass eine maximale Binde- kapazität erreicht wird (Zhu et al. 2003). Eine weitere wichtige Überlegung für die Wahl einer geeigneten Oberfläche ist, ob die Proteine in räumlich ungerichteter oder gerichteter Orientierung gebunden werden sollen.

(12)

Protein Arrays

Eine Möglichkeit, Proteine in einer einheitlichen räumlichen Orientierung zu immobilisieren, ist die Verwendung von Affinitäts-getaggten Oberflächen. Für diesen Zweck verwendbare Oberflächenvarianten sind zum Beispiel mit Nickelionen beschichtete Glasobjektträger, welche die Immobilisierung von Hexa-Histidin-markierten Proteinen ermöglichen (Zhu et al.

2003). Jedoch ist die Bindung zwischen Nickel-NTA und Histidin-markierten Proteinen weder sehr stark, noch sehr stabil. Im Gegensatz dazu ist die Interaktion zwischen Biotin und Avidin eine der stärksten und stabilsten nicht-kovalenten Bindungen. Im Jahr 2002 veröffentlichten Lesaicherre et al. eine Methode, die es ermöglicht Proteine seiten-spezifisch zu biotinylieren, um sie im folgenden auf einer Avidin-beschichteten Glasoberfläche zu immobilisieren (Lesaicherre et al. 2002). Diese Form eines Protein Arrays bietet, genau wie die Immobilisierung von Histidin-markierten Proteinen auf Nickel-Oberflächen, eine nicht- kovalente Bindung und räumlich einheitliche Orientierung der Proteine. Allerdings ist diese Interaktion zwischen Protein und Oberfläche wesentlich robuster und extrem stabil.

Für eine nach dem Zufallsprinzip räumlich ungerichtete Proteinimmobilisierung stehen derzeit Glasobjektträger mit Aminosilan-, Aldehyd- oder Epoxybeschichtung zur Verfügung (MacBeath and Schreiber 2000; Kusnezow et al. 2003). Auch die Verwendung von Glas- trägern beschichtet mit Nitrozellulose oder Poly-L-Lysin bewirkt eine ungerichtete Immo- bilisierung der Proteine. Bei diesen beiden Oberflächenbeschichtungen werden die Proteine durch passive Adsorption an die Oberflächen gebunden (Stillman and Tonkinson 2000;

Angenendt et al. 2002; Zhu et al. 2003; Charles et al. 2004; Kramer et al. 2004). Bei der Verwendung von Aminosilan-beschichteten Oberflächen erfolgt die Immobilisierung ebenfalls nicht-kovalent durch die Ausbildung von unspezifischen elektrostatischen Ionenbin- dungen zwischen negativ geladenen Aminosäureseitenketten (z. B. Glutamat oder Aspartat) des Proteins und den positiv geladenen primären Aminen der Oberfläche (Abb. 1.1.1).

Abb. 1.1.1 Darstellung der nicht-kovalenten, elektrostatischen Bindung einer Peptidkette an eine Aminosilanoberfläche. Die negativ geladene Aminosäureseitenkette (COO^-) eines Peptids/Proteins (R-) geht mit dem positiv geladenen primären Amin (⁺NH3) eine unspezifische elektrostatische Ionenbindung (Doppelpfeil) ein. Als Beispiel eines negativ geladenen Aminosäurerests wurde Glutamat (Glu) gewählt. Der Bereich der elektrostatischen Bindung ist umrandet. Aus (Müller and Röder 2004).

(13)

Einleitung

Protein Arrays

Eine kovalente Alternative der Bindung von Proteinen an „aktivierte“ Glasobjektträger ist die Verwendung von Aldehyd-beschichteten Oberflächen. Zwischen den reaktiven Aldehyden (R-HC=O) der Oberfläche und primären Aminen (R-NH2) der Aminosäureseitenketten des Proteins kommt es durch nukleophile Addition unter Wasserabspaltung (Kondensation) zur Ausbildung von kovalenten C=N Doppelbindungen, die auch als „Schiff’sche Basen“

bezeichnet werden (Abb. 1.1.2).

Abb. 1.1.2 Bildung der ‚Schiff’schen Basen’

durch Kondensation zwischen Protein und Aldehydoberfläche. (A) Reaktive Aldehyd- gruppen der Oberfläche interagieren mit den primären Aminen (-NH2) der Peptide/Proteine.

(B) Zwischen dem primären Amin einer Arginin-Seitenkette (Arg) und der Aldehydgruppe (R-HC=O) kommt es zu einer nukleophilen Addition unter Abspaltung von Wasser (H2O). (C) Dadurch entsteht eine kovalente Verbindung (Schiff’sche Base). Aus (Müller and Röder 2004).

Die Kondensation findet ohne zusätzliche Energie oder Katalysatoren statt. Ein Vorteil gegenüber den Aminosilanoberflächen besteht neben der kovalenten Bindung darin, dass die Aldehydoberfläche hydrophob ist, wodurch sich die wässrige Proteinlösung nach dem Auftragen nicht so stark ausbreitet und somit wesentlich kleinere Spots erzeugt werden können.

Eine dritte Möglichkeit zur Immobilisierung von Proteinen besteht in der Verwendung von Epoxy-modifizierten Glasobjektträgern (Abb. 1.1.3). Epoxy-Ringstrukturen sind sehr reaktive elektrophile Gruppen, welche ebenfalls kovalente Bindungen mit nukleophilen primären Aminen der Proteine ausbilden.

Abb. 1.1.3 Bindung von Peptiden und Proteinen an reaktive Epoxyoberflächen. Das positiv geladene primäre Amin (⁺NH3) einer Aminosäure (Arg) ‚attackiert’ mit einer nukleophilen Addition das CH2

innerhalb der Epoxy-Ringstruktur. Die kovalente Bindung zwischen dem Sauerstoffatom und dem CH2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur wird aufgelöst und es entsteht eine kovalente Bindung zwischen dem Peptid/Protein und der Oberfläche. Aus (Müller and Röder 2004).

(14)

Protein Arrays

Dabei wird die kovalente Bindung zwischen dem Sauerstoffatom und dem CH2 innerhalb der Epoxy-Ringstruktur durch nukleophile Addition des positiv geladenen primären Amins aufgelöst. In der Folge entsteht eine kovalente Bindung zwischen dem Stickstoffatom des Proteins und dem Kohlenstoffatom der CH2-Gruppe der Oberfläche.

1.1.2 Detektion der gebundenen Probe

Abhängig vom Typ des verwendeten Arrays gibt es viele verschiedene Detektionsmöglichkeiten der gebundenen Probe. So können zum Beispiel Enzym-Substrat Interaktionen mittels Fluoreszenzmarkierung, Chemilumineszenz oder radioaktiver Markierung detektiert werden. Im Allgemeinen wird derzeit die Fluoreszenzmarkierung für Hochdurchsatzanalysen bevorzugt angewendet, da sie mit den gegenwärtig gängigen Modellen von DNA Array-Laserscannern kompatibel ist (Bertone and Snyder 2005). Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von affinitäts- oder photochemisch-markierten Proben (Colca and Harrigan 2004; Mitsopoulos et al. 2004).

Ein Beispiel für die Verwendung von affinitätsmarkierten Proben sind die Interaktionsstudien von Huang et al. aus dem Jahr 2004. Ziel dieser Untersuchungen war es, neue chemische Substanzen zu identifizieren, welche den antiproliferativen Effekt von Rapamycin sowohl verstärkend als auch inhibierend modulieren und somit Einfluss auf das target of rapamycin (TOR)-Signalnetzwerk haben. Hierzu wurde ein Hefeproteom Array mit Biotin-markierten chemischen Substanzen inkubiert. Im Anschluss wurden die gebundenen biotinylierten Moleküle mittels Cy3-markiertem Streptavidin nachgewiesen (Huang et al. 2004). Auf gleiche Weise können auch Protein-Protein Interaktionen detektiert werden. Hierzu wird die Proteinprobe vor der Inkubation mit dem Array biotinyliert. Nach der Beprobung des Arrays mit der biotinylierten Proteinprobe wird der Array nach einem Waschschritt mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin inkubiert. Die Bindung des Fluorophor-konjugierten Streptavidins an die gebundenen biotinylierten Proteine ermöglicht somit die Detektion der spezifischen Interaktion mittels eines Mikroarray-Laserscanners. Bei dieser Beprobungsform sollte allerdings sichergestellt werden, dass die Biotinmarkierung der Probe nicht die Protein- Protein Interaktionsdomäne maskiert.

Ein wesentlich einfacheres Verfahren besteht darin, dass die zur Beprobung verwendeten Proteine direkt mit einem Fluorophor markiert werden. Die direkte Markierung von Proteinen wird durch die Verwendung von aminreaktiven Farbstoffen gewährleistet. Diese

(15)

Einleitung

Protein Arrays

Succinimidylester reagieren mit primären Aminen der Proteine und bilden stabile Konjugate.

Um ungebundenen Farbstoff zu entfernen, werden die fluoreszenzmarkierten Proteine dialysiert oder durch Größenausschlußchromatografie aufgereinigt. Auch bei der Beprobung mit direkt markierten Proben erfolgt die Detektion der gebundenen Probe mittels eines Mikroarry-Laserscanners. Ebenso wie bei der Biotinmarkierung ist auch in diesem Fall darauf zu achten, dass der gebundene Fluoreszenzfarbstoff keinen Effekt auf die Protein-Protein Interaktion hat. Neben den bisher beschriebenen Beprobungsmöglichkeiten mit chemischen Substanzen und Proteinen können auch andere Substanzen zur Beprobung eines Protein Arrays verwendet werden, um unterschiedliche molekulare Interaktionen zu untersuchen. Ein Beispiel hierfür sind Untersuchungen zu molekularen Interaktionen zwischen Proteinen und DNA. Bei diesen Versuchsansätzen wird der Protein Array mit fluoreszenzmarkierter DNA beprobt. Dafür wurde die DNA zuvor entweder durch Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden während DNA-Synthese oder durch die Konjugation von aminreaktiven Succinimidylestern an 5-(3-aminoallyl)-dUTPs markiert (Bertone and Snyder 2005).

1.1.3 Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays

Mittels Protein Arrays ist es möglich tausende von Proteinen gleichzeitig hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften zu charakterisieren und zu quantifizieren. Protein Arrays werden nicht nur zur Funktionsaufklärung von bislang uncharakterisierten Proteinen genutzt, sondern auch zur Analyse der Funktion bereits bekannter Proteine.

Abb. 1.1.4 Anwendungsmöglichkeiten für funktionelle Protein Arrays. Unterschiedliche Beprobungsmöglichkeiten von Protein Arrays.

Die Proteine wurden auf sehr kleinem Raum auf

beschichteten Mikroskopobjektträgern immobilisiert. Im Anschluss erfolgte die

Inkubation des Objektträgers mit fluoreszenz- marktierter Probe. Neben dem hier als Beispiel aufgeführten Fluorophor Cy5 gibt es noch eine große Anzahl anderer Fluorophore, die zur Detektion verwendet werden können. Modifiziert aus (Hall et al. 2007).

(16)

Protein Arrays

Protein Arrays finden bereits bei der Aufklärung verschiedenster Fragestellungen Anwendung. Beispiele hierfür sind Untersuchungen auf den Gebieten der Protein-Protein Interaktionen des Hefeproteoms (Zhu et al. 2001), der Protein-Rezeptor Interaktionen, der Protein-DNA Interaktionen (Hall et al. 2004), der Protein-Lipid Interaktionen (Zhu et al.

2001), der Antigen-Antikörper Interaktionen (Michaud et al. 2003) und Interaktionen zwischen Proteinen und chemischen Substanzen (Abb. 1.1.4) (Huang et al. 2004). Weitere Anwendungsmöglichkeiten von Protein Arrays sind die Untersuchung von Kinaseaktivitäten (Zhu et al. 2000; Ptacek et al. 2005) oder die Charakterisierung verschiedener humaner Seren hinsichtlich ihrer Antikörperzusammensetzung (Zhu et al. 2006).

(17)

Einleitung

Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen

1.2 Intrazelluläre Signaltransduktion durch Phosphotyrosin-abhängige Protein-Protein Interaktionen

Die Weiterleitung eines Signals innerhalb der Zelle ist ein sehr komplexer Prozess, an dessen Ende unterschiedliche zelluläre Reaktionen wie zum Beispiel Gentranskription, Proteintransport, Proteindegradation, Zellwachstum, Zellmotilität oder Immunantwort stehen.

Um die temporäre, reversible und dynamische Regulation von intrazellulären Signalwegen zu gewährleisten, ist eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen notwendig. Die fundamentalen Komponenten der intrazellulären Signalleitung sind Proteine und niedermolekulare Stoffe (z. B. die second messenger Ca²⁺ oder Diacylglycerol). Wenn ein Signal die Zelle erreicht, wird es über einen Rezeptor an nachgeschaltete Proteine weitergegeben. Diesen Proteinen sind wiederum weitere Proteine als nachgeschaltete Effektoren in der Reaktionskette zugeordnet. Auf diesem Weg werden nacheinander viele verschiedene Signalproteine in die Weitergabe eines Signals einbezogen, wodurch sich eine intrazelluläre Signalkette ausbildet. Die wichtigsten Proteinkomponenten der intrazellulären Signalleitung sind Proteinkinasen, Proteinphosphatasen, regulatorische GTPasen sowie Adapter- und Gerüstproteine.

Die regulatorischen GTPasen haben die Funktion eines Schalters. Dieser kann in einer aktiven oder inaktiven Form vorliegen. In ihrer aktiven Form können GTPasen Signale an nachgeschaltete Komponenten des Signalwegs weitergeben. In der inaktiven Form ist die Weiterleitung des Signals unterbunden.

Die Adapter- und Gerüstproteine vermitteln die Weiterleitung eines Signals zwischen einzelnen Proteinen eines Signalweges. Indem sie die einzelnen Signalproteine der Signalkette in eine nahe räumliche Beziehung bringen, wird eine effektive und spezifische Signalübertragung gewährleistet.

Das zentrale Werkzeug zur Weitergabe von Signalen innerhalb einer Zelle stellt jedoch die Proteinphosphorylierung durch Proteinkinasen dar. Der Phosphorylierungsstatus eines Proteins wird durch das Zusammenspiel von Proteinkinasen und Phosphatasen reguliert. Die enzymatischen Prozesse der Phosphorylierung und Dephosphorylierung ermöglichen es, Proteine in reversibler Weise zu aktivieren oder zu inaktivieren. Sowohl Proteinkinasen als auch Proteinphosphatasen sind elementare Bestandteile von Signalwegen. Ihre Aktivität kann auf unterschiedlichste Weise reguliert werden.

(18)

1.2.1 Proteinkinasen

Die Phosphorylierung von Proteinen durch Kinasen ist ein wichtiger Mechanismus in der intrazellulären Signalweiterleitung und reguliert dadurch die verschiedensten zellulären Prozesse. Im menschlichen Genom finden sich circa 600 Gene, welche für Proteinkinasen kodieren, so dass diese Enzymgruppe alleine etwa 2,5 % aller Gene umfasst (Lander et al.

2001). Proteinkinasen werden hinsichtlich ihrer Substratspezifität in drei Familien eingeteilt:

 Serin-Threonin-Kinasen – verestern einen Phosphatrest mit der alkoholischen Gruppe von Serin- oder Threoninresten

 Tyrosinkinasen – erzeugen einen Phosphatester mit der phenolischen Hydroxyl (OH)- Gruppe von Tyrosinresten

 Bispezifische Kinasen – phosphorylieren sowohl Serin-/Threoninreste als auch Tyrosinreste (z. B. die Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase, kurz MAPKK oder MEK).

Sämtliche Proteinkinasen besitzen eine konservierte katalytische Domäne, welche für den Transfer des -Phosphats von Adenosintriphosphat (ATP) auf Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste des Substratproteins verantwortlich ist. Anhand von Homologiebetrachtungen lässt sich in allen Kinasefamilien ein circa 300 Aminosäuren langer hoch konservierter Abschnitt identifizieren. Im Gegensatz dazu sind die an den homologen Bereich angrenzenden N- und C-terminalen Abschnitte nicht konserviert und in den einzelnen Familien sehr unterschiedlich.

Alle Mitglieder der verschiedenen Kinasefamilien haben das gleiche Faltungsmuster wie die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) – eine Serin-Threonin-Kinase und die erste Kinase, die kristallisiert wurde (Knighton et al. 1991). Die katalytische Domäne ist in 12 hoch konservierte Subdomänen unterteilt und hat eine globuläre zweiflüglige Struktur, bestehend aus einem kleinen N-terminalen Flügel und einem größeren C-terminalen Flügel (Abb. 1.2.1).

Beide Flügel sind durch einen Peptidabschnitt, der wie ein Scharnier fungiert, verbunden. Der kleine N-terminale Flügel besteht aus einem fünfsträngigen antiparallelem -Faltblatt und (bei den meisten Kinasen) aus einer einzelnen -Helix, der so genannten C-Helix. Diese Nomenklatur ist begründet in der Struktur der PKA, deren N-terminaler Flügel drei -Helices enthält (A-, B- und C-Helix), wovon die C-Helix diejenige ist, welche in allen Proteinkinasen konserviert ist. Der große C-terminale Flügel ist hauptsächlich -helikaler Struktur und

(19)

Einleitung

verantwortlich für die Bindung des zu phosphorylierenden Peptidabschnittes sowie für die Phosphotransferreaktion.

Abb. 1.2.1 Struktureller Aufbau der katalytischen Domäne einer Proteinkinase. Repräsentative Bänderdarstellung einer katalytischen Kinasedomäne, basierend auf der Struktur der Insulinrezeptor- Tyrosinkinase. Der N-terminale Flügel ist in grün dargestellt, der C- terminale Flügel in lila. Die aktivierende Schleife ist gelb gefärbt.

Das Substratpeptid, welches mit der Aktivierungsschleife interagiert, ist schwarz dargestellt. Das mit dem N-terminalen Flügel assoziierende ATP-Analog ist rot-blau gefärbt. Die C-Helix (enthält für die Katalyse wichtige Aminosäurereste) und die G-Helix (beteiligt an der Substratbindung) sind durch Beschriftung gekennzeichnet.

Modifiziert aus (Pellicena and Kuriyan 2006).

Die Bindestelle für das Nukleotidsubstrat ATP befindet sich im N-terminalen Flügel. Durch die Bindung von ATP und Peptid kommen sich N- und C-terminaler Flügel räumlich näher und die Oberfläche beider Flügel formt ein aktives Zentrum. Die Hauptkomponenten dieses aktiven Zentrums sind die Phosphat-bindende Schleife (P-Schleife) des N-terminalen Flügels sowie die katalytische (C-) Schleife und die Aktivierungsschleife (A-), beides Bestandteile des C-terminalen Flügels (Knighton et al. 1991). Die Fixierung des ATP erfolgt über die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen der - und -Phosphatgruppe des ATP und den Aminosäureseitenketten der Glycin-reichen Sequenz der P-Schleife. Für die Phosphotransfer- Reaktion ist es wichtig, dass die drei Phosphatgruppen des ATP linear angeordnet sind – dies wird durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen Mg²⁺-Ionen und dem - sowie dem -Phosphat gewährleistet. Durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen einem konservierten Lysinrest des N-terminalen Flügels und dem - und -Phosphat des ATP werden die negativen Ladungen dieser Phosphatgruppen neutralisiert. Für die Übertragung der -Phosphatgruppe des ATP auf das Substratprotein ist die C-Schleife von entscheidender Bedeutung. Sie enthält zwei konservierte Aminosäurereste – einen Aspartatrest, essentiell für die Phosphotransfer-Reaktion, und einen basischen Aminosäurerest (Lysin oder Arginin), welcher die negative Ladung der -Phosphatgruppe neutralisiert und somit einen nukleophilen Angriff durch das Substratprotein ermöglicht (Abb. 1.2.2).

(20)

Abb. 1.2.2 Interaktionen zwischen dem katalytischen Teil der Proteinkinase, dem ATP und dem zu phosphorylierenden Substrat. (Aminosäurennummerierungen entsprechen der PKA) - Der rote Pfeil kennzeichnet den katalytischen Transfer des ATP-Phosphates auf die Hydroxylgruppe des Substratproteins. Für die Katalyse wichtige Aminosäurereste, die in Kontakt mit dem ATP oder Substrat stehen, sind gelb schraffiert. Sekundärstrukturen und Aminosäurereste, die an der Regulation der katalytischen Aktivität beteiligt sind, sind grau schattiert. Schwarze Doppelpfeile kennzeichnen hydrophobe Interaktionen. Die wichtigsten polaren Kontakte sind durch Punktlinien gekennzeichnet. Modifiziert aus (Kornev et al. 2006).

Die Phosphorylierung von Aminosäureseitenketten durch Proteinkinasen ist die am weitesten verbreitete posttranslationale Proteinmodifikation zum Zweck der intrazellulären Signalweiterleitung sowie der Regulation von Enzymaktivitäten. In eukaryotischen Zellen stellen die Serin-Threonin-Kinasen die evolutionär älteste Proteinkinasefamilie dar. Die Enzymklasse der Tyrosinkinasen entstand vermutlich erst nach Verbreitung von Phosphotyrosin erkennenden Proteindomänen, wie Phosphotyrosinbinde (PTB) oder Src homology 2 (SH2) Domänen bzw. deren Vorläufern (Lim and Pawson 2010). Diese regulatorisch bedeutsamen Proteinkinasen haben eine zentrale Funktion bei Wachstums- und Differenzierungsvorgängen und werden im nachfolgenden Kapitel näher beschrieben.

1.2.1.1 Proteintyrosinkinasen

Im humanen Genom finden sich circa 90 Gene, die für Proteintyrosinkinasen (PTKs) kodieren (Lim and Pawson 2010). Tyrosin-spezifische katalytische Domänen finden sich sowohl in Transmembranproteinen, den Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), als auch in zytoplasmatischen PTKs. Die RTKs sind integrale Membranproteine, welche auf der extrazellulären Seite eine Ligandenbindedomäne und auf der zytosolischen Seite eine Tyrosinkinase-Domäne besitzen.

Der Proteinabschnitt, welcher die Membran durchquert, ist -helikaler Struktur. Im zytoplasmatische Abschnitt weisen die RTKs neben der konservierten Tyrosinkinase Domäne noch weitere regulatorische Sequenzabschnitte auf, an denen Autophosphorylierung sowie Phosphorylierung durch andere Proteinkinasen stattfinden kann. Von den 90 humanen PTKs gehören 58 zur Familie der RTKs (Manning et al. 2002). Die meisten RTKs werden durch die Bindung eines spezifischen Proteinliganden (z. B. Wachstumsfaktoren und Cytokine) an den

(21)

Einleitung

extrazellulären Teil aktiviert. Die Bindung des Liganden bewirkt die Oligomerisierung mehrerer RTK-Moleküle, gefolgt von der Aktivierung der katalytischen Domäne im zytoplasmatischen Abschnitt des Rezeptors. Diese Aktivierung erfolgt durch Transphosphorylierung von Tyrosinresten in der Aktivierungs (A)-Schleife der katalytischen Domäne. Durch die aktivierte Kinase können zytoplasmatische Proteine in die Nähe des Rezeptors rekrutiert und phosphoryliert werden. Die phosphorylierten Tyrosinreste des Rezeptors bzw. der zytoplasmatischen Proteine sind Bindungsstellen für Proteine mit spezifischen Bindedomänen für Phosphotyrosine. Diese transienten phosphorylierungs- abhängigen Protein-Protein Interaktionen resultieren in der Ausbildung von Protein- komplexen und/oder Aktivierung von Enzymen (Kinasen, Phosphatasen, Lipasen etc.) und ermöglicht somit die Transduktion extrazellulärer Signale durch die Plasmamembran in die Zelle.

Im Gegensatz zu den RTKs besitzen die zytoplasmatischen PTKs keine Transmembrandomäne und liegen als lösliche intrazelluläre oder membranassoziierte Proteine vor. Diese zytoplasmatischen PTKs sind intrazelluläre Effektormoleküle, die während des Signalübertragungsprozesses mit spezifischen Substraten interagieren und diese durch Phosphorylierung von Tyrosinresten aktivieren, wodurch die Weitergabe des Signals gewährleistet wird. Viele Funktionen dieser zytoplasmatischen PTKs werden oft in unmittelbarer Nähe zur Zellmembran ausgeführt. Beispiele hierfür sind die Weiterleitung eines Signals von einem aktivierten membranständigen Rezeptor oder die Weitergabe eines Signals von einem membranassoziierten Protein. Aufgrund von Sequenzhomologien bzw.

phylogenetischer Analysen werden die 32 humanen zytoplasmatischen PTKs in zehn Unterfamilien (Abl, Ack, Csk, FAK, Fes, Frk, Jak, Src, Tec und Syk) eingeteilt (Robinson et al. 2000). Die verwandten Enzyme innerhalb einer Familie ähneln sich in ihrem Aufbau und ihrer Substratspezifität, zeigen allerdings oft unterschiedliche Aktivitäts- oder Expressions- muster.

1.2.1.1.1 Die Fokale Adhäsionskinase

Die Fokale Adhäsinonskinase (FAK) gehört zur Familie der zytoplasmatischen PTKs, lokalisiert an Integrin-reichen Fokalkontakten und ist durch eine starke Tyrosinphos- phorylierung gekennzeichnet (Hanks et al. 1992; Schaller et al. 1992). Als wichtiges Signalprotein ist sie an der Integrin- und Wachstumsfaktorrezeptor-vermittelten

(22)

Signalwege sind die zellulären Prozesse der Zellmigration (Cary et al. 1996; Hauck et al.

2001), Zelladhäsion (Frisch et al. 1996; Michael et al. 2009), Invasion (Hauck et al. 2001;

Chan et al. 2009), Proliferation (Gilmore and Romer 1996; Pirone et al. 2006) sowie Prozesse zur Verhinderung der Apoptose (Frisch et al. 1996; Kurenova et al. 2004; Garces et al. 2006).

Die FAK ist evolutionär stark konserviert und wird ubiquitär in fast jedem Zelltyp eines multizellulären Organismus, wie beispielsweise Mensch (Weiner et al. 1993), Maus (Hanks et al. 1992), Huhn (Schaller et al. 1992) oder Drosophila melanogaster (Palmer et al. 1999) exprimiert. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass in einer Vielzahl humaner Krebsarten, wie beispielsweise Brust- oder Darmkrebs, eine gesteigerte FAK-Aktivität bzw.

FAK-Expression nachweisbar war (Cance et al. 2000; Yu et al. 2006; Chatzizacharias et al.

2008).

Die FAK kann auf Grund von Sequenz- und Strukturanalysen in vier verschiedene Domänen unterteilt werden – eine N-terminale FERM (Band 4.1, Ezrin, Radixin und Moesin)- Homologie Domäne, eine zentral lokalisierte Kinasedomäne, drei Prolin-reiche Regionen (zwei in der C-terminalen Hälfte des Moleküls und eine in der N-terminalen Hälfte) und eine C-terminale focal adhesion targeting (FAT) Domäne (Abb. 1.2.3) (Schaller et al. 1992; Hanks et al. 2003; Mitra et al. 2005).

Abb. 1.2.3 Domänenstruktur und Phosphorylierungsstellen der Fokalen Adhäsionskinase. FAK beinhaltet eine FERM (Band 4.1, Ezrin, Radixin und Moesin)- Homologie Domäne, eine Kinasedomäne und eine FAT (focal adhesion targeting) Domäne. Die FERM-Homologie Domäne vermittelt Interaktionen mit dem EGF- und PDGF-Rezeptor, der ETK Tyrosinkinase und Ezrin. Weiterhin kann die FERM-Homologie Domäne über das Lysin K¹⁵²SUMO (small ubiquitin-related modifier)-yliert werden. Die FAT Domäne rekrutiert FAK zu den Fokalkontakten und bindet indirekt über Talin und Paxillin an Integrine. Außerdem ist diese Domäne für die verbesserte Aktivität von Rho-GTPasen verantwortlich, da sie GEFs wie p190RhoGEF bindet und deren GDP/GTP- Austauschaktivität erhöht. FAK beinhaltet drei Prolin-reiche Regionen (PRR1 – 3), an welche Proteine mit SH3 Domänen (z. B. p130Cas, GRAF, ASAP1) binden können. Phosphoylierbare (P) Tyrosinreste innerhalb der FAK-Struktur sind die Tyr³⁹⁷, Tyr⁴⁰⁷, Tyr⁵⁷⁶, Tyr⁵⁷⁷, Tyr⁸⁶¹ und Tyr⁹²⁵. Diese Phosphotyrosine (pTyr) dienen als Bindestellen für Proteine mit SH2 Domänen (pTyr³⁹⁷: Grb7, Shc, PLCγ, p85 der PI3K, Src, SOCS; pTyr⁹²⁵: Grb2). Die Phosphorylierung von Tyr⁵⁷⁶ und Tyr⁵⁷⁷ ist nötig für die maximale Aktivierung der FAK. Im Gegensatz dazu wird die FAK-Aktivität durch die Bindung des Proteins FIP200 (FAK-family interacting protein of 200 kDa) an die Kinasedomäne inhibiert. Modifiziert aus (Mitra et al. 2005).

Die N-terminale FERM-Homologie Domäne ist verantwortlich für die Interaktion von FAK mit Integrin- und Wachstumsfaktorrezeptoren. Auch wird vermutet, dass die FERM- Homologie Domäne eine Rolle bei der Regulation der Kinaseaktivität von FAK spielt.

(23)

Einleitung

Werden Zellen unter Bedingungen kultiviert, bei denen FAK in inaktiver Form vorliegt (z. B.

Nicht-Tumorzellen, die in Suspension gehalten werden), so interagiert die FERM-Homologie Domäne direkt mit der Kinasedomäne. Durch diese intramolekulare Interaktion wird die Autophosphorylierung des Tyr³⁹⁷ und somit die maximale FAK-Aktivierung inhibiert. In diesem Zusammenhang wird auf eine Funktion der FERM-Homologie Domäne als intramolekularer Inhibitor der FAK-Aktivität geschlossen (Cooper et al. 2003).

An die FERM Domäne schließt sich die zentral gelegene Kinasedomäne an. Die Kinasedomäne besitzt Sequenzähnlichkeiten mit anderen RTKs und zytoplasmatischen PTKs, allerdings gibt es auch strukturelle Unterschiede. So zeigt die Kristallstruktur der FAK Kinasedomäne eine charakteristische Disulfidbrücke im N-terminalen Flügel. Diese Disulfidbrücke ist eher ungewöhnlich für Kinasen, aus diesem Grund wird vermutet, dass sie wahrscheinlich einen Einfluss auf die FAK-Aktivität hat (Nowakowski et al. 2002). Auch die für die FAK-Aktivität wichtige Autophosphorylierungsstelle Tyr³⁹⁷ befindet sich in der Kinasedomäne. In Folge von Integrin-Aktivierung kommt es zur Autophosphorylierung des Tyr³⁹⁷, welches dann als Bindestelle für die SH2 Domäne der Src-Kinase fungiert (Hanks et al. 1992; Ruest et al. 2000). Die Bindung von Src an FAK resultiert in einer gesteigerten Src- Aktivität, was zu einer Src-vermittelten Phosphorylierung von Tyr⁵⁷⁶ und Tyr⁵⁷⁷ innerhalb der FAK-Kinasedomäne führt. Diese Phosphorylierungen sind essentiell für eine maximale Aktivität der FAK (Ruest et al. 2000). Zusätzlich zur Phosphorylierung der FAK-Tyrosinreste Tyr⁵⁷⁶ und Tyr⁵⁷⁷ kann Src noch weitere Tyrosinreste innerhalb des Moleküls phosphorylieren. Diese Phosphotyrosine dienen dann als Bindestellen für Proteine mit SH2 Domänen (Hanks et al. 2003; Parsons 2003). Weitere von Src phosphorylierte Tyrosine sind Tyr⁴⁰⁷, Tyr⁸⁶¹ und Tyr⁹²⁵. Die meisten SH2 Domänen-abhängigen Interaktionen von FAK mit anderen Proteinen sind bisher nur für die Autophosphorylierungsstelle Tyr³⁹⁷ bekannt. SH2 Domänen enthaltende Proteine, die mit diesem Phosphotyrosin interagieren, sind z. B. Src, das Adapterprotein Shc, die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die Phospholipase C (PLC)-, das Adapterprotein Grb7 (Cox et al. 2006) und das Adapterprotein Nck2 (Goicoechea et al. 2002). Die ebenfalls von Src vermittelte Phosphorylierung des Tyr⁹²⁵ in FAK bietet eine Bindestelle für die SH2 Domäne des Adapterproteins Grb2, wodurch eine Verbindung zum ERK/MAP-Kinase Signalweg hergestellt wird (Schlaepfer et al. 1999). Die C-terminale Region von FAK beinhaltet zwei Prolin-reiche Abschnitte (Aminosäuren 712–

723 und 867–882), welche als Bindestelle für Proteine mit Src Homologie 3 (SH3) Domänen fungieren. FAK Interaktionspartner mit SH3 Domänen sind das Adapterprotein p130Cas

(24)

(Ruest et al. 2001), das Rho GTPase-aktivierende Protein (GAP) GRAF oder das Arf GAP ASAP1 (Taylor et al. 1999; Randazzo et al. 2000). Die C-terminal lokalisierte FAT Domäne enthält Bindestellen für die zytoskeletalen Proteine Talin und Paxillin, welche an der Rekrutierung von FAK in die Fokalkontakte beteiligt sind. In den Fokalkontakten sind Talin, Paxillin und FAK zusammen verantwortlich für die Verknüpfung der Integrine mit dem Zytoskelett (Parsons 2003). Ein weiteres Protein, welches mit der FAT Domäne von FAK interagiert, ist der RhoA-spezifische GDP/GTP Austauschfaktor p190RhoGEF. Die Interaktion von FAK und p190RhoGEF fördert die Phosphorylierung von p190RhoGEF und hat eine erhöhte RhoA Aktivität zur Folge (Zhai et al. 2003).

1.2.1.1.2 Die Familie der Src-Kinasen

Mit acht Mitgliedern (Fgr, Fyn, Src, Yes, Blk, Hck, Lck und Lyn) ist die Familie der Src- Kinasen die größte Unterfamilie innerhalb der zytoplasmatischen PTKs (Robinson et al.

2000). Diese Kinasen besitzen eine konservierte Domänenstruktur, welche sich aus einem N- terminalen Sequenzmotiv für die Membranlokalisation, einer Src Homologie 3 (SH3) Domäne, einer Src Homologie 2 (SH2) Domäne, einer Kinasedomäne und einem C- terminalen regulatorischen Domäne zusammensetzt (Abb. 1.2.4).

Abb. 1.2.4 Domänenanordnung und dreidimensionale Sturktur der Src-Kinasen. Die Kinasedomäne enthält wichtige regulatorische phosphorylierbare Tyrosinreste. Diese befinden sich in der aktivierenden Schleife (Tyr⁴¹⁶ in Src) und am C- terminalen Ende (Tyr⁵²⁷ in Src). Die Röntgenstruktur von Src in der inaktiven Konformation zeigt, dass das phosphorylierte Tyr⁵²⁷ des C-terminalen Endes mit der SH2 Domäne interagiert und dass die SH2-Kinase-Verbinungsregion in die SH3 Domäne bindet. Modifiziert aus (Bradshaw 2010).

Die Aktivität der Src-Kinasen wird durch eine Vielzahl von Mechanismen reguliert.

Beispielsweise wird die Inaktivierung der Kinaseaktivität durch mehrere intramolekulare Interaktionen gewährleistet. So kommt es nach Phosphorylierung des Tyrosinrests Tyr⁵²⁷ (durch die C-terminale Src Kinase, Csk) zur intramolekularen Interaktion der SH2 Domäne mit dem pTyr⁵²⁷, wodurch die Kinase in einer inaktiven Konformation gehalten wird. Des Weiteren führt auch die intramolekulare Interaktion zwischen SH3 Domäne und der Prolin-

(25)

Einleitung

reichen Sequenz in der Verbindungssequenz von SH2 und Kinase Domäne zu einer Proteinkonformation, in der die Kinaseaktivität inhibiert ist. Werden diese intramolekularen Interaktionen aufgehoben, kommt es zu einem Anstieg in der Kinaseaktivität. Die Bindung der SH3 Domäne an die Prolin-reiche Sequenz eines anderen Proteins (Moarefi et al. 1997), die Dephosphorylierung des Tyr⁵²⁷ und die damit verbundene Aufhebung der SH2-pTyr⁵²⁷ Interaktion (Roskoski 2004) sowie die Phosphorylierung des Tyrosinrestes Tyr⁴¹⁹ in der Aktivierungs (A)-Schleife der Kinasedomäne (Cooper and Howell 1993) führt zu einer stufenweisen Erhöhung der Kinaseaktivität (Abb. 1.2.5). Durch Einzeluntersuchung dieser Aktivierungsschritte konnte gezeigt werden, dass für eine vollständige Aktivierung der Kinase alle diese Stimuli vorhanden sein müssen (Moarefi et al. 1997).

Abb. 1.2.5 Modell der gestaffelten Aktivierung von Src-Kinasen. Für die vollständige Aktivierung der Src- Kinasen sind verschiedene aufeinander folgende Schritte nötig (von links nach rechts): Dephosphorylierung des C-terminalen Endes durch Protein-Tyrosin-Phosphatase (PPtase), Phosphorylierung der Aktivierungsschleife, Bindung eines Liganden in die SH2 Domäne und Bindung eines Liganden in die SH3 Domäne. Jeder einzelne dieser Schritte führt zu einer höheren Ebene der Src-Kinaseaktivität. Modifiziert aus (Bradshaw 2010).

Die Src-Kinasen sind durch einen N-terminalen Myristinsäurerest in der Plasmamembran verankert und können somit auch als katalytische Untereinheit für Transmembranrezeptoren fungieren, die selbst keine eigene Kinasedomäne besitzen. Diese rezeptorassoziierten PTKs werden in gleicher Weise wie die RTKs durch Liganden-induzierte Oligomerisierung oder Konformationsänderung der Rezeptoren aktiviert. Vor allem in Signalwegen des Immunsystems spielen solche rezeptorassoziierten PTKs eine wichtige Rolle. So ist beispielsweise die Src-Kinase Lyn an Signaltransduktionsprozessen des B-Zellrezeptors beteiligt (Gauld and Cambier 2004) während Lck und Fyn wichtige Src-Kinasen des T- Zellrezeptor vermittelten Signalweges sind (Palacios and Weiss 2004). Auch bei der Rezeptor-vermittelten Phagozytose durch CEACAM3 (siehe Kapitel 1.3.2.1) spielen Src-

(26)

Kinasen eine wichtige Rolle, indem sie Tyrosinreste in der ITAM-ähnlichen Sequenz des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM3 phosphorylieren und somit die Signalkaskade für die Aufnahme pathogener Bakterien initiieren (Schmitter et al. 2007b).

1.2.2 Tyrosinphosphorylierung von Proteinen

Die Phosphorylierung von Proteinen ermöglicht eine robuste Signalgebung und Signalweiterleitung und ist somit maßgeblich an der Ausbildung und Aufrechterhaltung wichtiger zellulärer Prozesse beteiligt. Zum einen dienen die phosphorylierten Aminosäurereste von Proteinen als Bindestelle für andere Proteine mit spezifischen Interaktionsdomänen. Zum anderen kann aber auch die Aktivität von Enzymen durch Phosphorylierung reguliert werden (Krebs and Beavo 1979). Der Übertrag eines Phosphat- restes auf ein Protein verändert signifikant dessen Ladung und Struktur, so dass das Signal leicht erkannt und verarbeitet werden kann. Die Veresterung eines energiereichen Phosphates und eines Alkohols ist zudem eine leicht ablaufende Reaktion und bildet eine robuste, aber reversible Bindung.

Während die Phosphorylierung von Proteinen an Serin- und Threoninresten bereits in den 1950er Jahren als regulierender, physiologischer Mechanismus entdeckt wurde (Fischer and Krebs 1955), dauerte es noch weitere 25 Jahre, bis auch die Phosphorylierung von Tyrosinresten als eine wichtige posttranslationale Modifikation von Proteinen identifiziert wurde (Eckhart et al. 1979). Der Hauptgrund, warum tyrosinphosphorylierte Protein erst so spät entdeckt wurden, ist vermutlich damit zu begründen, dass die Menge von tyrosinphosphorylierten Proteinen nur einen sehr geringen Anteil an der Gesamtmenge der zellulären Phosphoproteine ausmacht. In einer menschlichen Zelle entspricht der Anteil an Serin- und Threoninphosphorylierungen circa 86,4 % und 11,8 %, wohingegen der Anteil an Tyrosinphosphorylierungen lediglich 1,8 % beträgt (Olsen et al. 2006). Genau wie die zeitlichen Unterschiede bei der Entdeckung von Serin-Threonin- und Tyrosin- phosphorylierungen gab es auch Unterschiede bei der zeitlichen Entstehung dieser posttranslationalen Modifikationen. Ursprünglich wurden Serin- und Threoninreste durch Phosphorylierung ihrer freien Hydroxylgruppe modifiziert. Diese Art der Phosphorylierung findet sich bereits in den primitivsten Organismen (Prokaryoten). Erst später entstand die Phosphorylierung von Tyrosinresten, zunächst durch ungerichtete Enzymaktivität von Serin- Threonin-Kinasen (Lim and Pawson 2010). Zu diesem Zeitpunkt konnten die Tyrosin- phosphorylierung bereits durch Phosphatasen beseitigt werden, da sie auf dieser Stufe noch

(27)

Einleitung

keinen signalgebenden Effekt entfalten konnte. Erst durch die Entstehung spezifischer pTyr Bindedomänen (z. B. SH2 und PTB Domänen) wurde die Tyrosinphosphorylierung zu einem nützlichen Werkzeug der Signalweiterleitung. Die rasante Entstehung und Radiation der PTKs lässt darauf schließen, dass die Tyrosinphosphorylierung bzw. ihre Nutzung als Signal ein durchschlagender Erfolg war.

1.2.3 SH2 Domänen – wichtige Interaktionsdomänen in der zellulären Signalweiterleitung

Die Interaktion von Signalproteinen mit einem Phosphotyrosinprotein ist abhängig von ganz bestimmten Interaktionsdomänen, welche spezifisch phosphorylierte Tyrosinreste erkennen.

Diese speziellen Bindedomänen sind die so genannten SH2 und Phosphotyrosinbinde (PTB) Domänen. Während die PTB Domänen auch auch konstitutiv und mit hoher Affinität an ihre unphosphorylierten Zielproteine binden, sind die auf SH2 Domänen basierenden Protein- Protein Interaktionen von Tyrosinphosphorylierungsprozessen abhängig (Schlessinger and Lemmon 2003). Die Abkürzung SH2 steht für Src Homologie 2 und ist abgeleitet von der membranassoziierten PTK Src, welche in mutierter Form als Onkoprotein im Sarkomavirus des Huhnes gefunden wurde. Diese Src-Kinase besitzt bestimmte Aminosäuresequenzen, welche in homologer Form auch in vielen anderen Signaltransduktionsproteinen gefunden wurde. Diese homologen Src Domänen sind:

 SH1, eine Domäne, welche die Kinasedomäne von Src umfasst

 SH2, eine Protein-Protein Interaktionsdomäne, welche mit Aminosäuresequenzen interagiert, die einen phosphorylierten Tyrosinrest besitzen

 SH3, eine Protein-Protein Interaktionsdomäne, die mit Prolin-reichen Sequenzen der Abfolge -Pro-X-X-Pro- interagieren.

Während mittlerweile über 200 verschiedene SH3 Domänen identifiziert werden konnten, sind bisher nur knapp über 100 verschiedene SH2 Domänen bekannt.

SH2 Domänen sind kompakte, circa 100 Aminosäuren umfassende, regulatorische Protein- Protein Interaktionsmodule der intrazellulären Signaltransduktionskette. Sie binden mit hoher Selektivität und Affinität an phosphorylierte Tyrosinreste in Proteinen und steuern dadurch die transiente und selektive Assoziation von intrazellulären Signalkomplexen in mehrzelligen Lebewesen (Pawson et al. 2001). Die Spezifität von SH2 Domänen wird nicht nur durch den

(28)

phosphorylierten Tyrosinrest bestimmt, sondern auch durch den Aminosäurekontext welcher das Phosphotyrosin umgibt. Somit erkennen SH2 Domänen in der Regel nur ein begrenztes Spektrum an Phosphotyrosin-modifizierten Proteinen (Bradshaw and Waksman 2002).

1.2.3.1 Struktur und Bindungseigenschaften von SH2 Domänen

Alle SH2 Domänen bestehen aus einem großen zentralen antiparallelen β-Faltblatt (bestehend aus drei bis vier β-Strängen), welches von zwei kurzen α-Helices flankiert wird. Der strukturelle Aufbau folgt dem Muster β-α-β-β-β-β-β-α-β (Abb. 1.2.6).

Abb. 1.2.6 Struktureller Aufbau der Src-Kinase SH2 Domäne. Strukturen von acht verschiedenen SH2- Phosphopeptide-Komplexen, dargestellt als Überlagerung (mittels Programm „O“). Der für die Überlagerung verwendete Referenzpunkt war die Region vom Anfang des βA-Strangs bis zum Ende des αA-Strangs. Die verwendeten Strukturen waren die SH2 Domänen von Src, Lck, C-terminale p85 SH2 (PI3KR1-C), C-terminale PLC1 SH2 (PLCG1-C), Fyn, Grb2, SAP, N-terminale SH2 von Syp. Modifiziert aus (Schlessinger and Lemmon 2003).

Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeiten aller SH2 Domänen wurde eine allgemeine Nomenklatur zur Kennzeichnung der β-Stränge und α-Helices eingeführt (Eck et al. 1993).

Die β-Stränge werden mit βA bis βG gekennzeichnet, die α-Helices mit αA und αB. Der phosphorylierte Tyrosinrest bindet in eine konservierte, positiv geladene Bindetasche auf der SH2 Domäne. Durch Größe/Tiefe und Struktur ist diese Bindetasche für kürzere Seitenketten, wie Phosphoserine und –threonine, nicht zugänglich, wodurch die Spezifität der SH2 Domäne für phosphorylierte Tyrosine gewährleistet wird (Waksman et al. 1992; Lee et al. 1994). Die Interaktion zwischen Phosphotyrosin und SH2 Bindetasche wird durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen dem Phosphatrest und dem invariablen Arginin im βB-Strang des zentralen β-Faltblattes hergestellt. Gleichzeitig vermitteln die Schleifen zwischen βE und βF (EF) sowie zwischen αB und βG (BG) die Interaktion mit spezifischen Aminosäure- sequenzen, die zwei bis sechs Reste C-terminal vom Phosphotyrosin liegen. Aufgrund der individuellen Aminosäureabfolge verschiedener SH2 Domänen wird somit die Erkennung unterschiedlicher Phosphotyrosinsequenzen ermöglicht. Dadurch wird eine hohe Bindespezifität von verschiedenen SH2 Domänen für unterschiedliche Phosphotyrosin- sequenzen gewährleistet (Shoelson 1997; Pawson et al. 2001). So bindet zum Beispiel die

(29)

Einleitung

SH2 Domäne der Src-Kinase bevorzugt an ein Sequenzmotiv mit geladenen Aminosäureresten an den Positionen +1 und +2 und einem hydrophoben Rest an Position +3 C-terminal vom Phosphotyrosin (pYEEI) (Kuriyan and Cowburn 1997; Shoelson 1997;

Pawson et al. 2001). Im Gegensatz dazu interagieren die beiden SH2 Domänen der Phospholipase Cγ mit aliphatischen Resten an den Positionen +1 bis +5 C-terminal des Phosphotyrosins (Pascal et al. 1994).

Zusätzlich zur Bindungsspezifität ist das Sequenzmotiv, C-terminal vom Phosphotyrosin, auch für die Bindungsaffinität der SH2 Domäne mit der Phosphotyrosinsequenz verantwortlich. Individuelle SH2 Domänen binden ihre spezifischen Sequenzmotive typischerweise mit einer Dissoziationskonstante im Bereich von 0,2 bis 1µM (Domchek et al.

1992; Piccione et al. 1993; Case et al. 1994; Ladbury et al. 1995). Im Gegensatz dazu weisen SH2 Domänen eine 20- bis 50-fach niedrigere Affinität zu rein zufällig gewählten tyrosinphosphorylierten Sequenzmotiven auf (Shoelson 1997; Maina et al. 2001). Ergänzend dazu zeigten Ottinger et al., dass Proteine mit zwei SH2 Domänen in Folge (Tandem) eine stark erhöhte Bindungsaffinität und –spezifität zu ihren zweifach tyrosinphosphorylierten Bindungspartnern haben (Kd = 0,5–3 nM), verglichen mit einfachen Interaktionen (Kd = 0,2–1 µM). So binden zum Beispiel die Tandem SH2 Domänen der ZAP-70 PTK sehr viel stärker an das spezifische Sequenzmotiv pYxxLx6-8pYxxL der ε- und ζ-Ketten des T- Zell-Rezeptors als die untersuchten Einzel-SH2 Domänen (Ottinger et al. 1998).

1.2.3.2 Proteinfamilien mit SH2 Domänen

Es gibt sehr viele verschiedene Proteinfamilien mit SH2 Domänen, die an den unter- schiedlichsten zellulären Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind (Abb. 1.2.7). Im Fol- genden sollen einige dieser Familien näher beschrieben werden.

Enzyme

Viele verschiedene Enzyme (z. B. Kinase, Phosphatasen, Phospholipasen) besitzen eine oder zwei SH2 Domänen. Zusätzlich dazu weisen diese Proteine meist auch noch andere Protein- Protein oder Protein-Lipid Interaktionsdomänen, wie z. B. SH3 oder Pleckstrin homology (PH) Domänen, auf. Bekannte Vertreter hierfür sind Proteintyrosinkinasen (z. B. Src, Btk, ZAP-70), Proteintyrosinphosphatasen (z. B. PTPN6/Shp-1 und PTPN11/Shp-2), die Phospholipase-Cγ (PLC-γ) und das Ras-GTPase aktivierende Protein (RASA1/p120GAP). So führt zum Beispiel die Bindung der PLC-γ SH2 Domäne an den autophosphorylierten EGF-

(30)

oder FGF-Rezeptor zur Translokation der PLC-γ an die Plasmamembran. Die räumliche Nähe der Phospholipase zu ihrem Substrat, dem Membranbestandteil Phosphatidylinositol-4,5- bisphosphat (PI(4,5)P2) ermöglicht somit die Synthese der second messenger Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3).

Abb. 1.2.7 Proteinfamilien mit SH2 Domänen. Klassifizierung und Domänenanordnung der 110 humanen SH2 Domänen besitzenden Proteine. Modifiziert aus (Liu et al. 2006).

(31)

Einleitung

Im Bezug auf die FGF-abhängige Aktivierung der PLC-γ und die damit verbundene second messenger Produktion konnten Mohammadi et al. zeigen, dass dafür die Interaktion der PLC-γ SH2 Domäne mit dem phosphorylierten Tyr⁷⁶⁶ des FGF-Rezeptors unabdingbar ist (Mohammadi et al. 1992).

In der Proteinfamilie der Kinasen sorgen die SH2 Domänen oft auch für intramolekulare autoinhibitorische Interaktionen und kontrollieren dadurch die enzymatische Aktivität dieser Proteine (Hubbard et al. 1998). Ein Beispiel dafür stellt die membranassoziierte PTK Src dar.

Sowohl durch die SH2 als auch durch die SH3 Domäne wird die Src-Kinase in einer inaktiven autoinhibierten Konfiguration gehalten. Dabei bindet die SH2 Domäne an den phosphorylierten Tyr⁵²⁷-Rest im C-terminalen Abschnitt der Kinase. Gleichzeitig interagiert auch die SH3 Domäne mit dem PxxP-Motiv in der Verbindungsregion zwischen SH2 Domäne und Kinasedomäne (Sicheri et al. 1997; Xu et al. 1997). Durch diese intramolekularen Interaktionen und den damit verbundenen Konformationsänderungen sind die SH2 und SH3 Domänen sowohl für die Unterdrückung der Kinaseaktivität als auch für das Fernhalten dieser Interaktionsdomänen von exogenen Bindepartnern verantwortlich. Diese autoinhibierende Konformation kann durch verschiedene Mechanismen aufgebrochen werden, wodurch die Src-Kinase wieder aktiv wird. Diese Mechanismen sind die Dephosphorylierung des Tyr⁵²⁷ durch Tyrosinphosphatasen, sowie die Bindung von zellulären Proteinen, mit höherer Affinität für die SH2 und SH3 Domänen. Letzteres hat somit auch zur Folge, dass die Kinase in die Nähe ihres Substrats rekrutiert wird (Nakamoto et al. 1996;

Schaller et al. 1999).

Adapterproteine

Eine weitere Proteinfamilie bilden, die so genannten Adapterproteine (z. B. Grb2, Nck und Crk). Sie bestehen aus einer einzelnen SH2 Domäne sowie mehreren SH3 Domänen und besitzen keinerlei intrinsische enzymatische Aktivität. Mitglieder dieser Proteinfamilie nutzen ihre SH2 und SH3 Domänen für die Ausbildung von Signalproteinkomplexen, welche die Weiterleitung eines Signals innerhalb der Zelle ermöglichen. Die Entstehung solcher Signalproteinkomplexe ist oft die Folge einer aktivierten Tyrosinkinaseaktivtät, welche durch extrazelluläre Stimuli induziert wird (Schlessinger and Ullrich 1992; Kuriyan and Cowburn 1997; Shoelson 1997; Pawson et al. 2001). Die Adapterproteine binden über ihre SH2 Domäne an tyrosinphosphorylierte Proteine und interagieren über ihre SH3 Domänen mit Prolin-reichen Sequenzen in nachgeschalteten Effektorproteinen. Ein Beispiel dafür ist das