Grb14 ist ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten

Um zu überprüfen, ob Grb14 bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose von Gonokokken eine Rolle spielt, wurden stabil transfizierte, CEACAM3-exprimierende HeLa Zellen (HeLa-CEACAM3) verwendet. In Bezug auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA -exprimierenden Gonokokken und der Phosphorylierung der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3 verhalten sich diese Zellen wie Granulozyten (Billker et al. 2002; McCaw et al.

2003). In diesen Zellen sollte mittels der short hairpin RNA (shRNA)-Technik die Expression von endogenem Grb14 dauerhaft unterdrückt werden. Für die Reduktion der Genexpression von Grb14 (Grb14 knock down; Grb14-kd) in HeLa-CEACAM3 Zellen wurde ein Lentivirus-basiertes System verwendet. Hierfür wurden Viruspartikel produziert, welche einen lentiviralen Vektor (pLKO.1) enthielten, der die spezifsche shRNA für Grb14 (shRNA-Grb14) kodierte. Desweiteren wurden Virenpartikel hergestellt, welche lediglich den leeren Vektor pLKO.1 (Leervektor) enthielten, dieser diente als Kontrolle. Die HeLa-CEACAM3 Zellen wurden mit Virenpartikeln transduziert, die entweder die Grb14 shRNA oder den Leervektor enthielten. Anschließend erfolgte die Selektion der transduzierten Zellen mittels 1,0 µg/ml Puromycin. Die Funktionalität der transduzierten shRNA gegen Grb14 wurde im Western Blot unter Verwendung eines polyklonalen anti-Grb14 Antikörpers analysiert

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

(Abb. 3.2.7A). Die Expression der shRNA gegen Grb14 bewirkte eine fast vollständige Unterdrückung der Expression von endogenem Grb14. Im Vergleich dazu zeigten die Zellen, welche mit dem Leervektor transduziert waren, keine Veränderung in der Grb14-Expression.

Abb. 3.2.7 Die Unterdrückung der Expression von endogenem Grb14 resultiert in einer erhöhten CEACAM3-vermittelten Phagozytose von Bakterien. (A) Western Blot Analysen der stabil transduzierten HeLa-CEACAM3 Zellen hinsichtlich Grb14 und CEACAM3 Expression mittels polyklonalem anti-Grb14 und monoklonalem anti-CEACAM (CD66 Klon D14HD11) Antikörper. Zur Überprüfung, dass für die Western Blot Analyse gleiche Mengen an Zelllysat verwendet wurden, wurde eine Membran mit monoklonalem anti-Tubulin Antikörper beprobt. (B) Wildtyp HeLa Zellen, HeLa-CEACAM3 Zellen untransduziert oder stabil transduziert mit Leervektor oder shRNA für Grb14, wurden mit CSFE-markierten Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae infiziert (MOI = 20). Nach 60min wurde die Phagozytoserate der Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Hierfür wurde die Fluoreszenz der extrazellulären, adhärierten Bakterien durch Zugabe von Trypanblau gequencht. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen von vier unabhängigen Experimenten.

Die HeLa-CEACAM3 Zellen mit unterdrückter Grb14 Expression wurden, nach 60minütiger Infektion mit CSFE-markierten, Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae, hinsichtlich ihres Phagozytoseverhaltens mittels Durchflusszytometrie (FACS-Invasions Assay) unter-sucht (Abb. 3.2.7B). Als Vergleichsproben dienten HeLa-CEACAM3 Zellen ohne unterdrückte Grb14-Expression. Im Vergleich zu den wildtypischen und den mit Leervektor transduzieren HeLa-CEACAM3 Zellen zeigten Zellen mit unterdrückter Grb14-Expression eine um ca. 30 % erhöhte Phagozytoserate (Abb. 3.2.7B).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Grb14 ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose ist. Um dies zu bestätigen, müsste die Überexpression von Grb14 einen inhibitorischen Effekt auf die Aufnahme der Bakterien haben. Aus diesem Grund wurden CEACAM3 und Grb14 gemeinsam in HEK293T Zellen koexprimiert und im Anschluß das Phagozytoseverhalten dieser Zellen untersucht. Als Vergleichsprobe dienten HEK293T Zellen, welche lediglich CEACAM3 exprimierten. Nach 60minütiger Infektion mit CSFE-markierten Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae wurde die Anzahl der

internalisierten Bakterien mittels Durchflusszytometrie (FACS-Invasions Assay) bestimmt.

Zellen, die CEACAM3 und Grb14 koexprimieren, zeigten im Vergleich zu den Zellen, welche lediglich CEACAM3 exprimierten eine um 30 % reduzierte Phagozytoserate (Abb. 3.2.8A).

Abb. 3.2.8 Die Überexpression von Grb14 hat inhibierenden Einfluss auf die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von Bakterien. (A) In HEK293T Zellen wurden Cerulean und mKate, CEACAM3-Cerulean und mKate oder CEACAM3-Cerulean und mKate-Grb14 koeexprimiert. Jeweils gleiche Zellzahlen wurden mit CSFE-markierten Opa52-exprimierenden Neisseria gonorrhoeae infiziert (MOI = 20). Nach einer Infektionszeit von 60min wurden die Phagozytoseraten der Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Hierfür wurde die Fluoreszenz der extrazellulären, adhärierten Bakterien durch Zugabe von Trypanblau gequencht. Die Grafik zeigt die Mittelwerte ±Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen von drei unabhängigen Experimenten. (B) Ein Teil der in (A) verwendeten Zellen wurde lysiert und mittels Western Blot Analyse hinsichtlich gleichmäßiger Expression von Cerulean bzw. CEACAM3-Cerulean sowie mKate bzw. mKate-Grb14 überprüft. Hierzu wurden monoklonaler anti-GFP Primärantikörper (Nachweis von Cerulean) und polyklonaler anti-mKate Primärantikörper (Nachweis von mKate) verwendet. Zur Überprüfung, dass für die Western Blot Analyse gleiche Mengen an Zelllysat verwendet wurden, wurde eine Membran mit monoklonalem anti-Tubulin Antikörper beprobt. (C) Ein Teil der in (A) verwendeten Zellen blieb uninfiziert und wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von monoklonalem anti-CEACAM (CD66acde Klon IH4Fc) Primärantikörper und Cy2-markierten Sekundärantikörper auf die Lokalisation von CEACAM3 auf der Zelloberfläche überprüft. Repräsentative Darstellung einer durchflusszytometrischen Messung. Zwei weitere Messungen erzielten gleichwertige Ergebnisse.

Dass Unterschied in der Phagozytoserate nicht auf eine ungleichmäßige CEACAM3-Expression oder -Lokalisation auf der Zelloberfläche zurückzuführen ist, ist aus Abbildung 3.2.8B und C zu erkennen. In beiden Zellpopulationen wurde CEACAM3 in

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

gleichen Mengen exprimiert (Abb. 3.2.8B) und konnte in gleichem Maße auf der Zellober-fläche beider Populationen nachgewiesen werden (Abb. 3.2.8C).

Dieses Ergebnis des FACS-Invasions Assays stützt die zuvor aufgestellte These, dass Grb14 ein Negativregulator der CEACAM3-vermittelten Phagozytose ist.

3.2.3 Diskussion

Im Zuge der Etablierung des SH2 Domänen Arrays konnte die bisher unbekannte phosphorylierungsabhängige Interaktion zwischen dem humanen phagozytischen Rezeptor CEACAM3 und dem SH2 Domänen tragenden Signalprotein Grb14 identifiziert werden. Die Funktionsweise von CEACAM3 zur effektiven Eliminierung von humanen Pathogenen beruht auf den signalgebenden Prozessen der Tyrosinphosphorylierung von Proteinen. Der Rezeptor selbst wird, durch die initiale Bindung von Pathogenen, von Mitgliedern der Src-Kinasenfamilie tyrosinphosphoryliert. Diese Phosphotyrosine dienen als Bindemotive für die SH2 Domänen von nachgeschalteten Effektorproteinen. So konnten bisher für den Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav und die Phosphatidylinositol-3’-Kinase Klasse I eine direkte Bindung an tyrosinphosphoryliertes CEACAM3 nachgewiesen werden. Auch die Mitglieder der Grb7/10/14-Familie sind bekannt für ihre direkte Interaktion mit tyrosinphosphorylierten Rezeptoren. Ursprünglich wurden alle Mitglieder dieser Familie durch ihre Bindung an autophosphorylierte epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFRs) entdeckt. Kurze Zeit später wurden weitere, SH2 Domänen-abhängige Interaktionen dieser Proteine mit tyrosinphosphorylierten Rezeptoren und Proteintyrosinkinasen identifiziert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass nach Stimulation der Rezeptoren durch externe Liganden die Grb7/10/14-Familienmitglieder an die aktivierten Rezeptoren binden.

In der vorliegenden Arbeit konnte auch für den tyrosinphosphorylierten phagozytischen Rezeptor CEACAM3, unter Verwendung des SH2 Domänen Arrays, die Interaktion mit der SH2 Domäne von Grb14 nachgewiesen werden. Diese Interaktion konnte mittels eines pull-down Experimentes sowie einer Koimmunpräzipitation verifiziert und durch einen semi-synthetischen Versuchsaufbau auf das phosphorylierte Tyr²³⁰ eingegrenzt werden. Des Weiteren konnte durch das pull-down Experiment gezeigt werden, dass die SH2 Domäne von Grb14 eine höhere Affinität für phosphoryliertes CEACM3 aufweist, als die SH2 Domänen von Grb7 und Grb10. Um diese Ergebnisse zu untermauern und näher zu beleuchten, wäre es interessant, auch tyrosinmutierte Varianten von CEACAM3 auf Interaktion mit Grb7, Grb10

und Grb14 zu untersuchen. Hierzu könnten sowohl die isolierten SH2 Domänen als auch die vollständigen Proteine für pull-down Experimente oder Koimmunpräzipitationen herangezogen werden. Neben diesen biochemischen Untersuchungen konnten auch erste Hinweise auf die Assoziation von CEACAM3 und Grb14 während des Infektionsprozesses festgestellt werden. Konfokalmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass Grb14 innerhalb der Zelle spezifisch an die Stellen rekrutiert wird, an denen CEACAM3 mit Opa52 -exprimierenden Gonokokken interagiert. Da dieser Effekt auch bereits für andere Signalproteine, die bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose und Abtötung von Bakterien eine Rolle spielen, festgestellt wurde (Schmitter et al. 2007a; Buntru et al. 2011), liegt die Vermutung nahe, dass Grb14 durch direkte Interaktion mit dem Rezeptor am CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess beteiligt ist. In diesem Zusammenhang stellen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers (FRET)-basierte Interaktionsstudien eine gute Möglichkeit dar, um eine direkte Interaktion beider Proteine während des Infektionsprozesses zu untersuchen. Als ein wichtiger Punkt hinsichtlich einer möglichen physiologischen Relevanz der Interaktion zwischen CEACAM3 und Grb14 konnte die Expression von Grb14 in humanen Granulozyten auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang sind allerdings weitere Untersuchungsschritte wünschenswert, anhand derer die Expression auch auf Proteinebene nachgewiesen werden kann.

Die Untersuchung der Phagozytoserate von CEACAM3-HeLa Zellen mit unterdrückter Grb14 Expression zeigte eine um 30 % erhöhte Aufnahme von Bakterien. Dieses Ergebnis lässt eine negativ regulierende Rolle von Grb14 bei der CEACAM3-vermittelten Phagozytose vermuten. Gestützt wird diese Vermutung durch die Tatsache, dass die Überexpression von Grb14 einen inhibierenden Effekt auf die Aufnahme von Bakterien hatte. Da Grb14 als Negativregulator für verschiedene rezeptorvermittelte Signalprozesse bekannt ist, scheint solch ein negativ regulierender Einfluss von Grb14 auch für den CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess denkbar.

In den letzten Jahren wurden intensive Studien betrieben, anhand derer ein umfassendes Bild über die Rolle von Grb14 in rezeptorvermittelten Signalwegen gewonnen werden konnte. Für den Insulinrezeptor (IR) wurde gezeigt, dass Grb14 phosphorylierungsabhängig an den aktivierten Rezeptor rekrutiert wird und in der Folge durch Inhibierung der IR-Kinaseaktivität verschiedene Signalprozesse reguliert. In diesem Zusammenhang zeigten strukturelle und funktionelle Studien, dass Grb14 über seine SH2 Domäne direkt an die tyrosinphosphorylierte Aktivierungsschleife der IR-Kinasedomäne bindet (Depetris et al. 2005). Weiterhin konnte

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

gezeigt werden, dass Grb14 über seine RA Domäne mit der aktivierten GTPase Ras assoziiert und dass die PH Domäne an Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PI(3,4,5)P3) bindet.

Untersuchungen zur Rekrutierung von Grb14 an die Zellmembran zeigten, dass dieser Prozess unabhängig von der Aktivität der PI3K ist (Depetris et al. 2009). Durch Bestimmung der Dissoziationskonstanten für die PH und RA Domäne konnten Depetris et al. zeigen, dass Grb14 eine sehr viel höhere Affinität für aktiviertes Ras als für PI(3,4,5)P3 hat (Depetris et al.

2009). Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass die RA Domäne die Rekrutierung von Grb14 an die Zellmembran in die Nähe des Rezeptors vermittelt und in der Folge die Bindung an den Rezeptor durch die Grb14-SH2 Domäne möglich wird.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Grb14-SH2 Domäne direkt an tyrosinphosphoryliertes CEACAM3 bindet. Bisherige Untersuchungen zur CEACAM3-vermittelten Phagozytose zeigten, dass die Aktivität der PI3K für den Aufnahmeprozess keine Rolle spielt (Kapitel 3.1, und (Buntru et al. 2011)) und dass es während der Phagozytose zur verstärkten Aktivierung der kleinen GTPase Rac kommt (Hauck et al. 1998; Schmitter et al.

2004). Im Hinblick auf die Interaktion von Grb14 mit CEACAM3 wäre es in diesem Zusammenhang auch sehr interessant, zu überprüfen, ob die die Grb14-RA Domäne auch mit aktiviertem Rac interagieren kann und somit an der Translokation von Grb14 in die Nähe von CEACAM3 beteiligt ist. Dies könnte beispielsweise auf der Basis von Koimmun-präzipitationen oder pull-down Experimenten unter Verwendung von konstitutiv aktiviertem Rac analysiert werden.

Der negativ regulierende Effekt von Grb14 auf die Insulin-induzierten Signalprozesse wird der Grb14-BPS Domäne zu geschrieben. Es ist bekannt, dass die BPS Domäne als Pseudosubstrat in die Kinasedomäne des Insulinrezeptors bindet und somit die Phosphorylierung nachgeschalteter Effektorproteine verhindert, wodurch die Insulin-induzierte Signalweiterleitung beendet wird (Stein et al. 2001; Bereziat et al. 2002). Ein ähnlicher Effekt der Signalregulierung durch die BPS Domäne wäre auch für CEACAM3 denkbar. Zwar besitzt CEACAM3 keine eigene Kinasedomäne, jedoch wird es, als Folge der Bindung von Bakterien, durch membranassoziierte PTKs der Src-Familie phosphoryliert, wodurch der Phagozytoseprozess in Gang gesetzt wird. Es ist somit denkbar, dass die Bindung von Grb14 an phosphoryliertes CEACAM3 einen negativ regulierenden Einfluss auf die Aktivität der rezeptorassoziierten Src-Kinasen und somit auch auf den Phagozytoseprozess hat. Die erhöhte Phagozytoserate bei unterdrückter Grb14 Expression

Hinweise in diese Richtung sein. Die hierfür notwendige Interaktion der Grb14-BPS Domäne mit der Kinasedomäne von Src-Kinasen könnte durch Präzipitationsexperimente mit der isolierten BPS Domäne untersucht werden.

Desweiteren ist es interessant, zu überprüfen, ob Zellen mit unterdrückter Grb14-Expression während des Infektionsprozesses eine erhöhte Tyrosinphosphorylierung von CEACAM3 aufweisen. Dies könnte durch eine CEACAM3-spezifische Immunpräzipitation mit anschließender Western Blot Anlyse unter Verwendung eines anti-Phosphotyrosin Antikörpers analysiert werden. Davon ausgehend, dass für die Inhibierung der rezeptorassoziierten Src-Kinasen Grb14 direkt über seine SH2 Domäne an CEACAM3 binden muss, sollte die Deletion dieser Domäne den gleichen Effekt auf die Phagozytose haben wie die Unterdrückung der Expression des vollständigen Proteins. Auch in diesem Fall sollte eine erhöhte Phagozytoserate die Folge sein. In Bezug auf die Notwendigkeit einer Negativ-regulierung des CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozesses kann in diesem Zusammenhang nur spekuliert werden. So ist es beispielsweise denkbar, dass ein Gleich-gewicht hergestellt werden muss zwischen der Anzahl an internalisierten Bakterien und der enzymatischen Kapazität der NADPH-Oxidase. Zur Überprüfung dieser Theorie könnten Bakterien-Degradations Assays durchgeführt werden, welche den Abbau von Bakterien durch Granulozyten nachweisen. In diesem Fall sollten phagozytierte Bakterien in Zellen mit unterdrückter Grb14-Expression eine erhöhte Überlebensrate haben gegenüber Zellen mit normaler Grb14-Expression. Da sich humane Granulozyten schwer bis gar nicht genetisch manipulieren lassen, ist diese Untersuchung in diesem Zelltyp nicht durchführbar. Jedoch könnten sich Granulozyten, die kein Grb14 mehr aber humanes CEACAM3 exprimieren, im Mausmodell herstellen lassen. Die hierfür nötigen Mäuse könnten durch Kreuzung von Grb14^-/- Mäusen mit CEACAM3-transgenen Mäusen generiert werden.

Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse bestätigen die mittels SH2 Domänen Array gefundene Interaktion zwischen Grb14 und CEACAM3. Es konnte gezeigt werden, dass das Signalprotein Grb14 phosphorylierungsabhängig mit dem phagozytischen Rezeptor CEACAM3 interagiert und dass diese Interaktion direkter Natur ist. In Bezug auf die physiologische Relevanz dieser Interaktion gibt es erste Anhaltspunkte, dass Grb14 einen negativ regulierenden Einfluss auf den CEACAM3-vermittelten Phagozytoseprozess hat.

Jedoch sind diesbezüglich weitere Untersuchungen notwendig, um diese Theorie eingehender zu analysieren.

3 Beteiligung von Proteinen mit SH2 Domänen an CEACAM-vermittelten Signalwegen

3.3 Identifikation Phosphotyrosin-abhängiger Interaktionspartner für