Grb14 interagiert über seine SH2 Domäne direkt mit

Die in Kapitel 2.2.2. beschriebene Assoziation von phosphoryliertem CEACAM3 mit der SH2 Domäne von Grb14 sollte im Folgenden biochemisch verifiziert werden. Mittels des SH2 Domänen Arrays wurde lediglich das Mitglied Grb14 der Grb7/10/14-Familie auf Interaktion mit CEACAM3 untersucht. Aus diesem Grund sollten auch die beiden anderen Mitglieder dieser Proteinfamilie auf Interaktionen mit CEACAM3 untersucht werden. Hierfür wurden die GST-fusionierten SH2 Domänen von Grb7, Grb10 und Grb14 an GSH-Sepharose gebunden und anschließend in einem pull-down Experiment mit Zelllysaten, die entweder phosphoryliertes oder unphosphoryliertes CEACAM3 enthielten, verwendet. Zur Herstellung der Zelllysate wurden HEK293T Zellen mit einem v-Src-kodierenden Plasmid und einem Kontrollplasmid (GFP) oder einem CECAM3-GFP-kodierenden Plasmid kotransfiziert und nach 48 Stunden lysiert. Die Lysate wurden auf den Gehalt gleicher Mengen von GFP und CEACAM3-GFP sowie hinsichtlich der Tyrosinphosphorylierung von CEACAM3-GFP mittels Western Blot überprüft (Abb 3.2.2A). Es wurden jeweils gleiche Mengen an GST oder GST-SH2 Domänen von Grb7, Grb10 und Grb14 sowie PI3KR3-N und Slp76, gekoppelt an GSH-Sepharose, mit phosphoryliertem oder unphosphoryliertem CEACAM3 Lysat inkubiert (Abb. 3.2.2B Coomassie-Färbung). Die Ansätze mit der PI3KR3-N-SH2 Domäne dienten dabei als Positiv-, die mit der Slp76-SH2 Domäne als Negativkontrolle. Der lediglich GST

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

enthaltende Ansatz diente als weitere Negativkontrolle, um eine Interaktion von CEACAM3 mit dem GST-Fusionsprotein auszuschließen. Wie erwartet, präzipitiert die rekombinante GST-fusionierte PI3KR3-N-SH2 Domäne phosphoryliertes CEACAM3 aus dem Ganzzelllysat (Abb. 3.2.2B). Dies ist übereinstimmend mit früheren Beobachtungen, welche sowohl Kolokalisation als auch direkte Interaktion der PI3KR3-N-SH2 Domäne mit tyrosinphosphoryliertem CEACAM3 zeigten (vgl. Kapitel 3.1 sowie (Buntru et al. 2011)).

Abb. 3.2.2 Die SH2 Domänen der Grb7/10/14-Familienmitglieder assozzieren mit tyrosin-phosphoryliertem CEACAM3. (A) In HEK293T Zellen wurden GFP (als Kontrollprotein) oder GFP-fusioniertes CEACAM3 in An- oder Abwesenheit von v-Src exprimiert. Die Zellen wurden nach 2 Tagen lysiert und durch Western Blot hinsichtlich Tyrosinphosphorylierung und gleichmäßiger CEACAM3-Expression überprüft. (B) Die Ganzzelllysate wurden für ein pull-down Experiment mit den angegebenen GST-SH2 Domänen oder GST allein verwendet. Die präzipitierten CEACAM3-Varianten wurden mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper (obere Reihe) nachgewiesen. Die Verwendung von gleichen Mengen an GST-Fusionsproteinen oder GST allein wurde durch Coomassie-Färbung der Membran (untere Reihe) überprüft.

Auch die SH2 Domänen aller drei Mitglieder der Grb7/10/14-Familie sind fähig, phosphoryliertes CEACAM3 aus dem Lysat zu präzipitieren (Abb. 3.2.2B). Betrachtet man die Mengen an präzipitiertem CEACAM3, sind deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen SH2 Domänen zu erkennen. Während die SH2 Domäne von Grb7 nur in sehr geringem Maß mit CEACAM3 assoziiert, präzipitieren die strukturell ähnlicheren SH2 Domänen von Grb10 und Grb14 (Scharf et al. 2004) phosphoryliertes CEACAM3 wesentlich stärker. Jedoch sind auch bei diesen beiden SH2 Domänen noch Unterschiede in der Menge des präzipitieren CEACAM3 zu erkennen. Die Grb14-SH2 Domäne interagiert, verglichen mit den SH2 Domänen von Grb7 und Grb10, am stärksten mit phosphoryliertem CEACAM3.

Im Gegensatz dazu können weder GST noch die SH2 Domäne von Slp76 das phosphorylierte CEACAM3 aus dem Lysat präzipitieren (Abb. 3.2.2B).

Um zu überprüfen, ob diese phosphorylierungsabhängige Interaktion auch dann noch stattfindet, wenn beide Proteine in voller Länge vorliegen, wurde eine Koimmunpräzipitation

durchgeführt. Hierfür wurden GFP-Grb14 und CEACAM3-HA-mKate in Anwesenheit von v-Src in HEK293T Zellen koexprimiert. Die Zellen wurden lysiert und mittels Western Blot auf gleichmäßige Proteinexpression überprüft (Abb. 3.2.3A). Für die Koimmunpräzipitation wurde das in den Lysaten enthaltene CEACAM3-HA-mKate mittels eines polyklonalen anti-mKate Antikörpers präzipitiert. Im Anschluss wurden die Präzipitate durch Western Blot Analyse unter Verwendung eines monoklonalen anti-GFP Antikörpers auf den Gehalt an GFP-Grb14 überprüft (Abb. 3.2.3B). Es ist deutlich zu erkennen, dass GFP-Grb14 durch CEACAM3-HA-mKate kopräzipitiert wird. Diese Interaktion ist spezifisch, da GFP-Grb14 nicht unspezifisch durch mKate alleine aus dem Lysat herausgezogen wird (Abb. 3.2.3B).

Abb. 3.2.3 Das Grb14 Protein interagiert mit phosphoryliertem CEACAM3. (A) In HEK293T Zellen wurden konstitutiv aktives virales Src (v-Src) zusammen mit CEACAM3-HA-mKate in An- oder Abwesenheit von GFP-Grb14 koexprimiert. Die Zellen wurden nach 2 Tagen lysiert und hinsichtlich gleichmässiger Proteinexpression und Tyrosinphosphorylierung untersucht. (B) Die Zelllysate wurden mit polyklonalem anti-mKate Antikörper inkubiert, um das enthaltene CEACAM3-HA-anti-mKate zu präzipitieren. Die Analyse der Präzipitate auf den Gehalt an GFP-Grb14 erfolgte mittels monoklonalem anti-GFP Antikörper (obere Reihe).

Zur Überprüfung der Präzipitate auf den gleichmäßigen Gehalt von CEACAM3-HA-mKate wurde ein monoklonaler anti-HA Antikörper verwendet (untere Reihe).

Die Ergebnisse des SH2 Domänen Arrays, des pull-down Experiments und der Koimmunpräzipitation zeigen, dass Grb14 über seine SH2 Domäne mit phosphoryliertem CEACAM3 interagiert kann. In seinem zytoplasmatischen Abschnitt besitzt CEACAM3 zwei phosphorylierbare Tyrosinreste (Tyr²³⁰ und Tyr²⁴¹), die in eine ITAM-ähnliche Sequenz ein-gebettet sind. Diese Tyrosine wurden schon früher als essentiell für die phagozytische Funktion von CEACAM3 beschrieben. In diesem Zusammenhang wurde das phosphorylierte Tyr²³⁰ als Bindemotiv für verschiedene Signalproteine mit SH2 Domänen beschrieben. Diese Signalproteine sind entscheidend am Prozess der CEACAM3-vermittelten Phagozytose von Pathogenen beteiligt (Schmitter et al. 2004; Schmitter et al. 2007a; Schmitter et al. 2007b).

Unter Verwendung eines semi-synthetischen Versuchsaufbaus sollte herausgefunden werden, ob auch die Assoziation von phosphoryliertem CEACAM3 mit der SH2 Domäne von Grb14 auf einen dieser beiden Tyrosinreste zurückzuführen ist. Da dieses Experiment in

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

Abwesenheit sämtlicher zellulärer Komponenten erfolgt, können somit auch Rückschlüsse gezogen werden, ob diese Interaktion direkter Natur ist. In einem ersten Schritt wurden Peptide der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 als einzelne Punkte auf einer Zellulosemembran synthetisiert (Frank 1992). Die Peptide enthielten jeweils einen der beiden Tyrosinreste (Tyr²³⁰ bzw. Tyr²⁴¹) sowie die jeweils sieben Aminosäuren, welche das Tyrosin N- und C-terminal umgeben. Die Tyrosine wurden sowohl in phosphorylierter (pY) als auch in unphosphorylierter (Y) Form synthetisiert (Abb. 3.2.4).

Im zweiten Schritt wurden die freien Proteinbindestellen der Zellulosemembran durch eine Casein-haltige Lösung blockiert. Anschließend erfolgte die Beprobung der Zellulosemembran mit der rekombinanten, GST-fusionierten SH2 Domäne von Grb14. Als Negativkontrolle diente eine Membran, welche lediglich mit GST inkubiert wurde. Die GST-Grb14-SH2 Domäne band selektiv an das phosphorylierte Tyr²³⁰, nicht aber an das phosphorylierte Tyr²⁴¹ oder eines der unphosphorylierten Tyrosine von CEACAM3 (Abb. 3.2.4).

Abb. 3.2.4 Die SH2 Domäne von Grb14 bindet direkt an das phosphorylierte Tyr²³⁰ der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Membranen, auf denen phosphorylierte (pY) und unphosphorylierte (Y) synthetische Peptide der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 immobilisiert waren, wurden mit der GST-fusionierten SH2 Domäne von Grb14 oder GST allein inkubiert. Die gebundenen GST-Fusionsproteine wurden mittels monoklonalem anti-GST Antikörper detektiert.

Auch für das Kontrollprotein GST konnte keine Bindung an die Peptide festgestellt werden.

Dieses Ergebnis demonstriert, dass die Interaktion zwischen CEACAM3 und der SH2 Domäne von Grb14 spezifisch durch den phosphorylierten Tyrosinrest Tyr²³⁰ vermittelt wird.

Gleichzeitig konnte auch gezeigt werden, dass diese Interaktion unabhängig von anderen zellulären Komponenten stattfinden kann und somit direkter Natur ist.