Zielsetzungen - Entwicklung und Anwendung eines SH2 Domänen Arrays zur Identifikation von Phosp

1 E INLEITUNG

1.4 Zielsetzungen

Um die temporäre, reversible und dynamische Regulation unterschiedlichster zellulärer Signalwege zu gewährleisten, sind verschiedenste Protein-Protein Interaktionen erforderlich.

Viele an intrazellulären Signalprozessen beteiligte Proteine besitzen kleine Domänen, durch welche sie konstitutiv und/oder signalreguliert mit anderen Proteinen assoziieren. Eine sehr effiziente und gut regulierbare Form der Protein-Protein Interaktion beruht auf der transienten Tyrosinphosphorylierung von Proteinen. Um die Vielzahl an zellulären Signalwegen und ihre Vernetzung untereinander verstehen zu können, ist die Identifizierung und Charakterisierung Phosphotyrosin-abhängiger Protein-Protein Interaktionen unerlässlich.

Etablierung einer Methode zur schnellen und parallelen Analyse Phosphotyrosin-abhängiger Protein-Protein Interaktionen

Aufgrund des hohen Zeit- und Arbeitsaufwand erlauben die bisherigen biochemischen Methoden (pull down Experimente und Koimmunpräzipitation) zur Identifikation von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen nur die Betrachtung relativ kleiner Gruppen von möglichen Interaktionspartnern. Die Etablierung eines Protein Arrays, auf der Basis von immobilisierten SH2 Domänen, würde die parallele Untersuchung großer Gruppen von Interaktionspartnern erlauben. Unter Zuhilfenahme eines kontaktlosen Mikroarray-Druckers und eines Sets ausgewählter SH2 Domänen sollten die optimalen Immobilisierungs-, Blockierungs- und Beprobungsbedingungen für einen solchen Protein Array etabliert werden. Verschiedene Detektionsmodi wurden zur Demonstration der Stabilität und flexiblen Verwendbarkeit eingesetzt.

Charakterisierung neu identifizierter SH2 Domänen-abhängiger Protein-Protein Interaktionen für CEACAM3

Mittels des zuvor etablierten SH2 Domänen Arrays wurden die SH2 Domänen der Lipidkinase PI3K und des Gerüstproteins Grb14 als Interaktionspartner von CEACAM3 identifiziert. Diese Interaktionen sollten mit herkömmlichen Methoden verifiziert werden.

Biochemische, mikroskopische und funktionelle Untersuchungen sollten die Rolle dieser Signalproteine im CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess klären.

Zielsetzungen

Welche Phosphotyrosin-abhängigen Interaktionen finden am zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 statt und welche Rolle spielen sie in der Funktion dieses Rezeptors?

Der anfangs etablierte SH2 Domänen Array bietet die Möglichkeit, viele SH2 Domänen parallel auf ihre Interaktionen mit einem definierten Phosphotyrosinprotein zu untersuchen.

Für CEACAM4 wurde bisher noch kein natürlicher Ligand beschrieben, jedoch besitzt CEACAM4 eine ITAM-ähnliche Sequenz, die als Vorfahre der entsprechenden CEACAM3 Signalsequenz gilt. CEACAM4 wurde daher auf seine Funktionsfähigkeit als phagozytischer Rezeptor untersucht. Da kein natürlicher Ligand für die Igv-ähnliche Domäne von CEACAM4 bekannt ist, wurde eine Chimäre aus der Igv-ähnlichen Domäne von CEACAM3 und dem Transmembran- und zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM4 verwendet, um mit gut etablierten Liganden die Aktivität der signalgebenden Bestandteile von CEACAM4 untersuchen zu können. Eine initiale Analyse der Bindungspartner des zytoplasmatischen Abschnitts von CEACAM4 sollte erste Einblicke in Parallelen und Abweichung der beiden Moleküle geben. Infektionsexperimente mit mikroskopischer Analyse sowie Betrachtung der Phagozytoserate sollten die funktionelle Relevanz der gefundenen Interaktionen untersuchen.

2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

2.1 Einleitung

Die Phosphorylierung von Tyrosinresten ist eine Form der posttranslationalen Modifikation von Proteinen in mehrzelligen Lebewesen. Dieser Vorgang wird von spezifischen Proteintyrosinkinasen (PTKs) bewerkstelligt und ist von entscheidender Bedeutung bei der intrazellulären Signalweiterleitung. Die reversible Phosphorylierung von Tyrosinresten reguliert wesentliche zelluläre Prozesse wie Genexpression, Differenzierung, Proliferation und Überleben. Da eine Phosphatgruppe eine stark negative Ladung besitzt, hat die Tyrosinphosphorylierung eines Proteins oft auch Konformationsänderungen der Proteinstruktur zur Folge. Abhängig von seinem Phosphorylierungsstatus kann ein Protein somit in zwei möglicherweise funktionell verschiedenen Formen vorliegen. Dies ist beispielsweise bei der Aktivitätsregulierung von Enzymen von entscheidender Bedeutung, die durch Tyrosinphosphorylierungen, je nach Einzelfall, aktiviert oder inaktiviert werden. Eine weitere Form der Steuerung zellulärer Abläufe durch Tyrosinphosphorylierungen besteht darin, dass die resultierenden Phosphotyrosine (pTyr) als Bindestelle für spezielle Interaktionsdomänen dienen. Diese Phosphotyrosin-Interaktionsdomänen sind die sogenannten Src homology 2 (SH2) und Phosphotyrosinbinde (PTB) Domänen. Ursprünglich wurden diese beiden Domänen als Protein-Protein Interaktionsmodule identifiziert, die phosphorylierte Tyrosinreste in Rezeptortyrosinkinasen und andern Signalproteinen erkennen und binden. Im Laufe der Zeit zeigten Studien, dass die SH2-abhängigen Protein-Protein Interaktionen sehr streng durch Tyrosinphosphorylierungsprozesse reguliert werden, während die meisten PTB Domänen auch konstitutiv und mit hoher Affinität an ihre unphosphorylierten Zielproteine binden (Schlessinger and Lemmon 2003). Viele wichtige zelluläre Signalproteine, wie beispielsweise Adapter- und Gerüstproteine, Guaninnukleotid-Austauschfaktoren oder Kinasen und Phosphatasen besitzen SH2 Domänen, durch welche sie phosphorylierungsabhängig an andere Proteine rekrutiert oder untereinander vernetzt werden können. Die daraufhin folgende Assemblierung von Proteinkomplexen ermöglicht die Weiterleitung von Signalen innerhalb der Zelle (Pawson et al. 2001). Im menschlichen Genom sind insgesamt 115 verschiedene SH2 Domänen kodiert. Diese Proteindomänen bestehen aus ca. 100 Aminosäuren und erkennen pTyr-Reste innerhalb einer spezifischen

Protein-Protein Interaktionen

Konsensussequenz, die ca. 3-6 AS um den pTyr-Rest umfasst (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/do_annotation.pl?DOMAIN=SH2).

Die Analyse der Tyrosinphosphorylierung von Proteinen und der daraus resultierenden Protein-Protein Interaktionen beruht gegenwärtig vor allem auf der Untersuchung individueller Proteine mittels konventioneller Techniken wie Koimmunpräzipitation, GST-pull-down und nachgeschalteter Analyse mittels Western Blot. Diese Techniken stellen sehr gute Methoden dar, sind jedoch sehr zeitintensiv und können nicht in großem Maßstab angewandt werden. Ein anderer Weg, um gezielt spezifische pTyr-abhängige Protein-Protein Interaktionen zu identifizieren, besteht in der Verwendung von immobilisierten SH2 Domänen als Affinitätsmatrix. In diesem Zusammenhang stellt ein Proteindomänen Array eine viel versprechende Alternative zu den Präzipitationsmethoden dar. Es wurden bereits funktionale Protein Arrays auf der Basis von isolierten SH2 Domänen hergestellt und zur Bestimmung der Bindungskonstanten von pTyr-modifizierten ErbB-Rezeptor Peptiden eingesetzt (Jones et al. 2006).

Als methodische Weiterentwicklung der bereits existierenden Ansätze wurde in der vorliegenden Arbeit ein Proteindomänen Array entwickelt, der es ermöglicht, bisher unbekannte pTyr-abhängige Protein-Protein Interaktionen zu analysieren. Zur Etablierung dieser Methode wurden die gut charakterisierten Interaktionen zwischen verschiedenen humanen SH2 Domänen und dem humanen Oberflächenrezeptor CEACAM3 sowie der zytoplasmatischen Fokalen Adhäsionskinase (FAK) benutzt.

2.2 Ergebnisse

2.2.1 Immobilisierung von rekombinanten SH2 Domänen auf einer aldehydbeschichteten Trägermatrix

Als Trägermatrix zur Immobilisierung der SH2 Domänen in punktförmigen Mustern (Spots) wurden aldehydbeschichtete Glasobjektträger (Aldehydslides) verwendet. Die Aldehydoberflächen stellten sich wegen ihrer leichten Handhabung im Hinblick auf die Immobilisierung als am geeignetsten heraus. Als Alternativen wurden zuvor noch die nicht-kovalente Immobilisierung der Proteine auf Nickel-beschichtete Oberflächen und Aminosilanoberflächen getestet. Allerdings erfolgt die nicht-kovalente Bindung eines Proteins auf einer Aminosilanoberflächen lediglich durch elektrostatische Wechselwirkungen

2 SH2 Domänen Arrays - eine Methode zur Identifizierung von Phosphotyrosin-abhängigen Protein-Protein Interaktionen

zwischen den Aminosilan-Seitenketten der Oberfläche und negativ geladenen Aminosäureseitenketten (z. B. Aspartat oder Glutamat). Im Vergleich zur kovalenten Bindung der Proteine auf den aldehydbeschichteten Oberflächen immobilisierte eine wesentlich geringere Menge Protein auf der Aminosilanoberfläche. Gegen die Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen sprachen zwei Gründe. Erstens, die SH2 Domänen mussten als 6-fach Histidin-markierte (His6)-Proteine exprimiert und aufgereinigt werden. Dies war nur sehr bedingt möglich, da durch die Expression in E. coli alle His6-SH2 Domänen unlöslich waren und unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt werden mussten. Dadurch konnte die Funktionalität der SH2 Domänen nicht mehr gewährleistet werden. Der zweite Grund, der gegen die Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen sprach, war (genau wie bei den Aminosilanoberflächen) die nicht-kovalente Bindung zwischen Protein und Oberfläche. Auch bei der Verwendung von Nickel-beschichteten Oberflächen war es nicht möglich, eine ausreichende Menge an immobilisiertem Protein nachzuweisen. Im Gegensatz zu den Aminosilan- und Nickeloberflächen ist die Bindung von Proteinen an eine Aldehydoberfläche kovalenter Natur und erfolgt über die reaktiven Aldehyd-Gruppen (R-CH=O) der Oberfläche mit primären Aminen (R-NH2) des Proteins. Durch nukleophile Addition primärer Amine kommt es, unter Abspaltung von Wasser (Kondensation), zur Ausbildung kovalenter C=N Doppelbindungen, welche als ‚Schiff’sche Basen’ bezeichnet werden.

Aus Gründen der besseren Löslichkeit wurden die zur Etablierung des Arrays verwendeten SH2 Domänen in Form von GST-Fusionsproteinen (GST-SH2) in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatografie über eine GSH-Sepharose-Säule aufgereinigt. Die Funktionalität der gereinigten GST-SH2 Domänen wurde mittels pull-down Experimenten (Abb. 2.2.1) überprüft. Hierzu wurden die bereits bekannten pTyr-abhängigen Interaktionen des Membranproteins CEACAM3 mit verschiedenen Mitgliedern aus der Familie der Src-Kinase verifiziert (vgl. auch (Schmitter et al. 2007b)). Das Aufbringen der GST-SH2 Domänen auf die Aldehydoberfläche erfolgte mittels eines kontaktlosen Mikroarray-Druckers (Nano-Plotter 2.1, Fa. GeSim). Als Puffer für die Immobilisierung wurde PBS mit 10 % Glycerin verwendet, da auch bereits die gereinigten GST-SH2 Domänen gegen diesen Puffer dialysiert und bei –80 °C gelagert worden waren. Das im Immobilisierungspuffer enthaltene Glycerin soll zum einen die Stabilität der Proteine während der Verarbeitung gewährleisten und zum anderen die Viskosität der Lösung erhöhen, damit gleichmäßige und scharf begrenzte Spots erzielt werden und außerdem der Spot-Durchmesser relativ klein gehalten werden kann.

Protein-Protein Interaktionen

Abb. 2.2.1 Die rekombinanten GST-SH2 Domänen sind funktionell. (A) Die angegebenen rekombinanten GST-SH2 Domänen wurden mit Ganzzelllysaten von HEK293T Zellen, in denen GFP (als Kontrollprotein) oder GFP-fusioniertes CEACAM3 in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimiert wurde, inkubiert. Das Präzipitat wurde mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper auf den Gehalt von CEACAM3-GFP (obere Reihe) untersucht. Der Einsatz von gleichen Mengen an GST-Fusionsproteinen oder GST allein wurde mittels Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft. (B) Die für das pull-down Experiment verwendeten Ganzzelllysate wurden durch Western Blot Analyse hinsichtlich Phosphorylierung und gleichmäßiger Expression von CEACAM3-GFP überprüft.

Zunächst wurde die optimale Proteinkonzentration für die Generierung gleichmäßiger Spots ermittelt. Hierzu wurde jeweils ein konstantes Volumen (7,5 nl pro Spot) einer Proteinlösung mit steigender Proteinkonzentration in Triplikaten gedruckt. Zur Detektion der immobilisierten Proteine wurde der Array nach dem Blockieren der freien Aldehydgruppen (dieses Verfahren wird im nachfolgenden Kapitel 2.2.2 beschrieben) mit monoklonalem anti-GST Primärantikörper und anschließend mit einem fluoreszenzmarkierten (Cy3) Sekundär-antikörper inkubiert. Die dadurch fluoreszenzmarkierten Spots wurden mittels eines Mikroarray-Scanners (LS400 Reloaded, Fa. Tecan) detektiert.

Abb. 2.2.2 Bestimmung der optimalen Proteinkonzentration zur Generierung gleichmäßiger Spots. (A) Unterschiedliche Proteinmengen von GST, GST-Src-SH2 oder GST-Slp76-SH2 Domänen wurden in dreifacher Ausführung als punktförmige Muster immobilisiert. Die Detektion der immobilisierten Proteine erfolgte mittels eines monoklonalen anti-GST Primärantikörpers, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper. Die Fluoreszenzsignale der einzelnen Spots wurden mittels eines Mikroarray-Scanners detektiert. (B) Grafische Darstellung der unter (A) ermittelten Fluoreszenzsignale. Die Nettosignalintensität ergibt sich aus Subtraktion des unspezifischen Hintergrunds vom gemessenen Fluoreszenzsignal. Dargestellt sind die Mittelwerte

±Standardfehler des Mittelwerts von Triplikaten.

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Die konzentrationsabhängigen Fluoreszenzsignale der gedruckten Proteine sind in Ab-bildung 2.2.2 dargestellt. Die maximale Fluoreszenzintensität ist ab einer Proteinkonzen-tration von 1,0 ng/spot erreicht (Abb. 2.2.2B). Bis zu einer Proteinmenge von 1,6 ng/spot wurden distinkte Spots erzielt (Abb. 2.2.2A). Somit konnte die optimale Proteinkonzentration für den Druckvorgang auf einen Bereich von 1,0–1,6 ng/spot eingegrenzt werden. Für alle nachfolgenden Experimente wurde eine Proteinkonzentration von 1,3 ng/spot verwendet. Pro Versuchsdurchführung wurde eine individuelle Anordnung (Array) verschiedener GST-SH2 Domänen in mehrfacher Ausführung auf eine Aldehydoberfläche gedruckt. Die in Abbildung 2.2.2A gezeigte Anordnung der Proteine ist ein Beispiel für einen solchen Array.

Jeweils 16 solcher Arrays konnten auf einem Standard-Glasobjektträger aufgebracht und separat beprobt werden. Um die erfolgreiche Immobilisierung der GST-SH2 Domänen nachweisen zu können, wurde bei jeder Versuchsdurchführung ein Array nach dem Blockieren der freien Aldehydgruppen nicht mit phosphorylierter Probe, sondern mit anti-GST Primärantikörper und anschließend mit fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper inkubiert. Dieser Array wurde auch dazu verwendet, die relativen Mengen an immobilisierten GST-SH2 Domänen über die Fluoreszensintensität der Spots zu ermitteln. Allerdings ist diese Art der Mengenermittlung nur indirekt über die Fluoreszenzintensität der einzelnen Spots möglich, da die Anzahl der Aldehydgruppen pro Fläche, laut Herstellerangaben, unbekannt ist. Dennoch können die Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Spots dazu verwendet werden, die immobilisierten Mengen der unterschiedlichen GST-SH2 Domänen untereinander anzugleichen. Dies ermöglicht somit das Normalisieren der detektierten Phosphotyrosin-abhängigen Bindungssignale auf die Menge an immobilisierten SH2 Domänen innerhalb eines Arrays.

2.2.2 Blockierung und Beprobung von SH2 Domänen Arrays

Die Bildung der ‚Schiff’schen Basen’ zwischen Amino- und Aldehydgruppen erfolgt spontan ohne Energiezufuhr oder Katalysatoren. Somit war es unumgänglich vor der Beprobung der Arrays die noch freien Aldehydgruppen der Oberfläche abzusättigen, um unspezifische Bindungen des zu untersuchenden Protein Interaktionspartners an noch vorhandene freie Aldehydgruppen zu verhindern. Hierzu wurde eine 1%ige BSA-Lösung in PBS verwendet, die noch zusätzlich mit Ethanolamin (Endkonzentration 0,2 M) angereichert war. Die anschließende Beprobung des Arrays erfolgte als erstes mit rekombinanten, in vitro phos-phorylierten Proteinen.

Protein-Protein Interaktionen

Abb. 2.2.3 Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit dem fluoreszenzmarkierten und in vitro phosphorylierten zytoplasmatischen Abschnitt von CEACAM3. (A) Rekombinantes, fluoreszenzmarkiertes CEACAM3zyto wurde mittels rekombinatem v-Src in vitro phosphoryliert und via Western Blot unter Verwendung eines monoklonalen anti-pTyr Antikörpers auf erfolgreiche Phosphorylierung überprüft (obere Reihe). Unter Einsatz eines monoklonalen anti-GST Antikörpers wurden die Phosphorylierungsansätze auf den gleichen Gehalt von GST-CEACAM3zyto überprüft (untere Reihe). (B) Zehn verschiedene GST-SH2 Domänenkonstrukte oder GST allein wurden in sechsfacher Ausführung, mit einer Proteinkonzentration von 1,3 ng/spot, auf einer aldehydbeschichteten Oberfläche immobilisiert. Die erfolgreiche Immobilisierung der GST-Proteine wurde mittels monoklonalem anti-GST Primärantikörper, gefolgt von einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper überprüft (vgl. auch (C) linke Spalte unten). (C) Auf zwei aldehydbeschichteten Objektträgern wurden jeweils acht identische Arrays aufgebracht (linke Spalte unten, weiß umrandet; unter (B) beschrieben). Im Folgenden wurden jeweils zwei Arrays mit unterschiedlichen Konzentrationen des unter (A) beschriebenen in vitro phosphorylierten GST-CEACAM3zyto beprobt. Als Negativkontrolle wurden zwei Arrays mit unphosphoryliertem GST-CEACAM3zyto inkubiert (linke Spalten, oben). Um eine Autofluoreszenz der immobilisierten GST-SH2 Domänen auszuschließen, blieben zwei Arrays unbeprobt (rechte Spalte unten).

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Hierzu wurde zunächst der zytoplasmatische Abschnitt des humanen Oberflächenrezeptors CEACAM3 als GST-Fusionsprotein (CEACAM3zyto) hergestellt und mit dem Fluoreszenz-farbstoff Rhodamin markiert. Anschließend wurden verschiedene Konzentrationen von CEACAM3zyto mittels gereinigter Src-Kinase in vitro phosphoryliert. Die Phosphorylierung wurde mittels Western Blot überprüft (Abb. 2.2.3A). Die zur Beprobung verwendeten Arrays umfassten zunächst lediglich ein kleines Repertoire von zehn verschiedenen GST-SH2 Konstrukten sowie GST und PBS als Negativkontrollen. Auf zwei aldehydbeschichtete Objektträger wurden jeweils acht identische Arrays gedruckt. Ein Array umfasste dabei die zur Untersuchung herangezogenen GST-SH2 Domänen sowie die GST- und PBS-Kontrollen in sechsfacher Ausführung (Abb. 2.2.3B). Die erfolgreiche Immobilisierung der GST-SH2 Domänen wurde durch anti-GST Primärantikörper, wie im Abschnitt 2.2.1 beschrieben, überprüft (Abb. 2.2.3B). Es wurden jeweils zwei Arrays mit einer definierten Konzentration des in vitro phosphorylierten CEACAM3zyto (pCEACAM3zyto) inkubiert (Abb. 2.2.3C). Die Beprobung erfolgte automatisiert mit Hilfe einer Mikroarray-Hybridisierstation (HS 400 Pro^TM, Fa. Tecan). Nach der Beprobung wurden beide Objektträger mit derselben elektronischen Nachverstärkung des Messsignals ausgelesen. Für die Arrays, welche mit unphosphoryliertem CEACAM3zyto beprobt wurden sowie für die unbeprobten Arrays waren keine Bindungssignale detektierbar (Abb. 2.2.3C). Somit kann ausgeschlossen werden, dass GST-CEACAM3zyto phosphorylierungsunabhängig mit den GST-SH2 Domänen interagiert bzw. die immobilisierten GST-SH2 Domänen durch Autofluoreszenz falsch positive Bin-dungssignale liefern.

Die Nettosignalintensitäten der Bindungen an die N-terminale und die Tandem (NC)-SH2 Domäne der regulatorischen Untereinheit p85 der Phosphatidylinositol-3’-Kinase (PI3KR1) sind bei allen vier pCEACAM3zyto Konzentrationen gleich (Abb. 2.2.4A). Dies lässt darauf schließen, dass diese GST-SH2 Domänen bereits ab einer Konzentration von 1,57 µg mit pCEACAM3zyto abgesättigt sind. Betrachtet man allerdings die einzelnen Signalintensitäten im Verhältnis zum unspezifischen Hintergrund des Arrays, so ist dieses Verhältnis umso größer, je weniger pCEACAM3zyto zur Beprobung des Arrays verwendet wird (Abb. 2.2.4B).

Die ausschließliche Bindung von pCEACAM3zyto an die GST-SH2 Domänen PI3KR1-N- und PI3KR1-NC legte die Vermutung nahe, dass möglicherweise noch andere Faktoren (Inkubationsdauer, Inkubationstemperatur und/oder „molecular crowding“ Effekte) für die Interaktion mit anderen SH2 Domänen wichtig sein könnten. Dies wurde überprüft, indem in einem ersten Versuchsdurchlauf die Inkubationsdauer mit pCEACAM3 von 1 h bis auf 4 h

Protein-Protein Interaktionen

erhöht wurde. Als diese Änderung in der Versuchsdurchführung keinen Effekt zeigte, wurde die Inkubationstemperatur schrittweise von 20 °C über 25 °C bis auf 30 °C angehoben.

Allerdings führte auch diese Modifikation in der Beprobung zu keiner Änderung der Ergebnisse.

Abb. 2.2.4 Grafische Darstellung der Fluoreszenzsignale, die durch die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit unterschiedlichen Konzentrationen von in vitro phosphoryliertem GST-CEACAM3zyto

ermittelt wurden. (A) Grafische Darstellung der phosphorylierungsabhängigen Bindung von GST-CEACAM3zyto an die immobilisierten GST-SH2 Domänen nach Abzug des unspezifischen Hintergrundsignals.

Die Grafik zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von Sechsfachbestimmungen. (B) Grafische Darstellung der Verhältnisse Fluoreszenzsignal der Spots zu unspezifischem Hintergrundfluoreszenzsignal. Die Grafik zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen von Sechsfachbestimmungen.

Dies gilt ebenfalls für den Versuch, einen „molecular crowding“ Effekt in der Beprobungslösung zu erzeugen. Hierfür wurden der Lösung von pCEACAM3zyto

verschiedene Konzentrationen (0,5 %, 1 % bzw. 1,5 %) BSA zugesetzt. Unabhängig von den verschiedentlich variierten Inkubationsparametern blieb es bei der ausschließlichen Bindung von pCEACAM3zyto an PI3KR1-N- und -NC-SH2. Ebenso erfolglos blieben auch die Versuche, den relativ starken Hintergrund durch Variation der Beprobungs- und Wasch-parameter zu verringern. Dies legte die Vermutung nahe, dass möglicherweise freier Fluoreszenzfarbstoff aus der Beprobungslösung an immobilisiertes BSA (welches zum

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Blockieren verwendet wurde) gebunden hatte. Eine weitere Möglichkeit ist, dass sich bei der Beprobung überschüssiges pCEACAM3zyto unspezifisch auf der Oberfläche ablagerte und durch die Waschschritte nicht effizient genug entfernt wurde.

Aufgrund der Tatsache, dass die Beprobung des SH2 Domänen Arrays mit rekombinantem pCEACAM3zyto, hinsichtlich der Detektion von Bindungssignalen, nur mäßig erfolgreich war, wurde das System modifiziert. Durch die Verwendung von Ganzzelllysaten zur Beprobung wurde der Versuchsaufbau dahingehend verändert, dass es ähnlich einem pull-down Experiment auch den Einfluss zellulärer Proteine auf die Interaktion berücksichtigt. Durch diese Modifikation der Beprobung ist es zwar nicht mehr möglich, ausschließlich direkte Interaktionen zwischen den SH2 Domänen und dem zu untersuchenden tyrosinphos-phorylierten Protein nachzuweisen, es können aber dennoch Aussagen über eine indirekte Assoziation zwischen beiden Proteinen getroffen werden. Der hier angestrebte Versuchsaufbau ist im Hinblick auf Versuchsdurchführung und –dauer wesentlich unkomplizierter, als die bisher zu Interaktionsstudien verwendeten pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitationen. Des Weiteren können sehr viel mehr SH2 Domänen auf ihre Interaktion mit einem tyrosinphosphorylierten Protein untersucht werden als es im Maßstab eines pull-down Experimentes oder einer Koimmunpräzipitation möglich wäre.

Die im weiteren Versuchsaufbau zur Beprobung verwendeten Ganzzelllysate enthielten CEACAM3 und v-Src. Beides wurde zuvor in HEK293T Zellen koexprimiert. CEACAM3 wurde als GFP-Fusionsprotein mit zusätzlicher Hämagglutininepitop (HA)-Markierung (CEACAM3-HA-GFP) exprimiert. Die GFP-Fusion ermöglichte es, die verschiedenen Lysate auf den gleichen Gehalt an CEACAM3 einzustellen. Das Angleichen der einzelnen Lysate erfolgte dabei durch Auslesen der GFP-Fluoreszenz mittels des Varioskan Flash (Firma Thermo Scientific). Zusätzlich zur GFP-Fusion besaß CEACAM3 noch eine Peptidsequenz

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